Cd161蛋白的用途
2023-10-11 13:15:49 1
Cd161蛋白的用途
【專利摘要】本發明提供了一種與CD161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4的用途，即用於製備區分結核潛伏感染和活動性結核的試劑盒。本發明CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD8+細胞上CD161表達的百分率在結核病人血液中的表達明顯低於健康人群以及潛伏感染人群，因此可以利用與CD161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4區分活動性結核和結核潛伏感染，使結核診斷更加準確、快速。
【專利說明】CD161蛋白的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程【技術領域】，特別涉及⑶161蛋白的用途。
【背景技術】
[0002]結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，結核分枝桿菌不僅可引起肺結核(85%)，而且可引起肺外多種器官的結核病。儘管目前已有有效的抗結核藥物，但結核病仍然是當前感染性疾病的頭號殺手，全球每年約200萬人死於結核病；全球約三分之一的人口感染結核分枝桿菌，在這些被稱為結核菌潛伏感染(LTBI)的人群中，有約10%最終將進展為活動性結核病。
[0003]由於目前缺乏有效的結核病疫苗，結核病的預防控制主要依賴於早期發現、治療或隔離活動性結核病人。然而，現今診斷活動性結核病的檢測技術不能滿足臨床和結核病預防控制的要求，存在以下嚴重不足，I)痰結核分枝桿菌微生物檢查特異性高，是當前診斷活動性肺結核的金標準，但存在敏感性低(不足40%)，耗時長(結核菌培養耗時I 一 2個月)，實驗室生物安全要求高的缺點。2)結核分枝桿菌基因檢測，雖然實現了快速診斷的目的(I天)，但直接從痰標本進行的基因檢測在敏感性方面沒有顯著提高，且存在假陰性或假陽性的問題。3)免疫學檢測中抗體檢測被世界衛生組織認定不適合結核病的診斷；細胞免疫學檢測包括結核菌素皮試(TST)和結核菌幹擾素釋放試驗(IGRA)，不能有效區分活動性結核患者和結核菌潛伏感染者，雖然後者在活動性結核患者檢測的敏感性顯著高於其他檢測。
[0004]⑶161 (NKR-PlA)屬於C型凝集素超家族，表達在天然的NK細胞和T細胞上。⑶161表達在記憶性/功能性CD4+T細胞、CD8+T細胞、TCRyt T細胞、部分CD3+胸腺細胞和Thl7⑶4+T細胞。雖然目前⑶161的功能並沒有明確，但是最近的研究表明⑶161表達在Treg細胞上，CD161+Treg細胞表達IFN Y、IL-17、IL-2等多種細胞因子，並且在炎症部位聞表達。
[0005]目前尚沒有關於⑶161蛋白作為結核診斷標誌物的報導。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種⑶161蛋白的用途，通過使用與⑶161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4，製備試劑盒檢測⑶3+細胞、⑶3+⑶4+細胞、⑶3+⑶8+細胞上⑶161表達的百分率，以區分結核潛伏感染和
活動性結核。
[0007]為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現:
[0008]本發明提供了一種與⑶161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定⑶161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4的用途，即用於製備區分結核潛伏感染和活動性結核的試劑盒。
[0009]所述與⑶161蛋白特異性結合的抗體為⑶161-PE ;所述用於界定⑶161表達細胞的抗體分別對應為 CD45-APC/cy7、CD3-PE.Cy7 和 CD4-PE.Cy5。
[0010]所述區分結核潛伏感染和活動性結核的試劑盒還包括溶血素溶液、磷酸鹽緩衝液和多聚甲醛。
[0011]所述溶血素由溶血素:ddH20按照體積比1:9的比例配製而成。
