枯草芽孢桿菌ds3的製作方法

2023-10-11 07:55:24

專利名稱：枯草芽孢桿菌ds3的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域,尤其涉及一種枯草芽孢桿菌(feci77w5· Subtilis)DS3。
背景技術：
皂素(如薯蕷皂素)生產廢水具有廢水量小、色度大、有機物濃度高、酸度大、溫度高等特點，可生化性差，是一種非常難處理的廢水。根據《皂素工業水汙染物排放標準》(GB20425-2006)中具體規定，自2009年起COD排放量應低於300mg/L。目前皂素水解原液COD濃度達到20000-40000mg/L，綜合廢水 COD濃度約為4000-12000mg/L。若直接排入水體，會導致水體的有機汙染物濃度大幅度增力口，由此引起江河湖泊嚴重汙染，不僅直接影響了人們的生存環境，也造成了國民經濟的巨大損失。皂素廢水中含有大量有機汙染物，其中部分毒性醛、酮、酚類物質對汙水處理系統裡汙泥中的微生物具有抑制作用，一般微生物不能正常生長。同時，皂素廢水中硫酸根濃度高，約為8000mg/L左右，在高鹽度廢水的生物處理系統中，由於鹽度的變化往往會破壞微生物的細胞膜和菌體內的酶，致使汙泥活性下降。同時，微生物對環境具有一定的適應能力，在一定鹽度範圍內微生物通過自身的滲透調節機制平衡細胞內的滲透壓或保護細胞內的原生質，調節自身新陳代謝以適用鹽度的變化。活性汙泥在含鹽環境中經過一段時間馴化後，將具有一定的耐鹽性。目前對皂素廢水的處理多採用物理或化學的方法，現有技術中還沒有微生物降解方法和用於降解皂素廢水有機汙染物的菌株的報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種枯草芽孢桿菌DS3，它能有效去除含有高濃度硫酸根離子的皂素廢水有機汙染物。本發明為解決上述技術問題所採取的技術方案為
枯草芽孢桿菌DS3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010146。枯草芽孢桿菌DS3的菌落形態為菌落呈白色或淡黃色、不透明、圓形、表面粗糙，中間有皺起、邊緣不整齊；需氧，革蘭氏陽性芽孢桿菌。最適生長PH值6. 5 7. 5，最適生長溫度25-35。。。與現有技術相比，本發明取得的有益效果是枯草芽孢桿菌DS3在高濃度硫酸根離子環境中具有較強的生長能力和良好的去除皂素廢水中有機汙染物的能力，該菌株能在72小時之內去除皂素廢水中的COD 2150mg/L，去除效率達到50. 71%。本發明為降解皂素廢水高濃度有機汙染物提供了有用的菌源，拓寬了對枯草芽孢桿菌功能方面的應用，具有較強的應用價值。


