酯酶同工酶診斷試劑盒的製備的製作方法
2023-10-11 05:41:54
專利名稱：酯酶同工酶診斷試劑盒的製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，屬於酶學領域。
近年來，酶學在臨床診斷與治療中的應用發展非常迅速，現已分別發展為醫學中的兩個新領域，即診斷酶學和治療酶學。目前已有上百種酶試驗可用於臨床診斷。臨床酶學的這一發展，部分是由於測定技術的發展，使許多酶的測定已日益精確和簡便，可用於常規測定。部分是由於認識到某些疾病發展過程中酶活力必然發生改變這一客觀事實，特別是在疾病的早期，用X光片、CT還未能發現病灶時，而體內的酶活性已開始發生變化。如果能定期查體，可做到對疾病的早期發現。值得一提的是，目前臨床上診斷酶學的應用多數是對酶的總活性的測定，並且市場上已有相應試劑盒銷售，其缺點是缺乏器官特異性。目前有關酶活性測定的試劑盒約有20～30種，同工酶檢測試劑盒約有3～5種，但多數用的是化學抑制法或免疫抑制法。而同工酶是指酶蛋白結構不同而具有相同的催化特性的一類酶，不同的同工酶來自不同的組織和細胞。當某一組織或器官發生病變時，由於組織受損或細胞膜通透性的變化，引起細胞內酶大量釋入血液而引起血清酶活性的改變。通過同工酶的檢測可確定患病部位，從而提高酶學診斷的特異性和敏感性，還可判斷預後。目前由於自行配製酶顯示液，因所用試劑品種繁多，規格不一，致使酶顯示結果不穩定，結果判定不統一，且同工酶檢測操作較繁瑣，費時等等，特別是大型生化分析儀的應用，使臨床生化檢測的操作更簡便，省時、省力，但其是對總酶活性的測定，缺乏組織特異性，相比較，同工酶的檢測使病變早期定性和定位就精確的多了。
本發明的目的在於提供一種質量優良、性能穩定、重複性能好，同時大大簡化了檢測的操作過程且使用該試劑盒可使同工酶的檢測操作規範化，從而使酶活性的檢測及質量控制達到統一標準的酯酶同工酶診斷試劑盒的製備。
本發明的目的由如下技術方案實施做醋酸纖維素薄膜電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.03mol/L-0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、配製濃度為0.05mol/L-0.2mol/L泡電泳膜緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸做為固定液分裝安瓿G，用時加水稀釋；(4)、顯色液的配製(a)、將底物分裝安瓿B；(b)、溶劑分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.05～0.25mol/L緩衝液分裝安瓿D；(d)、將重氮鹽染料分裝安瓿E；(e)、將瓊脂糖分裝安瓿F；其中將所述安瓿B內的底物、安瓿E內的重氮鹽染料、安瓿F內的瓊脂糖按重量百分比，其所佔比例分別是14.4％-83.3％，12.8％-85.4％，1.5％-28.6％；按上述比例，用時先將安瓿B內的底物、10～30微升安瓿C內的溶劑混合，然後將安瓿D內1～2.5ml濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液和安瓿E內的重氮鹽染料混合溶解，將安瓿F內的瓊脂糖加水加熱溶解，然後將安瓿B內的底物和安瓿C內的溶劑的混合液，安瓿D內的緩衝液和安瓿E內的重氮鹽染料的混合液、安瓿F內的瓊脂糖溶解後混合，即為顯色液。
做瓊脂糖凝膠電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.03mol/L-0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、將冰乙酸做為固定液分裝安瓿G，用時加水稀釋；(3)、配製瓊脂凝膠將瓊脂糖或瓊脂、泡電泳膜緩衝液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮分裝安瓿A，其中瓊脂糖或瓊脂、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(按重量百分比)其比例分別為19.2％-38.3％，43.5％-77.0％，3.8％-23.0％，泡電泳膜緩衝液是80～120ml的濃度為0.05mol/L-0.2mol/L緩衝液，將瓊脂糖或瓊脂、泡電泳膜緩衝液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮加熱溶解，趁熱分裝，製備為安瓿A；(4)、顯色液的配製(a)、