對黑脛病真菌具有抗性的芸苔屬植物的製作方法

2023-10-09 20:32:34 1

專利名稱：對黑脛病真菌具有抗性的芸苔屬植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及在歐洲油菜(Brassica napus)中控制真菌疾病的領域。提供了歐洲油菜植物和種子，它們在基因組中含有來自蕪青(B.rapa)8號染色體的抗黑脛病(blackleg)基因座。也提供基因組中包含至少兩個或至少三個定位於不同染色體的抗黑脛病基因座的歐洲油菜植物和種子。進一步提供在歐洲油菜植物、組織或種子中檢測一個或多個抗性等位基因存在的檢測工具，和向其它芸苔屬植物轉移一個或多個抗性基因座的方法以及在雜種種子和植物中組合不同抗性基因座的方法。也提供增加抗Leptosphaeria maculans抗性的持久性的方法和本發明的植物、種子、方法和試劑盒的應用。
背景技術：
黑脛病或莖潰瘍是歐洲油菜(Brassica napus L.)(油料種子油菜(oilseed rape)或Canola)的主要疾病，導致每年全球範圍內主要的經濟損失，特別是在歐洲、澳大利亞和北美洲。黑脛病是由真菌病原體Leptosphaeria maculans(Desm.)Ces.De Not.(無性型黑脛莖點黴(Phoma lingam Tode ex.Fr.))引起的。L.maculans症狀可以出現在子葉、葉、英和莖上。在通過風傳播的子囊孢子和/或水(通過濺水)傳播的分生孢子感染之後發展出葉損傷。莖的症狀(或潰瘍)可以通過莖的直接感染引起，或通過葉損傷處真菌的系統生長，經維管組織進入莖引起[Hammond等人.(1985)，Plant Pathology 34557-565]。莖的潰瘍可能環繞莖，導致植物倒狀和植物死亡。較不嚴重的潰瘍可能導致對水和營養成分流動的限制，這反過來會導致種子和英的枯萎。英的感染可能導致成熟前的落莢(pod shattering)和種子感染。
將黑脛病抗性整合進歐洲油菜栽培品種是全世界範圍內育種計劃的主要目的之一。雖然噴灑殺真菌劑和種植經驗都被用於減少黑脛病感染導致的產量損失，但是至今最為可靠的控制方法是遺傳抗性。
歐洲油菜(2n＝38，基因組AACC)是雙二倍體物種，它起源於蕪青(又稱芸苔(B.campestris)；2n＝20，AA)和甘藍(Brassica oleracea L.)(2n＝18，CC)的自發雜交。歐洲油菜含有這兩個二倍體基因組的全部染色體組。
黑脛病抗性的評估既可在溫室也在田間實驗中進行。在一個實施方案中，優選在田間實驗中評估黑脛病抗性，並且可以在植物發育的不同階段評估。在涉及黑脛病抗性時，通常不同類型的抗性根據被評估的植物階段和組織而被區分，如幼苗抗性(『早期』抗性)和成年植株抗性(『晚期』或『莖』抗性)。進行抗性分析的植物組織例如有子葉、葉和莖基。已報導的對黑脛病的遺傳抗性既有單基因(在一個主效基因的控制之下)的，也有多基因(在若干微效基因的控制之下)的。
在歐洲油菜中一些抗性基因座已被繪製了圖譜。例如，基於幼苗的傷口接種[Fereirra等人.(1995)，Genetics 85(2)213-217]，被命名為LEM1的單一顯性抗性基因座被報導定位於歐洲油菜栽培品種Major的第6連鎖群(現在發明者已知其是Sharpe等人術語中的N07染色體(1995，Genome381112-1121))。而spring cv.Cresor成年植物的田間抗性被Dion等人繪圖定位於N07染色體[(1995)，TAG 911190-1194]並被命名為LmFr。栽培品種Maluka和Shiralee被報導具有命名為LmR1、定位於N07染色體上的控制幼苗抗性的主基因座[Mayerhofer等人(1997)，Genome 40294-301.]。Rimmer等人[(1999)，Proceeding of the 10thInternationalRapeseed Congress]也報導了命名為RLM、定位於N07染色體上的抗性基因座。
然而歐洲油菜(AACC基因組)缺乏足夠的抗性，並且當抗性栽培品種被大範圍和長期使用時，存在持繼的抗性衰退的危險，這使得育種者和科學家去尋找替代的抗性來源。主要的焦點集中在從相關芸苔屬物種(如蕪青(AA)、甘藍(CC)、黑芥(B.nigra)(BB基因組)、芥菜(B.juncea)(AABB基因組)和B.carinata(BBCC))中鑑定和轉移抗性等位基因。
黑脛病抗性的一個主要來源是B基因組。Gerdemann-Knorck等人在1994年報導了通過不對稱體細胞雜交從黑芥向歐洲油菜引入黑脛病抗性[Gerdemann-Knorck等人(1994)，Plant Breeding 113106-113]。
已有的另一種方法是產生所謂的『人工』歐洲油菜系，其中將兩種二倍體物種(AA和CC基因組)進行種間雜交，隨後在體外培育胚，並進行染色體加倍。
通過從野生型蕪青(AA基因組)種質(accession)[Crouch等人(1994)，Plant Breeding 112265-278]和野生型B.atlantica(CC基因組)種質[Mithen和Magrath(1992)，Plant Breeding 10860-68，以及Mithen和Herron(1991)，Proceeding of the 8th International Rapeseed Congress]生成人工歐洲油菜植物，已用上述方法將黑脛病抗性引入了歐洲油菜。
6份野生型B.rapa ssp sylvestris種質與芥藍(B.oleracea ssp alboglabra)雜交以形成一系列人工歐洲油菜系，這些人工歐洲油菜系具有相同的C基因組，但具有不同的A基因組[Crouch等人(1994)，前引文]。在溫室測試中發現B.rapa ssp sylvestris#75和#76能夠抵抗黑脛病分離物(子葉和葉測試)，而B.rapa ssp sylvestris#29則易感。來自#75或#76和芥藍的兩個人工系，以及它們與油料種子油菜栽培品種的F1雜種在溫室實驗中表現出對黑脛病的高度抗性。這些系中只有一種在英格蘭和澳大利亞的田間實驗中也表現出抗性。
Crouch(PhD論文，University of East Anglia，Norwich，UK)描述了與導致田間抗性的基因組區域連鎖的RFLP標記物，將這些區域繪製成5個連鎖群，定位了在不同組織中有助於抗性的數量性狀基因座(QTL)。使用區間分析(interval analysis)鑑定了在來自人工親本的組1[根據Sharpe等人(1995)，Genome 381112-1121，N7染色體]和來自栽培品種親本的組3(根據Sharpe等人，N3染色體)中有助於葉抗性的QTL和在組1、組2(根據Sharpe等人，N10染色體)和組5(這一組與Sharpe等人的連鎖群的關係還不確定)中有助於莖下部、下胚軸和根的抗性的QTL。區間作圖未能鑑定到有助於莖上部抗性的任何QTL。
Crouch和Mithen等人(前引文)描述的人工歐洲油菜系由於含有高水平的芥子油苷、芥子酸，能育性差並具有自交不親和性[Easton，AustraliaResearch Assembly on Brassicas(2001)]，因此不適宜農業種植。
在2000年春季，Pacific Seeds向澳大利亞市場提供了開放傳粉的歐洲油菜品種Surpass 400，它獲得了9.0的國家級黑脛病抗性等級，這是已知的最高水平的抗性。Surpass 400的祖先包括人工歐洲油菜，這一人工歐洲油菜來自Sicily的野生型B.rapa ssp sylvestris與芥藍的種間雜交[Li等人，Australia Research Assembly on Brassicas 2001；Easton前引文]。在幼苗階段提供黑脛病抗性的主要顯性等位基因被報導存在於Surpass 400中[Li等人，Australia Research Assembly on Brassicas 2001]。
Yu等人[(2002)，Can.J.Plant Pathology 2496-97；Plant，AnimalMicrobe Genomes Conference January 12-16，(2002)]報導了存在於用品系(breeding line)6270和6279雜交獲得的歐洲油菜種群中的兩個抗性基因座。位於2號染色體上被命名為LepR1的顯性核等位基因，它在6270系中提供對來自病原性群體PG2、PG3和PG4的L.maculans分離菌株的抗性。第二個基因座位於10號染色體，被命名為LepR2，具有不完全顯性，提供子葉對PG2和PG3分離菌株的抗性。