[0012]利用本發明的試劑盒，可以檢測CD161基因編碼蛋白的表達情況，從而診斷是否患有活動性結核病。
[0013]在本發明中，可以使用一系列本領域已知的蛋白特異抗體。例如，BD公司的CD45-APC/cy7 (貨號:340943)、CD3-PE.Cy7 (貨號:57851)、CD4-PE.Cy5 (貨號:555348)和BECKMAN 公司的 CD161-PE (貨號:PNM3450)。
[0014]經實驗證明，本發明⑶3+細胞、⑶3+⑶4+細胞、⑶3+⑶8+細胞上⑶161表達的百分率在結核病人血液中的表達明顯低於健康人群以及潛伏感染人群，因此可以利用與⑶161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定⑶161表達細胞的抗體⑶45/⑶3/⑶4區分活動性結核和結核潛伏感染，使結核診斷更加準確、快速。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0015]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0016]圖1是本發明實施例1流式細胞圖顯示在CD45+細胞中單核細胞和淋巴細胞表達，其中A，流式檢測全血中⑶45+細胞；B，在圖A的基礎上檢測⑶45+細胞中淋巴細胞和單核細胞。圖1A和圖1B的橫軸:CD45APC染色信號強度；縱軸:側向角散射(SSC)，細胞顆粒度。
[0017]圖2是本發明實施例1流式細胞圖顯示淋巴細胞中⑶161在⑶3+細胞中的表達。圖2A.流式檢測全血中⑶45+細胞；B.在圖A的基礎上，從⑶45+細胞中檢測淋巴細胞和單核細胞；C.在圖B的基礎上，從淋巴細胞中檢測出CD161在CD3+細胞中的表達。其中圖2A和圖2B橫軸:⑶45APC染色信號強度；縱軸:側向角散射(SSC)，細胞顆粒度。圖2C橫軸:⑶3PE-Cy7染色信號強度；縱軸:⑶161PE染色信號強度。
[0018]圖3是本發明實施例1流式細胞圖顯示淋巴細胞中⑶161在⑶3+⑶4+細胞中的表達。A.流式檢測全血中⑶45+細胞；B.在圖A的基礎上，從⑶45+細胞中檢測淋巴細胞和單核細胞；C.在圖B的基礎上，從淋巴細胞中檢測CD3+CD4+細胞的表達；D.在圖C的基礎上檢測⑶161在⑶3+⑶4+細胞中的表達。其中圖3A和圖3B橫軸:⑶45APC染色信號強度；縱軸:側向角散射(SSC)，細胞顆粒度。圖3C橫軸:⑶3PE-Cy7染色信號強度；縱軸:⑶4PE-Cy5染色信號強度。圖3D橫軸:⑶3PE_Cy7染色信號強度；縱軸:⑶161PE染色信號強度。
[0019]圖4是本發明實施例1流式細胞圖顯示淋巴細胞中⑶161在⑶3+⑶8+細胞中的表達。圖4A.流式檢測全血中⑶45+細胞；B.在圖A的基礎上，從⑶45+細胞中檢測淋巴細胞和單核細胞；C.在圖B的基礎上，從淋巴細胞中檢測出CD3+CD8+細胞的表達；D.在圖C的基礎上，檢測⑶161在⑶3+⑶8+細胞中的表達。其中圖4A和圖4B橫軸:⑶45APC染色信號強度；縱軸:側向角散射(SSC)，細胞顆粒度。圖4C橫軸:CD3PE-Cy7染色信號強度；縱軸:⑶4PE-Cy5染色信號強度。圖4D橫軸:⑶3PE_Cy7染色信號強度；縱軸:⑶161PE染色信號強度。
[0020]圖5為本發明實施例1比較健康對照、潛伏感染者、結核病人中A.L%/M%X CD3+CD161+%、B.L%/M%X CD3+CD161+%、C.L%/M%X CD3+CD161+% 的差別。圖 5A、圖 5B 和圖5C橫軸:健康對照(HC)、潛伏感染者(LTB)、結核病人(TB);縱軸:L%/M%X⑶3+⑶161+%、L%/M%XCD3+CD4+CD161+%、L%/M%X CD3+CD8+CD161+% ；P<0.0001。
[0021]圖6 為本發明實施例1 繪製 L%/M%XCD3+CD161+%、L%/M%XCD3+CD4+CD161+%、L%/M%xra3+ra8+rai6i+%在分辨結核病人和潛伏感染者(a，表ι)、結核病人和健康對照(B，表I)的ROC曲線。圖6橫軸:敏感性；縱軸:特異性。其中虛線I代表L%/M%XCD3+CD4+CD161+% 的 ROC 曲線，虛線 2 代表:L%/M%XCD3+CD161+% 的 ROC 曲線，虛線 3代表 L%/M% X CD3+CD8+CD161+ (%)的 ROC 曲線。