將底物分裝安瓿B；(b)、溶劑分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.05～0.25mol/L緩衝液分裝安瓿D，(d)、將重氮鹽染料分裝安瓿E；其中將所述安瓿B內的底物、安瓿E內的重氮鹽染料，按重量百分比，所佔比例分別是12.5％-85.7％，14.3％-87.5％；用時將安瓿B內的底物加入10～30微升安瓿C內的溶劑，安瓿E內的重氮鹽染料加入1～2.5ml安瓿D內濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液，再將安瓿B和安瓿C內容物的混合液和安瓿E與安瓿D內容物的混合液混合，即為顯色液。
所述瓊脂凝膠是將瓊脂糖或瓊脂、濃度為0.05mol/L-0.2mol/L泡電泳膜緩衝液分裝安瓿A，其中所述瓊脂糖或瓊脂0.5g～1g，加入80～120ml的緩衝液，加熱溶解，趁熱分裝。
所述顯色液的配製中，安瓿B中的底物可以是多種萘酚衍生物，如萘酚AS-D氯醋酸、萘酚AS乙酸、萘酚AS-LC乙酸、α-或β-萘酚乙酸酯、α-萘酚丙酸等；也可以是吲哚酚的衍生物作底物，如5｀-溴吲哚酚乙酸酯、5-溴-4(或6)-氯吲哚酚乙酸酯。
所述顯色液的配製中，安瓿C內的溶劑可用N.N二甲基甲醯胺或丙酮。
所述顯色液的配製中，安瓿D內的緩衝液可用醋酸緩衝液或磷酸鹽緩衝液。
所述顯色液的配製中，安瓿E內的重氮鹽染料可用固藍B或固藍BB、固藍R或固藍RR、固紫B、柘石榴紅GBC、固紅RC、固紅TR、六偶氮付品紅等。所述顯色液還可以製備為凍幹試劑，製備如下將底物、重氮鹽染料、瓊脂糖按重量百分比，其所佔比例分別是11.4％-83.3％，12.8％-85.4％，1.5％-28.6％；將瓊脂糖分裝安瓿F；按上述比例，將底物、10～30微升溶劑和1～2.5ml濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液分裝安瓿B，經冰凍乾燥後或直接低溫冷凍保存，經冰凍乾燥後的用時加蒸餾水溶解即可，直接低溫冷凍保存的可直接使用；按上述比例，將1～2.5ml濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液和重氮鹽染料分裝安瓿C，經冰凍乾燥後或直接低溫冷凍保存，經冰凍乾燥後的用時加蒸餾水溶解即可，直接低溫冷凍保存的可直接使用；用時將安瓿B內的底物、安瓿C內重氮鹽加水溶解後與安瓿B內的底物混合，將安瓿F內的瓊脂糖加水加熱溶解，然後將安瓿B內的底物和安瓿C內的重氮鹽的混合液，安瓿F內的瓊脂糖溶解後混合，即為顯色液。
酯酶是作用於脂肪族酯和芳香族酯，並使它們發生水解作用的酶，廣泛分布於機體各組織器官，主要用於血液病和肝臟疾患的診斷與鑑別診斷。
酯酶有數十種，如芳香酯酶(也叫Esterase A)、羧酸酯酶(又稱Esterase B)、乙醯酯酶(又稱Esterase C或稱酸性酯酶)、膽鹼酯酶、乙醯膽鹼酯酶、磷酯酶A1和A2等，在此主要指前三者，即Esterase A、B、C，因其底物特異性不強，又稱非特異性酯酶，此外，在血液學方面，常又根據底物的名稱來命名，如以萘酚AS-D氯醋酸為底物，稱萘酚AS-D氯乙酸酯酶，因其存在於粒細胞中，其它細胞中不顯示，又稱特異性酯酶。此外，根據所用底物不同，稱為α-或β-萘酚乙酸酯酶、α-萘酚丙酸酯酶、萘酚AS乙酸酯酶、萘酚AS-BI乙酸酯酶等等。其顯示方法相同。
本發明的優點是將試劑灌裝於安瓿內，便於保存、性能穩定，重複性好，減輕了勞動強度，改變了傳統的人工配製試劑的繁鎖，並由此而引起的操作過程中個體間存在的差異，從而使操作規範化，酶的檢測及質量控制達到統一的標準，同時使用試劑盒簡化了操作過程、省時，快速，便於推廣。尤其是當做大量樣品檢測時，試劑盒更方便使用。為臨床疾病的診斷和鑑別診斷提供依據。
實施例實施例1做醋酸纖維素薄膜電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.05mol/L電極液，PH為8.6；(2)、配製濃度為0.1mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇緩衝液，分裝安瓿A(3)、將冰乙酸做為固定液分裝安瓿G，用時加水稀釋；(4)、顯色液的配製(a)、將底物萘酚AS-D氯醋酸4mg；分裝安瓿B；(b)、溶劑N.N二甲基甲醯胺20微升分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.1mol/L醋酸緩衝液2ml分裝安瓿D；(d)、將重氮鹽染料固紫B5mg分裝安瓿E；(e)、將瓊脂糖0.7mg分裝安瓿F；用時先將安瓿B內的底物萘酚AS-D氯醋酸、安瓿C內的溶劑N.N二甲基甲醯胺混合，然後將安瓿D內的緩衝液和安瓿E內的重氮鹽染料固紫B混合溶解，將安瓿F內的瓊脂糖加水加熱溶解，然後將安瓿B內的底物和安瓿C內的溶劑N.N二甲基甲醯胺的混合液，安瓿D內醋酸緩衝液和安瓿E內重氮鹽染料固紫的混合液、安瓿F內瓊脂糖溶解後混合，即為顯色液。