Rimmer等人[13th Crucifer Genetics Workshop，March 23-26，(2002)]報導了歐洲油菜中四個抗性基因座的圖譜。兩個抗性基因座來自歐洲油菜(不是蕪青)，被繪製於染色體N7和染色體N8上。另兩個基因座來自B.rapa ssp sylvestris，被繪製於染色體2和染色體10上。
在2003年初出現了第一個關於Surpass 400抗性衰退的報導。僅僅3年，似乎已經進化出了一種能夠感染Surpass 400的更具毒性的真菌菌株。這一菌株能以多快速度散布到不同的地區還需要觀察，但是很清楚，需要增加抗性持久性的新的抗性基因和方法。
由於病原體種群的變化會導致持續存在遺傳抗性衰退的威脅，因此需要鑑定新的抗性遺傳來源、向具有高農藝表現(agronomic performance)的品種轉移這些來源的方法和增加抗性持久性的方法。
本發明(包括在說明書和權利要求中提供的不同實施方案)提供含有新的黑脛病抗性基因(Lem-08-syl)的植物和向其它品系或品種轉移Lem-08-syl的方法和手段，以及檢測植物中Lem-08-syl存在與否的方法。
發明概述在本發明的一個實施方案中提供了在8號染色體上含有新黑脛病抗性基因的芥菜植物、種子和組織，其中抗性基因來自蕪青。在本發明另一實施方案中，提供了含有蕪青染色體R08的片段的芥菜植物，其中所述片段含有黑脛病抗性基因。所述的蕪青植物可以來自野生型蕪青種質(accession)，如B.rapa ssp sylvestris、B.rapa ssp chinensis、B.rapa sspdichotoma、B.rapa ssp japonica、B.rapa ssp narinosa、B.rapa ssp olifeira、B.rapa ssp pekinensis、B.rapa ssp perviridis、B.rapa ssp trilocul。
在本發明一個實施方案中，提供了含有蕪青染色體R08的片段的歐洲油菜植物，其中所述片段含有黑脛病抗性基因，其中這些歐洲油菜植物選自含有整合進其基因組的轉基因的歐洲油菜植物；含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與Surpass 400植物的雜交；在乾燥、脫脂的種子粉中脂肪族芥子油苷水平低於30mmol/g的歐洲油菜植物；其種子的固體成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羥基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羥基-4-戊烯基-芥子油苷中任何一種或它們混合物的含量少於30微摩爾/克風乾無油固體的歐洲油菜植物；產生的油(粉碎(crush)種子後)中芥子酸的含量少於2％(佔油中總脂肪酸的量)的歐洲油菜植物；歐洲油菜春油料種子油菜植物；歐洲油菜冬油料種子油菜植物；在染色體N2上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；在染色體N10上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；不含有作圖在染色體2或染色體10上的抗性基因的歐洲油菜植物，所述抗性基因來自B.rapa ssp sylvestris；含有能引起植物雄性不育的轉基因的歐洲油菜植物，所述轉基因優選是芽孢桿菌RNA酶基因；含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與以下油料種子油菜品種中任一種的雜交除草劑抗性歐洲油菜品種、種子中具有高油含量的歐洲油菜品種、種子中具有高油酸含量的歐洲油菜品種、種子中具有低亞麻酸含量的歐洲油菜品種、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass 400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育轉基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
在本發明另一實施方案中，以上描述的歐洲油菜植物、種子和組織在染色體8含有新的黑脛病抗性基因。
前面段落中的蕪青植物可以來自野生型蕪青種質，如B.rapa sspsylvestris、B.rapa ssp chinensis、B.rapa ssp dichotoma、B.rapa ssp japonica、B.rapa ssp narinosa、B.rapa ssp olifeira、B.rapa ssp pekinensis、B.rapa sspperviridis、B.rapa ssp trilocul。
在本發明另一實施方案中，已經通過遺傳轉化將黑脛病抗性基因轉移到了所述歐洲油菜或芥菜植物中。
在本發明另一實施方案中，上述黑脛病抗性基因含有這裡定義的Lem-08-syl，特別是當Lem-08-syl與選自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6、E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1的至少一個AFLP標記物相關時。
在本發明另一實施方案中，提供如AFLP標記物之類的、與來自蕪青的黑脛病抗性基因(特別是來自蕪青染色體8的黑脛病抗性基因)連鎖的一種或多種分子標記物。在特定的實施方案中，本發明使用的分子標記物選自蕪青特異性標記物(如E32/M50-M362.0、E36/M51-M171.1或P34/M48-M283)，或選自標記物P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6。
在另一實施方案中，提供含有來自蕪青染色體R08的黑脛病抗性基因的雜種種子，其中此雜種種子發育成的植物具有本發明概述整個第二段所描述的特徵。
也提供以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的歐洲油菜種子，和使用這些種子向其它芸苔屬品系或品種漸滲入(introgression)位於蕪青染色體R08的黑脛病抗性基因的方法，以及來自於這些種子的含有本發明黑脛病抗性基因的歐洲油菜或芥菜植物。
在本發明進一步的實施方案中，提供含有至少兩個(優選的為至少3個或4個)黑脛病抗性基因、並且每一基因定位於不同的染色體的歐洲油菜或芥菜植物或種子。這包括含有N08染色體上的黑脛病抗性基因並且進一步含有N07、N10和/或N14染色體上的黑脛病抗性基因，或歐洲油菜栽培品種Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60或Surpass400的黑脛病抗性基因的植物。在一個實施方案中提供含有至少兩個來自蕪青的黑脛病抗性基因座(如位於N08染色體和N10染色體上)的植物。
本發明進一步提供產生雜種種子的方法，其中黑脛病抗性基因座被堆疊(stack)於雜種種子或植物中。此方法包括將含有來自蕪青的本發明黑脛病抗性基因的雄性不育親本植物(優選含有處於絨氈層或雄蕊特異啟動子控制下的芽孢桿菌RNA酶基因的植物)與在基因組中含有恢復育性(fertility)的基因的植物(優選的是具有一個或多個在染色體8之外的其它染色體上的黑脛病抗性基因座，如位於N07、N10和/或N14染色體上的黑脛病抗性基因座，或Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60或Surpass400的抗性基因的植物)雜交。在另一方法中，雄性不育親本含有本發明的黑脛病抗性基因和一個或多個額外的黑脛病抗性基因座，如N07、N10和/或N14染色體上的抗性基因座，或Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60或Surpass400的抗性基因。將該植物與含有恢復育性的基因的植物雜交。
在一個實施方案中，提供至少含有蕪青染色體R08的黑脛病抗性基因的雜種植物和種子。在進一步的實施方案中，提供在其它染色體上也含有黑脛病抗性基因座(如Lem10、Lem7和/或Lem14)的雜種植物和種子。在本發明的一實施方案中，提供含有Lem-08-syl基因的本發明植物與已知品種Hyola60、Hyola43、Surpass501TT、Surpass400、Surpass404CL、Surpass402CL、Surpass603CL，或任何其它具有高黑脛病抗性等級(見如Khangura等人，2003，Department of Agriculture，Western Australia，Farmnote No.6/2003，ISSN 0726-934X)的油料種子油菜品種雜交的後代。