圖1為枯草芽孢桿菌DS3的PCR產物瓊脂糖電泳圖(左為Marker ;右為擴增產物)。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的描述，當然下述實施例不應理解為對本發明的限制。一、枯草芽孢桿菌DS3的篩選
(一)、材料準備1、實驗廢水和池底汙泥取自湖北省十堰市某黃姜皂素生產廠生產排放廢水的生化處理系統。2、培養基 篩選培養基3g/L牛肉膏，10g/L蛋白腖，5g/L氯化鈉，20g/L瓊脂，pH6. 8。富集培養基(g/L) 30g/L磷酸氫二鉀，100mg/L無水硫酸鎂，10g/L磷酸二氫鉀，10mg/L四水硫酸猛,5g/L硝酸銨，10mg/L七水硫酸亞鐵，lg/L硫酸鈉,5mg/L氯化|丐，冰箱保存。使用時，稀釋10倍，加入10%葡萄糖，pH值7. O 7. 2。LB液體培養基蛋白腖10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10. 0g/L，蒸餾水IOOOmL,ρΗ7·O。LB固體培養基蛋白腖10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水IOOOmL,瓊脂 15g/L (固)，ρΗ7· O。LB斜面培養基蛋白腖10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水IOOOmL,瓊脂 20g/L (固)，ρΗ7· O。3、實驗儀器和設備
國華SHA-B恆溫振蕩器，
東器SPX生化培養箱，
立式壓力蒸汽滅菌器，
光學顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH 計等-----sarporiusPD-10,
超淨工作檯，
PTC200 型 PCR 儀，
電泳儀及電泳槽，
UVP凝膠紫外觀測儀。(二)、菌株的篩選分離與純化1.篩選分離
1)稱取2克黃姜皂素生產廠廢水處理系統中酸化池尾區的池底汙泥樣品，加入事先滅菌好的裝有IOOmL無菌水的250mL的三角瓶內，30°C恆溫振蕩200rpm，將菌膠團打碎，得泥水混合物，備用；
2)將泥水混合物轉入裝有IOOmL篩選培養基的500mL錐形瓶中，30°C恆溫靜置培養至培養基渾濁，得到菌懸液A ;
3)取5mL菌懸液A於裝100 mL新鮮的篩選培養基的250 mL錐形瓶中培養一周；將培養一周後的菌懸液取5 mL於裝100 mL新鮮的篩選培養基的250 mL錐形瓶中培養一周，重複操作5-6次，最後得到的菌懸液B ；
2.用無菌移液管吸取O. 5mL上述菌懸液B，稀釋塗布於固體培養基上。37°C左右恆溫培養3d，挑取在菌落特徵上有明顯差異的單菌，在LB固體培養基上反覆劃線培養三次直至獲得單一菌株，並於LB斜面培養基上保存，得到一株菌株DS3，即枯草芽孢杆·菌DS3。二、枯草芽孢桿菌DS3的鑑定1、對枯草芽孢桿菌DS3的鑑定
對枯草芽孢桿菌DS3進行了生理生化的鑑定、16S rRNA分子的鑑定並結合Biolog微生物自動分析系統，從分子水平確定枯草芽孢桿菌DS3的種屬。16S rRNA序列分析主要按照以下步驟
I)細菌核DNA的提取
使用北京百泰克生物技術有限公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒。2) 16S rRNA 基因的 PCR 擴增
PCR 擴增引物參照 Weisburg 等人(Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A. 16Sribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J. Bacteriol, 1991,173: 697 - 703)的方法合成。P1:正向引物 5 』 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 』
P2 :反向引物 5』 GGTTACCTTGTTACGACTT3』
在50mL反應體積中，加入ImL模板DNA (O.1mg), O. 5mL Pl和P2 (終濃度為O. 5mM),ImLdNTP (每種 NTP0. 2 禮)，O. 5mLTaq 聚合酶(2 U)和 5 mL IOXPCR 緩衝液。PCR 擴增條件為:94°C預變性5 min ;在94°C變性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環30次;最後72 ° C終延伸10 min。3) PCR產物的回收
將PCR產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳後，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中加2倍體積TE，65°C水浴10分鐘後加等體積水飽和酚抽提一次離心後取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的lOmol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉澱，離心，用濃度為70%乙醇洗沉澱一次，風乾後溶於適量滅菌雙蒸水。4) 16S rDNA的全序列測定和分析
PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人(Hiraishi A, Shin Y K, Ueda Y.Automated Sequencing of PCR-amplified 16S rDNA on 『Hydrolink』 Gels[J]. J.Microbiol. Methods, 1994, 19: 145 — 154)方法合成。P-f CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；
P-r GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。加入ImL模板DNA (〈0· lmg)，PCR擴增 30 個循環(94 °C I min, 55 °C 30s, 72 。C 2min)。採用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應。然後,在Applied Biosystem373 A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列採用BLAST軟體與GenBank資料庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。2、16S rRNA 序列測定
本發明採用對16SrRNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑑定。以細菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度為1437bp的擴增帶(用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1所示。PCR產物經純化後，測定其全序列，其序列見SEQ ID NO:1。三、菌落形態特徵以及生理生化特性
枯草芽孢桿菌DS3的菌落形態為菌落呈白色或淡黃色、不透明、圓形、表面粗糙，中間有皺起、邊緣不整齊；需氧，革蘭氏陽性芽孢桿菌。最適生長PH值6. 5 7. 5，最適生長溫度25-35 °C。不能在60 °C生長。四、枯草芽孢桿菌DS3為新的菌株 採用BLAST分析法對菌株DS3的16S rRNA基因序列與GenBank資料庫比較分析發現，菌株DS3與枯草芽孢桿菌心Subtilis)的同源性高達99. 0%。綜合菌株的生理生化以及分子鑑定結果，菌株DS3命名為枯草芽孢桿菌{Bacillus SubtHis)收 。查閱有關資料，尚無枯草芽孢桿菌屬有關降解皂素廢水能力研究的報導。枯草芽孢桿菌(feci77心為新的菌株，已於2010年6月13日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC M 2010146。本發明從湖北省十堰市某黃姜皂素生產廠排放廢水的生化處理系統汙泥中篩選分離出這一株細菌，並發現其有較好降解皂素廢水中有機汙染物的功能。這拓寬了人們對枯草芽孢桿菌UaciBm Subtilis)在其功能方面的應用研究思路，並為降解高濃度有機汙染物黃姜皂素廢水及其他皂素廢水提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。五、枯草芽孢桿菌DS3的應用
挑取活化後的枯草芽孢桿菌(Mcillus Subtilis) DS3單菌落，於LB液體培養基中培養過夜，按培養後的枯草芽孢桿菌(feci77w5· Subtilis)!)^ :阜素廢水(即實驗廢水,取自湖北省十堰市某黃姜皂素生產廠排放廢水的生化處理系統)的體積比為O. 5-2 :100接種，30-35°C恆溫培養，pH值為6-8，反應48-72小時。在本實施例中，具體的應用方法為用接種環挑取單菌落DS3，於50mL LB液體培養基中30°C震蕩培養過夜；取ImL菌液接種於9mL皂素廢水(脫酸水初始COD 4700 mg/L左右、pHl.28)中；另取一支裝有9mL皂素廢水的試管，加入ImL LB液體培養基作為空白對t匕。調節水樣pH值約為7. 0，置於35°C、150rpm振蕩培養3d，測定水樣的COD值，從而計算得到菌株對廢水的COD去除效率。該菌株能在72小時之內去除皂素廢水中的C0D2150mg/L，去除效率達到50. 71%。需要說明的是，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。
權利要求
1.枯草芽孢桿菌DS3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010146。
全文摘要
本發明提供一種枯草芽孢桿菌DS3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2010146。該枯草芽孢桿菌DS3在高濃度硫酸根離子環境中具有較強的生長能力和良好的去除皂素廢水中有機汙染物的能力，該菌株能在72小時之內去除皂素廢水中的COD2150mg/L，去除效率達到50.71%。本發明為降解皂素廢水高濃度有機汙染物提供了有用的菌源，拓寬了對枯草芽孢桿菌功能方面的應用，具有較強的應用價值。
文檔編號C02F3/34GK103013874SQ201210537890
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者鄭丹, 鮑建國 申請人:中國地質大學(武漢)