應用首先泡膜打開安瓿A加水至25ml，將醋纖膜泡在該液內20分鐘。然後將醋纖膜取出，夾在濾紙中間吸去多餘水份，膜條無光澤面朝上。用點樣片醮血清點在距膜一端2cm處。將配製好的電極緩衝液倒入電泳槽內，使槽內電極緩衝液處於同一水平。在電泳槽的陰、陽極槽內分別用合適尺寸的濾紙摺疊4層搭在槽的兩側，做為鹽橋。將點樣的膜條點樣面朝下，點樣處朝向陰極端搭在鹽橋上，膜條需與鹽橋貼緊，繃展。接通電源，調節電壓100～260v，10～30分鐘後，關閉電源。然後進行同工酶顯色將安瓿C內液體加入安瓿B，使溶解，將安瓿D內的內容物加入安瓿E，使溶解，將安瓿F內乾粉倒入一小試管，加1ml水，加熱溶解，然後將安瓿C與安瓿B混合液與安瓿D、安瓿E混合液混合，混合後加入溶解好的安瓿F液內，混勻，趁熱鋪在一個玻璃板上，冷卻後，將電泳過膜條取出，點樣面貼在膠板上，在37℃溫育20～30分鐘，即可見同工酶譜。
結果正常人血清酯酶同工酶有2條酶活性區帶。用目測評定色帶深淺，陽極帶型酶活性強、濃染，為第一區帶；陰極帶型酶活性弱、淺染，為第二區帶。其酶的活性依次為酯酶1＞酯酶2。肝癌或肝硬化時，第二區帶酶的活性顯著下降，有時幾乎沒有。
實施例2做醋酸纖維素薄膜電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.1mol/L電極液，PH為8.6；(2)、配製濃度為0.05mol/Ltris-HCL緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸做為固定液分裝安瓿G，用時加水稀釋；(4)、顯色液的配製(a)、將底物萘酚AS-D氯醋酸6mg分裝安瓿B；(b)、溶劑N.N二甲基甲醯胺30微升分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.2mol/L醋酸緩衝液2ml分裝安瓿D；(d)、將重氮鹽染料固藍B2mg分裝安瓿E；(e)、將瓊脂糖0.7mg分裝安瓿F；用時先將安瓿B內的底物、安瓿C內溶劑N.N二甲基甲醯胺混合，然後將安瓿D內的緩衝液和安瓿E內重氮鹽染料固藍混合溶解，將安瓿F內瓊脂糖加水加熱溶解，然後將安瓿B內底物和安瓿C內溶劑的混合液，安瓿D和安瓿E內容物的混合液、安瓿F內瓊脂糖溶解後混合，即為顯色液。
其應用如實施例1所述，結果也相同。
實施例3做醋酸纖維素薄膜電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.03mol/L電極液，PH為8.6；(2)、配製濃度為0.2mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸2ml做為固定液分裝安瓿G，用時加水稀釋；(4)、顯色液的配製(a)、將底物萘酚AS-D氯醋酸2mg；、10微升溶劑和2ml濃度為0.2mol/L的緩衝液分裝安瓿B，經冰凍乾燥後，用時加蒸餾水溶解即可；將1ml濃度為0.1mol/L的緩衝液和重氮鹽染料7mg分裝安瓿C，經冰凍乾燥後，用時加蒸餾水溶解即可；將瓊脂糖0.5mg分裝安瓿F，用時將安瓿F內瓊脂糖加水加熱溶解，然後將安瓿B和安瓿C的內容物加水溶解後混合，將該混合液與安瓿F內的瓊脂糖溶解後混合，即為顯色液。
應用如實施例1所述，結果也相同。
實施例4做瓊脂糖凝膠電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.08mol/Ltris-HCL電極液，PH為8.0；(2)、冰乙酸做為固定液，取2ml分裝安瓿G，用時加水稀釋；(3)、配製瓊脂凝膠將瓊脂糖0.7g、0.1mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇緩衝液100ml、蔗糖2g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g加熱溶解，趁熱分裝安瓿A；(4)、顯色液的配製(a)、將底物萘酚AS-D氯醋酸5mg分裝安瓿B；(b)、溶劑N.N二甲基甲醯胺10微升分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液2ml分裝安瓿D，(d)、將重氮鹽染料固藍R 4mg分裝安瓿E；用時將安瓿C內的N.N二甲基甲醯胺10微升加入安瓿B內底物萘酚AS-D氯醋酸5mg，將安瓿D內磷酸緩衝液加入安瓿E內的固藍R混合，再將安瓿B、安瓿C的混合液與安瓿D、安瓿E的混合液混合，即為顯色液。