提供向其它芸苔屬品系或品種轉移Lem-08-syl的方法。在一實施方案中使用標記物輔助的選擇來加速轉移。
本發明也提供檢測芸苔屬植物、種子或組織中Lem-08-syl存在與否的方法。
也提供用於檢測芸苔屬(優選歐洲油菜或芥菜)植物、種子或組織中Lem-08-syl存在與否的檢測試劑盒。這裡還提供本發明的任一AFLP標記物，特別是E32/M50-M362、E36/M51-M171.1、P34/M48-M283、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6中的任一種，優選的是AFLP標記物E32/M50-M362、E36/M51-M171.1和P34/M48-M283中的任一種。本發明的一個實施方案涉及在歐洲油菜的AFLP分析中使用這些標記物，以及含有這類標記物的歐洲油菜分析用試劑盒。
還提供了本發明植物或種子在種植作物芸苔屬油料種子植物(優選的是歐洲油菜植物)中的應用。
在本發明的另一實施方案中，如此處所用，在染色體8上含有新的黑脛病抗性基因(其中所述抗性基因源自蕪青)的植物是達到由加拿大Canola Council(http//www.canola-council.org)設定的canola質量標準的歐洲油菜植物。
本發明其它實施方案詳細說明於所附的權利要求中。
實施方案詳述根據Sharpe等人[(1995)，Genome 381112-1121]和Parkin等人[(1995)，Genome 381122-1131]，歐洲油菜具有19對染色體，在此編號為N01到N19。N01到N10是A-基因組染色體，而N11到N19是C-基因組染色體。蕪青(同名芸苔(B.campestris))具有10對染色體(A-基因組)，在此編號為R01到R10，相應於歐洲油菜的N01到N10。由二倍體祖先黑芥和蕪青雜交產生的雙二倍體物種芥菜具有18對染色體，10對來自蕪青(A基因組，這裡編號為J01到J10，相應於N01到N10)，8對來自黑芥(B基因組)。
在本發明的一個實施方案中，提供分別於N08或J08染色體上含有攜帶黑脛病抗性基因(這裡命名為Lem-08-syl)的蕪青染色體8(R08)片段的歐洲油菜植物或芥菜植物。
這裡使用的「品種」(variety)與UPOV公約相一致，指的是處於已知最低等級的單一植物分類中的植物定群(plant grouping)，此定群可以通過表達給定基因型或基因型組合所導致的特徵來定義，並可以與表達所述特徵中的至少一種特徵的任一其它植物定群相區別，並且就其適宜被不發生改變地繁殖而言被認為是一個單位。
這裡使用的「Lem-08-syl」指的是位於蕪青染色體8上的黑脛病抗性基因，該基因當漸滲入易於感染黑脛病的歐洲油菜或芥菜品種或品系時能夠賦於這些植物黑脛病抗性。Lem-08-syl可以例如，從2003年8月22日保藏於ATCC(美國典型培養物保藏中心，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209，USA)並且保藏號為PTA-5410的種子中獲得。優選的是，Lem-08-syl是來自於蕪青的黑脛病抗性基因，並定位於以PTA-5410保藏號保藏的種子的N08染色體上，優選的，此基因與AFLP引物E32/M50-M362和/或P34/M48-M283相關。在本發明的一個實施方案中，「Lem-08-syl」是以PTA-5410保藏號保藏的種子中與距分別約4.7和/或約5.7cM的AFLP標記物E32/M50-M362.0和/或P34/M48-M283.0相關的「黑脛病抗性基因」。
當漸滲入對黑脛病易感的栽培品種如Kristina時，Lem-08-syl把黑脛病抗性從約1.0-2.0的等級增強到約6.0-9.0的等級，其中以1.0到9.0的等級評估黑脛病抗性，並且1.0是最易感的表型，9.0則是最具抗性的表型。應理解的是，環境條件(如位置、氣候條件和疾病壓力)以及評估疾病症狀的人員的個人感受會對黑脛病抗性的分值具有一定的影響。因此，在對比測試中這些因素的變化應當被最小化。本領域已知的任何其它抗性分級都可以依照本發明被用於本發明植物與對照植物的比較，如Khangura等人設定的WA黑脛病抗性分級(2003，Department of Agriculture，WesternAustralia，Farmnote No.6/2003，ISSN 0726-934X)。
在一個實施方案中，漸滲入的包含Lem-08-syl的蕪青片段來自野生型蕪青亞種，優選的來自sylvestris亞種，但也可來自其它蕪青種質，如Song等人[(1990)，TAG 79497-506]描述的野生型歐洲種質或野生型亞洲種質，或來自培育的蕪青品種。應理解的是，漸滲入的蕪青片段的大小可以變動，只要保留黑脛病抗性基因座即可。可以通過檢測與Lem-08-syl連鎖的分子標記物或通過檢測易感或不具有完全抗性的芸苔屬植物與含有Lem-08-syl的植物的雜交後代中黑脛病抗性是否提高來測試Lem-08-syl的存在。優選的是，蕪青片段不含有任何不需要的附加基因座，如(但不限於)影響開花時間、春化作用要求(vernalization requirement)、耐凍性等的基因座。
這裡所使用的「黑脛病」指的是由真菌病原體Leptosphaeria maculans或黑脛莖點黴(無性型)引起的疾病。此定義包括Tox°和Tox+分離株(isolate)，不管在以後的分類研究中它們是否可能被發現屬於不同的物種[Rouxel等人(1995)，BlacklegNews N°4]。
依據與歐洲油菜栽培品種Westar、Galcier和Quinta的特異相互作用，L.maculans分離株可以被分入不同的致病組(pathogenicity groups，PG)[Mengistu等人(1991)，Plant Disease 751279-1282]。PG4分離株在所有三種栽培品種上導致孢子形成損傷，而PG3分離株在Quinta子葉上引起抗性反應，PG2分離株在Quinta和Glacier子葉上引起抗性反應。PG1分離株對於這些宿主是非致病性的。在文獻中，PG2、PG3和PG4也被稱為是「高侵略性」或「高毒性」或「強烈致病性」分離株，而PG1分離株被稱為是「非侵略性」或「非毒性」或「弱致病性」分離株。有時高度侵略性種類也被命名為「A」，而弱侵略性種類被命名為「NA」[Badawy和Hoppe(1989)，J Phytopathology 127146-157]。最近，通過高侵略性種類的毒素產物而將其與弱侵略性種類區分(Tox+分離株相對於Tox°分離株)[Rouxel等人綜述，Blackleg News N°4，(1995)]。已發現Tox°分離株會在不出現外部症狀的情況下引起髓的壞死，現已有人指出對Tox°分離株導致的產量損失有所低估[Johnson和Lewis(1994)，Plant Pathology 43269-277]。Tox°分離株被進一步分為3類，即NA1、NA2和NA3，並已有人指出NA1分離株在歐洲處於主導地位，而NA2分離株在加拿大更為重要[Gall等人(1995)，Mycol Res 99221-229]。
這裡使用的「外源的」，當涉及某一植物屬、種或品種中的基因或轉基因時，指的是正常並不存在於該屬、種或品種的植物中的基因，或使用本領域已知的方法通過基因轉化加入到該植物基因組中的基因，或已被化學、放射性誘導或其它植物誘變方式修飾的內源基因。
這裡使用的「基因座」是基因在染色體上佔有的位置。「黑脛病抗性基因座」指的是「黑脛病抗性基因」定位於染色體上的位置。這一位置可以通過在染色體遺傳圖譜上進行定位而被鑑定。該定義也包括黑脛病抗性基因所在的染色體的基因組DNA的片段(或區段)。
當指本發明抗性基因(特別是Lem-08-syl)的位置時，這裡使用的「染色體8」是根據Sharpe等人(1995，Genome 381112-1121)的命名法的A基因組的第8號染色體。
這裡使用的「黑脛病抗性基因」是指與缺乏黑脛病抗性基因或具有此基因的非功能(或無活性)形式的植物相比，增加植物(優選的為歐洲油菜植物)對Leptosphaeria maculans的抗性(或與增加抗性有關的)的DNA序列。「Lem-08-syl」是以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的種子中與距分別約4.7和/或約5.7cM的AFLP標記物E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0相關聯的「黑脛病抗性基因」。使用例如本發明分子標記物可以將這一抗性基因轉移到不同的歐洲油菜品種，甚至轉移到如芥菜之類的不同芸苔屬植物種中。