【具體實施方式】:
[0022]下面結合實施例和附圖對本發明進行進一步描述:
[0023]實施例1
[0024]將人群分為三組:結核病患者(TB，27例)、潛伏感染人群(LTBI，49例)和健康人群(HC，60例)，通過流式細胞檢測每例全血淋巴細胞的百分比(L%)和單核細胞(M%)，以及淋巴細胞中CD3+CD161+、CD3+CD4+CD161+、CD3+CD8+CD161+細胞的百分比。然後計算出L%/M%X CD3+CD161+%、L%/M%X CD3+CD4+CD161+%、L%/M%X CD3+CD8+CD161+%。結果發現其在結核病患者中 L%/M%X CD3+CD161+%、L%/M%X CD3+CD4+CD161+%、L%/M%X CD3+CD8+CD161+% 均明顯低於健康對照和潛伏感染者。具體操作如下:
[0025]I)分別吸取上述確診的TB、LTBI和HC的每例外周血200uL於流式管；在每個流式管中分別加入以下螢光標記抗體[BD公司的CD45-APC/cy7(貨號:340943)、CD3-PE.Cy7(貨號:57851)、CD4-PE.Cy5 (貨號:555348)和 BECKMAN 公司的 CD161_PE(貨號:PNIM3450)各2 μ L]，震蕩混勻，室溫下避光孵育20min ；
[0026]2)按照體積比(溶血素:ddH20=l:9)(溶血素:BDIS貨號:349202)配製溶血素溶液，將其繼續加入各流式管中，每流式管加入2ml，震蕩混勻，室溫下避光孵育5-10min ；
[0027]3)待管內液體變清亮透明後，1500r/min離心5min，將上層液體倒掉，並在乾淨的吸水紙上扣幹；
[0028]4)接著在上述每個扣幹後的流式管中各加入3ml滅菌IM磷酸鹽緩衝液(PBS)，震蕩混勻，1500r/min離心5min，棄上清，加入4%(M/V)的多聚甲醛溶液100 μ I固定，棄上清，加入ImllM PBS洗一次；
[0029]5)用BD FACSCanto II流式細胞儀進行檢測。
[0030]檢測結果:
[0031]如圖1-4所示，利用流式細胞儀檢測不同細胞百分比:淋巴細胞佔⑶45+細胞中比例(L%，圖1)、單核細胞佔⑶45+細胞的比例(M%，圖1)、CD3+⑶4+細胞佔淋巴細胞的比例(CD3+CD4+%，圖3)、CD3+CD8+細胞佔淋巴細胞的比例(CD3+CD8+%，圖4) ;CD161+細胞在⑶3+細胞中的陽性率(⑶3+⑶161+%，圖2)、⑶161+細胞在⑶3+⑶4+細胞的陽性率(CD3+CD4+CD161+%，圖 3)、CD161+ 細胞在 CD3+CD8+ 細胞的陽性率(CD3+CD8+CD161+%，圖4)。
[0032]結果計算:
[0033]通過流式細胞儀檢測得出上述細胞的百分比後，分析不同細胞中⑶161+細胞的比例，具體如下:[0034](I)淋巴細胞百分比與單核細胞百分比的比例(L%/M%):利用⑶45+細胞中淋巴細胞的百分比(L%)，除以⑶45+細胞中單核細胞的百分率(M%)。
[0035](2)⑶161陽性細胞在⑶3+細胞中的表達量(L%/M%X⑶3+⑶161+%):利用淋巴細胞數與單核細胞數之比(L%/M%)乘以⑶3+細胞中⑶161+的百分比(⑶3+⑶161+%)，表示⑶161陽性細胞在⑶3+細胞中的表達量；
[0036](3) CD 161 陽性細胞在 CD3+CD4+ 細胞中的表達量(L%/M%XCD3+CD4+CD161+%):利用淋巴細胞數與單核細胞數之比(L%/M%)乘以⑶161+細胞在⑶3+⑶4+細胞的陽性率(⑶3+⑶4+⑶161+%)，表明⑶45+細胞的淋巴細胞中⑶161陽性細胞在⑶3+⑶4+細胞中的
表達量；
[0037](4) CD 161 陽性細胞在 CD3+CD8+ 細胞中的表達量(L%/M%X CD3+CD8+CD161+%):利用淋巴細胞數與單核細胞數之K(L%/M%)乘以⑶161+細胞在⑶3+⑶8+細胞的陽性率(⑶3+⑶8+⑶161+%)，表明⑶45+細胞的淋巴細胞中⑶161陽性細胞在⑶3+⑶8+細胞中的
表達量；