應用將安瓿A隔水加熱溶解，趁熱澆在一玻璃板上，冷卻後在距膜一端約2cm處放0.3×1cm的濾紙。約10分鐘後取下濾紙，在該處加樣8微升，放置5分鐘。然後將凝膠板放在加好電極液的電泳槽架上，兩端用4層紗布搭橋，電壓100v，電泳30分鐘，關閉電源。將膠板取出加入上述已混合好的顯色液，放在37℃溫箱裡溫育20-30分鐘，即可見同工酶顯色帶。
結果如實施例1的結果。
實施例5、做瓊脂糖凝膠電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.07mol/L巴比妥緩衝液為電極液，PH為8.6；(2)、冰乙酸做為固定液，取2ml分裝安瓿G，用時加水稀釋；(3)、配製瓊脂凝膠將瓊脂0.9g、0.1mol/LTris緩衝液100ml、加熱溶解，趁熱分裝安瓿A；(4)、顯色液的配製(a)、將底物α-萘酚乙酸酯5mg分裝安瓿B；(b)、溶劑丙酮15微升分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.15mol/L醋酸緩衝液2ml分裝安瓿D，(d)、將重氮鹽染料固藍RR6mg分裝安瓿E；用時將安瓿B內α-萘酚乙酸酯5mg加入安瓿C內的N.N二甲基甲醯胺10微升混合，安瓿D內醋酸緩衝液加入安瓿E內的固藍混合，再將安瓿B、安瓿C的混合液與安瓿D、安瓿E的混合液混合，即為顯色液。
應用將安瓿A隔水加熱溶解，趁熱澆在一玻璃板上，冷卻後在距膜一端約2cm處放0.3×1cm的濾紙。約10分鐘後取下濾紙，在該處加樣8微升，放置5分鐘。然後將凝膠板放在加好電極液的電泳槽架上，兩端用4層紗布搭橋，電壓100v，電泳30分鐘，關閉電源。將膠板取出加入上述已混合好的顯色液，放在37℃溫箱裡溫育20-30分鐘，即可見同工酶顯色帶。
結果正常人血清酯酶同工酶有2條酶活性區帶。用目測評定色帶深淺，陽極帶型酶活性弱為第一區帶；陰極帶型酶活性強為第二區帶。肝癌或肝硬化時，第二區帶酶的活性顯著下降，有時幾乎沒有。
權利要求
1.一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，做醋酸纖維素薄膜電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.03mol/L-0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、配製濃度為0.05mol/L-0.2mol/L泡電泳膜緩衝液；(3)、將冰乙酸做為固定液，用時加水稀釋；其特徵在於如(2)所述的泡電泳膜緩衝液分裝安瓿A；如(3)所述的固定液分裝安瓿G；(4)、顯色液的配製(a)、將底物分裝安瓿B；(b)、溶劑分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.05～0.25mol/L緩衝液分裝安瓿D；(d)、將重氮鹽染料分裝安瓿E；(e)、將瓊脂糖分裝安瓿F；其中將所述安瓿B內的底物、安瓿E內的重氮鹽染料、安瓿F內的瓊脂糖按重量百分比，其所佔比例分別是14.4％-83.3％，12.8％-85.4％，1.5％-28.6％；按上述比例，用時先將安瓿B內的底物、10～30微升安瓿C內的溶劑混合，然後將安瓿D內1～2.5ml濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液和安瓿E內的重氮鹽染料混合溶解，將安瓿F內的瓊脂糖加水加熱溶解，然後將安瓿B內的底物和安瓿C內的溶劑的混合液，安瓿D內的緩衝液和安瓿E內的重氮鹽染料的混合液、安瓿F內的瓊脂糖溶解後混合，即為顯色液。