來自B.rapa ssp sylvestris的黑脛病抗性被發現作為單一顯性基因(Lem-08-syl)分離。使用黑脛病抗性定量測量，將Lem-08-syl繪製在歐洲油菜遺傳圖譜的N08染色體上，優選地N08染色體末端。通過QTL作圖(數量性狀基因座作圖)驗證了Lem-08-syl的位置和效果，其中鑑定的QTL峰與Lem-08-syl在遺傳圖譜上的位置一致，並且解釋了77.8％的黑脛病抗性變化(LOD(優勢對數)值為68.12)，表明Lem-08-syl對於黑脛病抗性具有高度顯著的作用。
含有某一抗性基因的植物的「增強的抗性」指的是相對於對照植物而言，由真菌感染引起的損害降低。損害可以通過如葉子症狀的數量和大小、莖症狀的頻率和嚴重程度、由莖的感染導致的植物倒伏等等來評估。特別是，當植物在有疾病壓力的田間生長時，損害的減小表現為相對於對照植物產量損失的降低。這類產量損失的降低可以由於例如在具有增強的抗性的植物中真菌的感染、繁殖、傳播或生存被降低或阻止所致。增強的抗性也可以指植物具有完全的抗性，即在植物身上沒有發現疾病症狀，或植物在現有的黑脛病評分或等級分析(如Khangura等人(2003，Department ofAgriculture，Western Australia，Farmnote No.6/2003，ISSN 0726-934X))中獲得最高的抗性等級。
增強的抗性也可以通過在受控制的環境(如生長室)中進行的生物試驗來評估，但是理想的是在田間實驗中進行證實，因為受控環境的評估通常不能反映田間條件。這可能是由於生物試驗通常測試少量的單孢子分離株，而在田間病原體群體中存在大得多的變異[見Crouch等人，前引文]。
這裡使用的「等位基因」是基因的一系列可相互替換的形式中的一種。在二倍體物種中，一個給定的基因座存在兩個等位基因，但在一個群體中對於一個基因座可能存在超過兩個的等位基因。如果位於同源染色體相應基因座的兩等位基因是相同的，這一基因座就被認為是純合的。例如由染色體加倍而產生的加倍單倍體(doubled haploid，DH)植物，其所有的基因座都是純合的。
這裡使用的(分子)「標記物」指的是在基因組中具有固定位置的可測量的遺傳特徵，它通常以孟德爾方式遺傳，並可以被用來作圖定位目的性狀。標記物的性質依賴於使用的分子分析法，並可以在DNA、RNA或蛋白質水平上被檢測。可以使用例如，但不限於RFLP(限制性片段長度多性；Botstein等人(1980)，Am J Hum Genet 32314-331；Tanksley等人(1989)，Bio/Technology 7257-263)、RAPD[隨機擴增的多態DNA；Williams等人(1990)，NAR 186531-6535]、AFLP[擴增片段長度多態性；Vos等人(1995)NAR234407-4414]、SNP或微衛星[也被命名為SSR’s；Tautz等人(1989)，NAR 176463-6417]的分子標記物進行遺傳作圖。適當的引物或探針由使用的作圖方法而定。
術語「AFLP」(AFLP是荷蘭Wageningen KeyGene N.V.的註冊商標)、「AFLP分析」和「AFLP標記物」按照標準的術語使用[Vos等人(1995)，NAR 234407-4414；EP0534858]。如這裡所使用的，AFLP標記物是具有特定大小的DNA片段，它通過AFLP分析產生並以凝膠上條帶觀察。每一AFLP標記物通過用於擴增它的引物組合來命名，其後是所擴增DNA片段的近似大小(鹼基對)。應理解的是，依賴於使用的實驗條件和儀器，這些片段的大小可能輕微地變化。應該了解的是，每當用引物組合和片段的特定大小來提及AFLP標記物時，所述大小都是近似的，包括或旨在於包括在不同實驗室觀察到的輕微差異。每一AFLP標記物代表基因組中的一個確定的基因座。雖然有些AFLP標記物可以被評定為共顯性的(區別純合和雜合個體，如通過帶強度)，但AFLP標記物通常是顯性的(不能區別純合和雜合個體)。
如果標記物與基因或基因座在遺傳上比預期的獨立分配具有更大的關聯性，即標記物與基因座在分離群體中共分離，並定位於同一染色體上，則該分子標記物被認為與該基因或基因座「連鎖」。「連鎖」是指標記物與基因座(或兩個基因座或兩個標記物彼此)之間的遺傳距離。連鎖越緊密，使標記物與基因或基因座分離的重組事件發生的可能性就越小。遺傳距離(圖譜距離)根據重組頻率計算，並以釐摩(cM)表示[Kosambi(1944)，Ann Eugenet.12172-175]。
AFLP標記物可以「偶聯相」或「排斥相」與基因或基因座發生連鎖。例如與基因或基因座以偶聯相連鎖的顯性AFLP標記物存在於具有該基因或基因座的個體中，不存在於不具有該基因或基因座的個體中，而與基因或基因座以排斥相連鎖的顯性AFLP標記物不存在於具有該基因或基因座的個體中，存在於不具有該基因或基因座的個體中。與Lem-08-syl連鎖的本發明AFLP標記物優選地以偶聯相與Lem-08-syl連鎖。類似的，與這裡描述的其它黑脛病抗性基因或基因座(如Lem-10-syl)連鎖的AFLP標記物，優選以與Lem-10-syl偶聯的方式連鎖。
這裡使用的「蕪青特異的AFLP標記物」是通常只存在於二倍體蕪青植物中，而不存在於異源四倍體芸苔屬物種(優選的是不存在於歐洲油菜或芥菜)中的AFLP標記物。在本發明一個實施方案中，蕪青特異的AFLP標記物是存在於蕪青中但不存在於歐洲油菜中(優選的是不存在於任何一種如下歐洲油菜品種中Surpass400、Tapidor、Doublol、Mohican、Columbus、Aglona、Apache、Falcon、Silex、Kana、Express、Apex、Bristol、Vivol、Polo(W)、Orient、Mandarin、Sh7、Wuhac96.40006、Wuh5365、NAN93-1046、LE043-3、Yu-dal、Wuhan96.40005、Sh97.1020、Monty、Narendra、Drakkar、Kristina、Spok、Acrobat、Cyclone或Stellar)，特別是存在於蕪青但不存在於歐洲油菜品種Kristina中的標記物。例如蕪青特異的AFLP標記物通常不存在於歐洲油菜DNA或芥菜DNA中(除非從二倍體蕪青，特別是從野生型蕪青品種漸滲入歐洲油菜或芥菜)。因此，當使用蕪青特異的AFLP標記物(使用標記物的特異AFLP引物組合)並使用歐洲油菜和芥菜DNA(不含有漸滲入的蕪青片段)，優選以上列出的品種的DNA作為模板DNA，進行AFLP反應時，在AFLP凝膠上，預期的標記物位置不會出現擴增產物(沒有條帶)，而使用蕪青DNA作為模板時就會出現預期大小的條帶。與Lem-08-syl連鎖的蕪青特異的AFLP標記物的例子是E32/M50-M362.0、E36/M51-M171.1或P34/M48-M283.0。蕪青特異的AFLP標記物無需在遺傳圖譜中作圖定位於任何蕪青染色體上，只要它被發現存在於蕪青中而不存在於歐洲油菜(優選的不存在於以上列出的歐洲油菜植物)中，它就被認為是蕪青特異的(如這裡所使用的)。另外，通過實施如實施例1和實施例2所描述的AFLP分析，也可產生額外的與Lem-08-syl連鎖的蕪青特異的AFLP標記物。
然而，應當明了，AFLP標記物可以被轉換成其它類型的分子標記物。當在本發明中提及特異的AFLP標記物時，應理解此定義包括用於檢測如下遺傳變異的其它類型的分子標記物，所述遺傳變異最初是由所述AFLP標記物鑑定的。例如，如果使用已知的方法將AFLP標記物轉換為其它分子標記物，這其它分子標記物就被包括於此定義中。例如，使用Meksem等人[(2001)，Mol Gen Genomics 265(2)207-214]，Negi等人[(2001)，TAG101146-152]，Barret等人[(1989)，TAG 97828-833]，Xu等人[(2001)，Genome 44(1)63-70]，Dussel等人[(2002)，TAG 1051190-1195]或Guo等人[(2003)，TAG 1031011-1017]描述的標準技術，可將AFLP標記物轉換成序列特異的標記物，如(但不限於)STS(序列標誌位點)或SCAR(序列表徵的擴增區域，sequence-characterized-amplified-region)。Dussel等人[(2002)，TAG 1051190-1195]將與抗性連鎖的AFLP標記物轉換成基於PCR的序列標誌位點標記物，如indel(插入/缺失)標記物和CAPS(切割擴增多態序列，cleaved amplifled polymorphic sequence)標記物。