[0038](5)根據上述計算方法分別計算不同人群(健康對照、潛伏感染、結核病人)L%/M%XCD3+CD161+%、L%/M%XCD3+CD4+CD161+%、L%/M%XCD3+CD8+CD161+%，比較不同人群上述細胞的表達，如圖5所示。其中縱坐標代表淋巴細胞數和單核細胞數的比例(L%/M%)乘以CD161陽性細胞的百分比，橫坐標表示不同人群。統計結果表明，在結核病人(TB)中L%/M%X CD3+CD161+%、L%/M%X CD3+CD4+CD161+%、L%/M%X CD3+CD8+CD161+% 均低於結核潛伏感染者(LTBI)和健康(HC)對照(Ρ〈0.0001)；
[0039](6)利用上述數據在軟體GraphPad Prism5繪製受試者工作特徵曲線(R0C曲線)評價以上方法的診斷結核病的能力。L%/M%X⑶3+⑶4+⑶161+%、L%/M%X⑶3+⑶8+⑶161+%、L%/M%X⑶3+⑶161+%分辨結核病人和潛伏感染者(圖6A，表I )、結核病人和健康對照(圖6B，表2)的能力。在分辨結核病人和潛伏感染者時，L%/M%X⑶3+⑶4+⑶161+%、L%/M%XCD3+CD8+CD161+%、L%/M%XCD3+CD161+% 的 AUC 值分別為 0.8307,0.8647,0.8821。當L%/M%XCD3+CD4+CD161+%小於88.33%時，檢測的敏感性和特異性分別為81.48%和75.51% ；當L%/M%X⑶3+⑶8+⑶161+%小於113.20%時，其檢測的敏感性和特異性分別為88.89%,71.43% ；當L%/M%XCD3+CD161+%小於64.97%時，其檢測的敏感性和特異性分別為85.19%,79.59%ο在分辨結核病人和健康對照時，L%/M%X⑶3+⑶4+⑶161+%、L%/M%XCD3+CD8+CD161+%、L%/M%XCD3+CD161+% 的 AUC 值為 0.9167,0.8877,0.9074。當 L%/M%XCD3+CD4+CD161+%小於88.47%時，其檢測到敏感性和特異性分別為81.48%,88.33% ；當L%/M%X⑶3+⑶8+⑶161+%小於110.90%時，其檢測的敏感性和特異性分別為81.48%、80.00% ;當L%/M%X⑶3+⑶161+%小於65.40%時，其檢測的敏感性和特異性分別為85.19%、86.67%。
[0040]反應閾值的確定:
[0041 ]當 L%/M%X CD3+CD161+%、L%/M%X CD3+CD4+CD161+%、L%/M%X CD3+CD8+CD161+% 分別小於88.47%、113.20%、65.40% (取表I和表2相同一組中較大的一個數值)時，根據上述的計算結果顯示，分辨結核病人和結核潛伏感染者、健康對照，敏感性在81.48%-88.89%之間，特異性在71.43%-88.33%之間。
[0042]表 I
【權利要求】
1.一種與CD161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4的用途，其特徵在於，用於製備區分結核潛伏感染和活動性結核的試劑盒。
2.根據權利要求1所述的與CD161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4的用途，其特徵在於，所述與CD161蛋白特異性結合的抗體為CD161-PE ;所述用於界定CD161表達細胞的抗體分別對應為CD45_APC/cy7、CD3-PE.Cy7和CD4-PE.Cy50
3.根據權利要求2所述的與CD161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體CD45/CD3/CD4的用途，其特徵在於，所述區分結核潛伏感染和活動性結核的試劑盒還包括溶血素溶液、磷酸鹽緩衝液和多聚甲醛。
4.根據權利要求3所述的與CD161蛋白特異性結合的抗體以及用於界定CD161表達細胞的抗體⑶45/⑶3/⑶4的用途，其特徵在於，所述溶血素由溶血素:ddH20按照體積比1:9的比例配製而成。
【文檔編號】G01N33/53GK103575910SQ201310542931
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】陳心春, 陳騎, 張明霞, 楊倩婷, 蔡毅, 周伯平 申請人:深圳市第三人民醫院