2.一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，做瓊脂糖凝膠電泳時，其包括有(1)、配製濃度為0.03mol/L-0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、將冰乙酸做為固定液，用時加水稀釋；其特徵在於如(2)所述固定液分裝安瓿G；(3)、配製瓊脂凝膠將瓊脂糖或瓊脂、泡電泳膜緩衝液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮分裝安瓿A，其中瓊脂糖或瓊脂、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(按重量百分比)其比例分別為7.0％-32.3％，55.6％-91.0％，1.4％-19.4％，泡電泳膜緩衝液是80～120ml的濃度為0.05mol/L-0.2mol/L緩衝液，將瓊脂糖或瓊脂、泡電泳膜緩衝液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮加熱溶解，趁熱分裝，製備為安瓿A；(4)、顯色液的配製(a)、將底物分裝安瓿B；(b)、溶劑分裝安瓿C；(c)、將濃度為0.05～0.25mol/L緩衝液分裝安瓿D，(d)、將重氮鹽染料分裝安瓿E；其中將所述安瓿B、安瓿E按重量百分比，所佔比例分別是12.5％-85.7％，14.3％-87.5％；用時將安瓿B加入10～30微升安瓿C內的溶劑，將1～2.5ml安瓿D內濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液，加入安瓿E內，然後將安瓿B、安瓿C的混合液與安瓿D、安瓿E的混合液混合，即為顯色液。
3.根據權利要求1、2所述的一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述顯色液的配製此處也可製備為凍幹試劑，製備如下將底物、重氮鹽染料、瓊脂糖按重量百分比，其所佔比例分別是14.4％-83.3％，12.8％-85.4％，1.5％-28.6％；將瓊脂糖分裝安瓿F；按上述比例，將底物、10～30微升溶劑和1～2.5ml濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液分裝安瓿B，經冰凍乾燥後或直接低溫冷凍保存，經冰凍乾燥後的用時加蒸餾水溶解即可，直接低溫冷凍保存的可直接使用；按上述比例，將1～2.5ml濃度為0.05～0.25mol/L的緩衝液和重氮鹽染料分裝安瓿C，經冰凍乾燥後或直接低溫冷凍保存，經冰凍乾燥後的用時加蒸餾水溶解即可，直接低溫冷凍保存的可直接使用；用時將安瓿B、安瓿C混合，將安瓿F加水加熱溶解，然後將安瓿B和安瓿C的混合液，安瓿F溶解後混合，即為顯色液。
4.根據權利要求3所述的一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述瓊脂糖凝膠的配製為將瓊脂糖或瓊脂、濃度為0.05mol/L-0.2mol/L泡電泳膜緩衝液分裝安瓿A，其中所述瓊脂糖或瓊脂0.5g～1g，加入80～120ml的緩衝液，加熱溶解，趁熱分裝。
5.根據權利要求1、3所述的一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於緩衝液分裝安瓿D，可用醋酸緩衝液或磷酸鹽緩衝液。
6.根據權利要求1、3所述的一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述顯色液的配製中，安瓿B中的底物可以是多種萘酚衍生物，如萘酚AS-D氯醋酸、萘酚AS乙酸、萘酚AS-LC乙酸、α-或β-萘酚乙酸酯、α-萘酚丙酸等；也可以是吲哚酚的衍生物作底物，如5｀-溴吲哚酚乙酸酯、5-溴-4(或6)-氯吲哚酚乙酸酯。
7.根據權利要求1、3所述的一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述顯色液的配製中，安瓿C內的溶劑可用N.N二甲基甲醯胺或丙酮。
8.根據權利要求1、3所述的一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述顯色液的配製中，安瓿E內的重氮鹽染料可用固藍B或固藍BB、固藍R或固藍RR、固紫B、柘石榴紅GBC、固紅RC、固紅TR、六偶氮付品紅等。
全文摘要
本發明公開了一種酯酶同工酶診斷試劑盒的製備,屬於酶學領域。其配製酯酶的試劑盒,將試劑灌裝於安瓿內,便於保存、性能穩定,重複性好,減輕了勞動強度,改變了傳統的人工配製試劑的繁瑣,並由此而引起的操作過程中個體間存在的差異,從而使操作規範化,酶的檢測及質量控制達到統一的標準,同時使用試劑盒簡化了操作過程、省時,快速,便於推廣。尤其是當做大量樣品檢測時,試劑盒更方便使用。為臨床疾病的診斷和鑑別診斷提供依據。
文檔編號G01N33/531GK1381727SQ01110758
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月20日 優先權日2001年4月20日
發明者侯金鳳, 舍英, 閻美容, 陳必珍 申請人:呼和浩特同日試劑有限公司