AFLP標記物向STS標記物的轉換通常涉及從AFLP凝膠中純化DNA片段，並對DNA片段進行克隆和測序。可以使用已知的方法[Guo等人，TAG 1031011-1017]，進行AFLP片斷(條帶)的克隆和測序。基於標記物序列(內部)，可以開發基因座特異的PCR引物[Paran和Michelmore(1993)，TAG 85985-993]，它們擴增不同大小的片段，或在擴增之後PCR產物可以用限制酶切割以呈現多態性。由於內部PCR引物通常不能反映涉及EcoRI、MseI或PstI(或其它酶)限制性位點差異的多態性，因此反向PCR[Hartl和Ochmann(1996)，Harwood A，編輯，Methods in molecularbiology vol58basic DNA and RNA protocols，Humana Press，Totowa NJpp293-301]或PCR步移[Negi等人(2000)，TAG 101146-152；Siebert等人，(1995)，NAR 231087-1088]可以被用於鑑定側翼序列，所述側翼序列可以被用來產生簡單的、基於PCR的基因座特異的標記物。使用如Sci-Ed(Scientific Educational Software PO Box 72045，Durham，NC27722-2045 USA)提供的計算機軟體程序可以容易的設計引物。可以通過凝膠電泳或如TaqMan技術(Roche Diagnostics)之類的螢光測定試驗檢測STS標記物的多態性。
使用與Lem-08-syl連鎖的標記物的AFLP分析在下文被稱為「Lem-08-syl AFLP鑑定方案」。在本發明一個實施方案中，使用蕪青特異的AFLP標記物如(但不限於)E32/M50-M362.0或E36/M51-M171.1和/或P34/M48-M283.0，完成Lem-08-syl AFLP鑑定方案。
在本發明一個實施方案中，含有來自蕪青染色體R08的新黑脛病抗性基因(優選的是如這裡所使用的Lem-08-syl)的植物是芥菜植物。在本發明另一個實施方案中，含有來自蕪青染色體R08的新黑脛病抗性基因(優選的是如這裡所使用的Lem-08-syl)的植物是歐洲油菜植物，此歐洲油菜植物選自-滿足加拿大Canola Council(http//www.canola-council.org)設定的canola質量標準的歐洲油菜植物；-含有整合進其基因組的轉基因的歐洲油菜植物；-含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與Surpass400植物的雜交；-在乾燥、脫脂的種子粉中含有脂肪族芥子油苷的水平低於30mmol/g的歐洲油菜植物；-其種子的固體成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羥基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羥基-4-戊烯基-芥子油苷中任何一種或它們的混合物的含量少於30微摩爾/克空氣乾燥的無油固體的歐洲油菜植物；-產生的油(粉碎種子後)中芥子酸的含量少於2％(佔油中總脂肪酸的量)的歐洲油菜植物；-歐洲油菜春油料種子油菜植物；-歐洲油菜冬油料種子油菜植物；-在N2染色體上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；-在N10染色體上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；-不含有作圖在染色體2或染色體10上的抗性基因的歐洲油菜植物，其中所述抗性基因來自B.rapa ssp sylvestris；-含有能引起植物雄性不育的轉基因(優選的是芽孢桿菌RNA酶基因)的歐洲油菜植物；-含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與以下油料種子油菜品種中任一種的雜交除草劑抗性歐洲油菜品種、種子中具有高油含量的歐洲油菜品種、種子中具有高油酸含量(佔總脂肪酸的至少70％，優選的至少80％)的歐洲油菜品種、種子中具有低亞麻酸含量(少於總脂肪酸的10％，優選的少於5％)的歐洲油菜品種、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育轉基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
在本發明一個實施方案中，提供含有至少一種與黑脛病抗性基因連鎖的蕪青特異性分子標記物的歐洲油菜植物或芥菜植物。特別是提供含有與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物E32/M50-M362.0和/或E36/M51-M171.1和/或P34/M48-M283的歐洲油菜或芥菜植物。
在進一步的實施方案中，提供含有至少一種與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物的歐洲油菜植物或芥菜植物。例如，提供含有一種或多種選自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6、E32/M50-M362.0和/或E36/M51-M171.1的AFLP標記物的植物。可以通過已知的方法鑑定額外的與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物，所述方法為例如QTL作圖、集群分離子分析[Bulk SegregantAnalysis，BSA；Michelmore等人PNAS 889828-9832]結合AFLP分析，參見實施例1和2中描述。為了鑑定更為緊密連鎖的AFLP標記物，如實施例中所描述的，使用已知的方法通過AFLP分析法對更多的植物個體和更多的AFLP引物組合進行分析，並且將這些標記物定位於遺傳連鎖圖譜上。優選地，AFLP標記物與含有Lem-08-syl的基因座之間的連鎖是緊密連鎖，即優選地少於約6cM，更優選地少於或等於5.7cM，更優選地少於5cM，少於或等於4.7cM，最優選地少於4cM。在本發明的一個實施方案中，Lem-08-syl側翼是兩個顯性AFLP標記物如E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0，它們分別以距Lem-08-syl約4.7和約5.7cM的距離與Lem-08-syl偶聯連鎖。
與Lem-08-syl連鎖的ALFP標記物可以被用於標記輔助選擇(markerassisted selection，MAS)或Lem-08-syl的作圖克隆。MAS涉及篩選具有或不具有連鎖標記物的植物。特別是篩選其中存在位於所連鎖的基因或基因座側翼的標記物的植物。在育種過程中基於是否具有標記物來選擇或淘汰植物。MAS能夠顯著的加速育種過程和特定基因向另一遺傳背景的漸滲，也能減少與基因型x環境相互作用相關的問題。MAS也可以用於在一種植物中聯合不同的黑脛病抗性基因座。通過使用如Lem-08-syl AFLP鑑定方案可以從與Lem-08-syl連鎖的ALFP標記物的存在或缺失，推斷Lem-08-syl的存在或缺失。例如，來自以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的種子的植物可與其它歐洲油菜植物雜交，然後篩選具有一個或多個與Lem-08-syl連鎖的ALFP標記物的雜交後代。可以使用例如緊密連鎖的AFLP標記物(如(但不限於)E32/M50-M362.0和/或P34/M48-M283.0)實施AFLP分析。與Lem-10-syl連鎖的標記物可以被用於在一個植物系中組合Lem-08-syl和Lem-10-syl，並用於開發含有來自蕪青的兩個抗性基因座的新品種。
育種方法(如雜交、自交、回交)是本領域所熟知的[見Allard RW(1960)Principles of Plant Breeding.John WileySons，New York，和Fehr WR(1987)Principles of Cultivar Development，Volume 1，Theory andTechniques，Collier Macmillan Publishers，London.ISBN 0-02-949920-8]。既可以僅使用傳統的育種方法，也可以與MAS聯用將Lem-08-syl轉移進其它品系或品種。在傳統的育種方法中，在田間或受控環境試驗中評估黑脛病抗性表型，以選擇或淘汰含有或缺乏Lem-08-syl的植物。可以使用不同的雜交將Lem-08-syl轉移進歐洲油菜系或品種或芥菜系或品種。可以通過歐洲油菜與芥菜的種間雜交將Lem-08-syl轉移進芥菜的A基因組[Roy(1984)，Euphytica 295-303]。育種程序可以包括雜交產生F1(第一子代)，隨後是若干代的自交(產生F2、F3等等)。育種程序也可以包括回交(BC)步驟，其中後代與親本系之一(稱為回歸親本)回交。育種者篩選農藝上重要的性狀，如高產量、高油含量、油分布圖(oil profile)、開花時間、植株高度、疾病抗性、抗落莢等等，並由此發展原種品系(具有良好農藝性狀的系)。此外，培育植物以符合質量標準，如「canola」質量(脫油的粉中芥子油苷水平低於30μmol/g，油中芥子酸的含量少於2％重量，如見US 6,303,849B1中的芥菜canola質量)。
在本發明另一實施方案中，來自蕪青(特別是來自蕪青染色體8)的黑脛病抗性基因，優選是Lem-08-syl被轉移入其它芸苔屬品系或品種中，這是通過用來自本發明植物(優選的是來自以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的植物)的Lem-08-syl基因轉化這些系或品種來實現的。
「Lem-08-syl AFLP鑑定方案」是指從葉組織或種子之類的植物組織抽提DNA，進行一個或多個連鎖的AFLP標記物的AFLP分析。Lem-08-sylAFLP鑑定方案可以在來自個體植物的DNA或來自植物集群(或庫)的DNA上進行。在一個實施方案中，提供了檢測歐洲油菜或芥菜DNA中Lem-08-syl存在的試劑盒。此試劑盒至少含有一對能夠擴增與Lem-08-syl連鎖的DNA標記物的PCR引物。試劑盒可以含有一個或多個以下引物對E32/M50、P34/M48、P31/M59、E32/M48、E31/M61或E36/M51，它們分別能夠擴增約362bp、283bp、97bp、162bp、237bp或171bp的DNA片段。特別是，試劑盒包括E32/M50和/或P34/M48。試劑盒可以進一步包括能夠被用作陽性或陰性對照的樣品和用於AFLP分析的其它試劑，見實施例1的描述。樣品可以是組織樣品或DNA樣品。例如，作為陽性對照可以包括以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的種子或源自其的種子。作為陰性對照可以包括栽培品種Kristina或Stellar的種子。
在本發明一個實施方案中，提供含有Lem-08-syl的雜種歐洲油菜植物和種子。通過兩近交親本系的雜交獲得雜種種子，其中一個近交親本系在N08染色體上含有Lem-08-syl。為了產生純雜種種子，有一個親本系是雄性不育的，用另一親本系的花粉授粉。通過成行種植親本系，並僅收穫雄性不育親本的F1種子，從而產生純雜種種子。為了產生雄性不育親本系，可以使用EP 0,344,029或US 6,509,516中描述的系統，其中編碼植物毒性蛋白(芽孢桿菌RNA酶)的基因在絨氈層特異性啟動子(如TA29)的控制之下表達，從而確保選擇性破壞絨氈層細胞。用嵌合基因pTA29芽孢桿菌RNA酶轉化植物導致植物的花粉形成被完全阻止[Mariani等人(1990)，Nature 347737-741]。De Block和De Brouwer描述了對含有嵌合pA29芽孢桿菌RNA酶基因的歐洲油菜植物的花葯發育的細胞化學和組織化學分析[(1993)，Planta 189218-225]。為了恢復雄性不育植物後代的育性，雄性不育植物(MS親本)與帶有育性恢復基因的轉基因植物(RF親本)雜交，該育性恢復基因表達後能夠抑制或阻止雄性不育基因的活性[U.S.Pat.Nos.5,689,041；5,792,929；De Block和De Brouwer，前引文]。WO96/26283描述了使用共調節基因產生雄性不育植物，可以提高具有良好農藝性狀的轉化體的頻率。通常，當不育DNA編碼芽孢桿菌RNA酶時，共調節DNA將編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑，優選使用如出版的PCT專利申請WO98/10081中所述的優化的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。應理解的是，不同的啟動子可以被用於驅動芽孢桿菌RNA酶表達，以引起植物雄性不育。同樣，芽孢桿菌RNA酶抑制劑可以與不同的啟動子可操作性連接，如來自花椰菜花葉病毒的35S。
雄性不育植物也可以用其它技術產生，如胞質雄性不育/恢復系系統[如Ogura系統、出版的US專利申請20020032916、US 6,229,072、WO97/02737、US 5,789,566或US 6,365,798的Polima系統、WO98/54340或WO95/09910的Kosena系統、US 5,644,066]。
MS親本或RF親本或兩者都可以在N08染色體上含有Lem-08-syl。這可以通過使用已知方法，將Lem-08-syl漸滲入原種歐洲油菜系，然後用pTA29-芽孢桿菌RNA酶或用pNOS-芽孢桿菌RNA酶抑制劑轉化這一系來完成。另選的是，可以通過含有Lem-08-syl的植物與MS親本或RF-親本雜交，而將Lem-08-syl直接滲入轉基因MS或RF親本系。由此，產生自MS和RF親本雜交的F1雜種種子將含有Lem-08-syl。
轉基因植物可以額外的含有賦予除草劑抗性的內源基因或轉基因，如賦予草銨膦(Liberty或Basta)抗性的bar或pat基因[EP 0 242 236和EP 0 242 246，作為參考文獻引入]；或任何修飾的EPSPS基因，如來自玉米的2mEPSPS基因[EP 0 508 909和EP 0 507 698，作為參考文獻引入]，它們賦予草甘膦(RoundupReady)抗性。
在另一的實施方案中，本發明提供在單一植物系或品種，特別是在雜種種子和雜種植物中堆疊(或累積)黑脛病抗性基因座的方法。雖然植物能展現的黑脛病抗性具有最大水平(完全或接近完全抵抗)，堆積黑脛病抗性基因座仍然是有利的。首先，不同的抗性基因座可能具有不同的作用模式。這具有使病原體群體較不可能克服抗性或至少較不可能在短期內克服抗性的效果。雖然(如通過突變或遺傳重組)可能進化出能克服一種作用模式的病原體分離株，但是不太可能發展出能克服若干作用模式的單一分離株。此外，不同的抗性基因座可能在植物發育不同階段提供抗性。例如，一個基因座可能在子葉階段賦予抗性，另一個基因座針對成熟的葉子，再一基因座針對莖感染。在含有堆積的抗性基因座的植物中，黑脛病抗性的持久性被增加，這意味著如果植物在許多地點被大面積種植，抗性將不會衰退(或抗性的衰退會顯著晚於只含有一個主效抗性基因座的植物)。本發明提供將如(但不限於)Lem-10-syl(位於染色體N10上，A-基因組)、Lem-07(位於染色體N07上，A-基因組)、Lem-14(位於染色體N14上，C-基因組)之類的額外黑脛病抗性基因座與染色體N08上的黑脛病抗性基因Lem-08-syl堆疊在一起的方法和手段。特別提供了含有至少兩個來自野生型蕪青種質的黑脛病抗性基因(如Lem-08-syl和Lem-10-syl)的植物。
為了在單一的植物系或品種或在雜種種子和雜種植物中堆疊抗性基因座，可以通過一般的雜交和選擇方法將基因座組合起來。
除非在實施例中另有說明，所有的重組DNA技術根據Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition。Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，和Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的卷1和卷2，和Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition，Academic Press(UK)中卷I和卷II的標準方案進行。用於植物分子工作的標準材料和方法被R.D.D.Croy描述於Plant Molecular Biology LabFax(1993)，由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publication，UK聯合出版。用於聚合酶鏈式反應的標準材料和方法可見於Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press和McPherson等人(2000)PCR-BasicsFrom Backgroundto Bench，First Edition，Springer Verlag，Germany。標準的AFLP分析方法描述於Vos等人(1995，NAR 234407-4414)和出版的EP專利申請EP534858。
應當明白的是前文僅僅是本發明特定實施方案的詳細描述，在不背離本發明精神和範圍的情況下，可以根據這裡所公開的內容對公開的實施方案進行許多改變。不管是先前的描述還是以下的實施例，都不意味著對本發明範圍的限制。本發明的範圍只被附帶的權利要求和它們的等同方案所決定。
以下是所附序列表中的序列，在本發明的一般描述或實施例中有所涉及SEQ ID NO1Msel-銜接子序列5』-3』SEQ ID NO2Msel-銜接子序列3』-5』SEQ ID NO3EcoRI-銜接子序列5』-3』SEQ ID NO4EcoRI-銜接子序列3』-5』SEQ ID NO5PstI-銜接子序列5』-3』SEQ ID NO6PstI-銜接子序列3』-5』SEQ ID NO7AFLP引物E01SEQ ID NO8AFLP引物M01SEQ ID NO9AFLP引物M02
SEQ ID NO10AFLP引物P01SEQ ID NO11AFLP引物E31SEQ ID NO12AFLP引物E32SEQ ID NO13AFLP引物E36SEQ ID NO14AFLP引物M48SEQ ID NO15AFLP引物M50SEQ ID NO16AFLP引物M51SEQ ID NO17AFLP引物M59SEQ ID NO18AFLP引物M61SEQ ID NO19AFLP引物P31SEQ ID NO20AFLP引物P34實施例實施例1通過AFLP分析對Lem-08-syl作圖BC3和DH作圖群體的產生Kristina是易於感染黑脛病(blackleg)的春油料種子油菜(springoilseed rape，SOSR)品種。RFM292是人工歐洲油菜(B.napus)系。RFM292如Crouch等人所描述(1994)的由來自Sicily的野生型B.rapa ssp sylvestris(#75)[Crouch等人(1994)]與來自Tunisia的野生型B.atlantica(#25)[Mithen和Magrath(1992)]雜交、拯救胚和用秋水仙素處理使染色體加倍而產生。Kristina與RFM292雜交。來自這一雜交的F1植物再與Kristina回交，產生BC1種群，該種群自交產生BC1S1植物。在田間試驗中測試BC1S1植物的抗性，選擇抗性系進一步自交，產生BC1S3植物。為了選擇用於自交的植物，測試它們對各種黑脛病分離株(加拿大、澳大利亞、英國分離株)的抗性。然後抗性BC1S3系與Kristina回交兩次產生BC2和BC3種群。300株BC3植物在生長室試驗中被測試黑脛病抗性。通過如下描述的AFLP集群分離子分析(Bulk Segregant Analysis，BSA)[Michelmore等人PNAS 889828-9832]分析抗性BC3植物庫和敏感BC3植物庫，以鑑定與黑脛病抗性連鎖的AFLP標記物。此外，如下描述的，對300株BC3植物進行AFLP分析以對黑脛病抗性作圖。
進一步的，通過小孢子培養[Mollers等人(1994)，Euphytica 7595-104]獲得來自Kristina與BC1S3雜交的F1(BC2個體)的加倍單倍體(DH)種群。DH種群被用於驗證多表型分型(multiple phenotyping)、得自BC3分析的作圖結果以及AFLP標記物與黑脛病抗性基因Lem-08-syl的連鎖。
擴增片段長度多態性(AFLP)分析DNA提取使用經修正的CTAB方案從親本系、對照系、BC3植物和DH植物提取DNA。每樣品取10個葉圓盤(直徑0.8cm)，用液氮冷凍，用研缽和杵將其離析並轉移到Eppendorf管。向每樣品加入1ml CTAB緩衝液(100ml＝10ml 1M Tris-HCl pH7.5，28ml 5M NaCl，4ml 0.5M EDTA，1g CTAB，水)，Eppendorf管在65℃被孵育90分鐘，並在孵育的過程中顛倒數次。短暫離心後加入500μl氯仿/異戊醇(24/1)，樣品被勻漿5分鐘。然後以7000rpm離心Eppendorf管10分鐘，將上清轉移到乾淨的Eppendorf管。通過加入1ml異丙醇，並在13000rpm離心10分鐘沉澱DNA。用500μl洗滌液(76％EtOH、0.2M NaOAc)洗滌沉澱20分鐘，然後是第二次洗滌(76％EtOH，0.01M NH4Oac)10分鐘。將沉澱風乾並溶解於100μl TE(1M Tris-HCl pH8，5M EDTA)。(CTAB＝溴化十六烷基三甲基銨)AFLP分析AFLP分析改編自Vos等人(1995)。使用限制酶MseI和EcoRI或用MseI和PstI限制性處理基因組DNA，將銜接子(adapter)(Proligo)與限制性處理的片段連接(銜接子序列被描述於Vos等人(1995)，EP0534858和US 6,045,994)。
銜接子序列MseI-銜接子5』GACGATGAGTCCTGAG3』 (SEQ ID NO1)3』TACTCAGGACTCAT 5』 (SEQ ID NO2)EcoRI-銜接子5』CTCGTAGACTGCGTACC 3』 (SEQ ID NO3)3』CTGACGCATGGTTAA 5』 (SEQ ID NO4)PstI-銜接子5』CTCGTAGACTGCGTACATGCA 3』 (SEQ ID NO5)3』CATCTGACGCATGT 5』 (SEQ ID NO6)通過向DNA樣品(30μl體積)中加入10μl限制性消化混合物(5UEcoRI、5U MseI、4μl OPA-緩衝液，用水補到10μl體積)和10μl銜接子連接混合物(50pMole MseI銜接子、50pMole EcoRI銜接子、1μl 10mMATP、1μl OPA-緩衝液、5U T4連接酶，用水補到10μl體積)，然後在37℃孵育4小時，在微滴定平板上在單反應中完成限制性消化和銜接子連接。用TE 0.1(10mM Tris-HCl pH8，0.1mM EDTA)將樣品稀釋10倍。
AFLP引物序列對應於Vos等人(1995)、EP 0534858和US 6,045,994(Proligo)。使用Hybaid Omnigene PCR循環儀[循環194℃中30秒(變性)、65℃中30秒(退火)、72℃中60秒(延伸)；循環2-13每循環的退火溫度降低0.7℃；循環14-3694℃中30秒、56℃中30秒、72℃中60秒]，在微滴定平板(Biozyme)中利用+1引物(具有1鹼基的選擇性延伸(extension))進行預擴增。預擴增混合物由5μl 10倍稀釋的DNA模板、25μl引物/dNTP混合物(10x＝750ngμl的每種引物、20μl 5mMdNTPs、200μl水)，20μl Taq聚合酶/緩衝液混合物(10x＝50μl 10×PCR緩衝液、2μl Taq聚合酶(5U/μl)、148μl水)組成，並被覆蓋50μl礦物油。對於選擇性的限制性片段擴增(使用預擴增的DNA作為模板)，使用了+3引物(具有3個鹼基的選擇性延伸)。
+1引物5』-GAC TGC GTA CCA ATT C|A-3』 E01(SEQ ID NO7)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|A-3』 M01(SEQ ID NO8)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|C-3』 M02(SEQ ID NO9)5』-GAC TGC GTA CAT GCA G|A-3』 P01(SEQ ID NO10)+3引物5』-GAC TGC GTA CCA ATT C|AA A-3』E31(SEQ ID NO11)5』-GAC TGC GTA CCA ATT C|AA C-3』E32(SEQ ID NO12)5』-GAC TGC GTA CCA ATT C|AC C-3』E36(SEQ ID NO13)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|CA C-3』M48(SEQ ID NO14)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|CA T-3』M50(SEQ ID NO15)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|CC A-3』M51(SEQ ID NO16)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|CT A-3』M59(SEQ ID NO17)5』-GAT GAG TCC TGA GTA A|CT G-3』M61(SEQ ID NO18)5』-GAC TGC GTA CAT GCA G|AA A-3』P31(SEQ ID NO19)5』-GAC TGC GTA CAT GCA G|AA T-3』P34(SEQ ID NO20)用γ33P-ATP標記EcoRI或PstI引物。反應混合物由5μl模板DNA(10x稀釋的預擴增產物)、5μl引物/dNTP混合物(10x＝50ng標記的引物、300ng未標記引物、8μl 5mM dNTP，用水補到50μl)、10μl Taq聚合酶/緩衝液混合物(10x＝20μl 10×PCR緩衝液、0.8μl Taq聚合酶、水補到100μl)以及20μl礦物油組成。10×PCR緩衝液由100mM Tris pH8.3、15mMMgCl2、500mM KCl組成。PCR循環與用於預擴增的一樣。
在4.5％的變性聚丙烯醯胺凝膠(2.5h、110W)上分離PCR產物，同時使用10-bp DNA梯度的序列標記(sequamark)。乾燥的膠被暴光過夜(Fujifilm，BAS-MS 2040 screens)並在Fuji BAS-2500掃描儀上掃描。使用AFLP-Quantar PRO軟體(KeyGene)分析數字凝膠圖像。
記錄多態性條帶(標記物)，並且基於與用來產生多態性條帶的特異+3引物組合來對AFLP標記物命名，其後是多態性條帶的近似分子量(通過與10bp梯度的比較而估計)。例如，E32/M50-M362.0是指大小約為362鹼基對、通過使用引物對E32和M50進行的選擇性限制片段擴增而產生的條帶。單態性標記物(即存在於所有植物中的具有確定大小的條帶)不予記錄。
在生長室實驗中BC3植物的表型分型(phenotyping)300株BC3植物在生長室試驗中被測試黑脛病抗性。實驗中還包括一些對照系，如栽培品種Kristina、Stellar、Surpass400和RFM292系(每系約40-50株植物)。
單孢子L.maculans(黑脛莖點黴)分離株Leroy1被用於疾病抗性實驗。Leroy1是一種加拿大分離株。此真菌分離株在25℃，黑暗中於V8瓊脂平板(1升＝800ml水、200ml V8液、0.75g CaCO3、15g Difco瓊脂、40mgRose Bengal和用於阻止細菌生長的100mg/l鏈黴素硫酸鹽)上生長1-2周，隨後在20℃於紫外光(14/10小時光/黑暗)下生長1-2周。用5ml無菌蒸餾水覆蓋平板，並用無菌玻璃棒釋放(losening)孢子，從而收集器孢子。孢子經尼龍網(45μm)過濾，在3500rpm下離心10分鐘，再懸浮於無菌蒸餾水。使用血球計測量孢子濃度，並且用無菌蒸餾水調節到107孢子/ml。孢子懸浮液被儲存於-20℃。
歐洲油菜植物的種子被表面滅菌，並播種於多罐盤中的標準土壤中，3周後再轉移到直徑為10釐米的罐中。植物在18-20℃(day)、14h/10h(光/暗)、70％相對溼度的條件下於生長室生長約2.5周，直到3片真葉出現。通過用針損傷最老的葉子接近莖的葉柄(約0.5cm的兩個傷口)，和用針在接近葉軸的莖上施加小且淺的一刺，而進行接種。10μl孢子懸浮液(107孢子/ml)被施用於損傷的莖。生長室的溼度持續3天保持100％rh。
9周後評估莖的症狀。外部和內部的症狀都被評分。外部症狀的評分是通過測量圍繞損傷(circumventing lesion)(環繞(girdling))(A)來進行的。內部症狀的評分是通過用剪刀(水平方向)剪斷莖的基部，評定表現出疾病症狀的莖直徑的百分數(B)，和通過測量內部損傷的長度(沿縱軸切開莖)(C)來進行的。所有關於莖的評分都是按照0(沒有症狀)到5(最嚴重的症狀，如完全環繞)的等級進行的。總體疾病分值被計算如下總莖分值＝1×A+2×B+2×C。總莖分值從0到25變化。敏感型對照(如Kristina)始終具有25的分值。
植物表現出不同的表型，並且可以根據總莖分值以12.5為臨界值被分為不同的類型。有147株植物對黑脛病是抗性(R)的，140株是敏感的(S)。因此，基於莖的抗性和敏感性以1∶1的比例(Chi2＝0.17)分離，這表明單一的顯性黑脛病抗性基因在BC3種群中發生分離，此基因被命名為「Lem-08-syl」。
集群分離子分析(BSA)為了鑑定與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物，根據Michelmore等人[(1991)，PNAS 889828-9823]的描述進行BSA。在以上生長室實驗中所測試的300株BC3植物的表型數據被用於選擇用於BSA的最具抗性和最具敏感性的株系。產生了四個(每庫5個個體)抗性個體庫和六個(每庫5個個體)敏感性個體庫。通過集合等量的預擴增產物而產生DNA庫。然後通過使用47個(+3)AFLP引物組合的AFLP分析測試DNA庫。
評價只在抗性庫中存在，而在(多數)敏感庫中不存在的多態性AFLP片段(標記物)。僅對以偶聯(coupling)的方式(即來自供體親本)與抗性連鎖的AFLP標記物進行記錄。對與敏感性(即排斥方式，來自回歸親本)連鎖的標記物不予記錄。發現有41個AFLP標記物在抗性和敏感性庫之間存在(部分)差別。選取了12個最佳的AFLP標記物(基於型式(pattern)的質量和在抗性和敏感性庫之間區別的最佳能力)來首先篩選BC3群體的以上集群中的43株植物個體(20株抗性和23株敏感性個體)，以便分析標記物的連鎖。
使用12個AFLP標記物和表型標記物(Lem-08-syl)，並使用JoinMapVersion 3.0[Van Ooijen和Vorrip，(2001)，JoinMap Version 3.0，遺傳連鎖圖譜計算軟體，Plant Research International，Wageningen，TheNetherlands]進行連鎖分析。使用JoinMap Version 3.0的默認參數，並使用Kosambi算法[Kosambi(1994)，Ann.Eugenet.12172-175]計算連鎖群中的標記物之間的成對重組頻率。也使用JoinMap Version 3.0的默認設置計算了相對標記物次序和標記物之間的距離。
連鎖分析將4個顯性AFLP標記物和Lem-08-syl分類在一個連鎖群上。另外7個AFLP標記物被分類於另一個隔離的組中，沒有被進一步考慮。存在於抗性植物庫而不存在於敏感植物庫的這四個連鎖的AFLP標記物是E32/M50-M362.0*、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6和E36/M51-M171.1*。其中有兩個標記物(標有*)是蕪青(B.rapa)特異的標記物，意味著在栽培作物歐洲油菜的相應位置沒有發現條帶，而該標記物則存在於二倍體蕪青物種。這表明Lem-08-syl是從野生型蕪青種質漸滲的。此兩標記物定位於內部(in-house)蕪青染色體R08圖譜上。因為R08相應於歐洲油菜中的N08，所以該歐洲油菜連鎖群被命名為N08[根據Sharpe等人(1995)，Genome 381112-1121]。
Lem-08-syl因此在歐洲油菜的圖譜上被作圖於染色體8(N08)末端，如下所示N08基於 43株BC3植物259株BC3植物E32/M50-M362.0*0.0 0.0Lem-08-syl4.7 6.6E32/M48-M162.710.8 14.4E31/M61-M237.613.2 19.1E36/M51-M171.1*15.5 23.2*蕪青特異的AFLP標記物基因座之間的遺傳距離以釐摩(cM)表示。
蕪青特異的AFLP標記物E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1位於Lem-08-syl側翼，確認了Lem-08-syl定位於從B.rapa ssp sylvestris漸滲的DNA片段上。
實施例2更緊密連鎖的AFLP標記物的產生為了產生與Lem-08-syl更為緊密連鎖的AFLP標記物，對BC3植物的附加庫(addition pools)進行BSA分析(如上描述)。使用+3 PstI/MseIAFLP引物組合產生並篩選新的抗性和敏感庫。鑑定了兩個額外的與Lem-08-syl連鎖的標記物P34/M48-M283.0和P31/M59-M97.1。P34/M48-M283.0還未在蕪青中作圖，但是發現其存在於蕪青中而不存在於歐洲油菜中，因此提供了另一蕪青特異的標記物。
實施例3使用259株BC3植物個體製作連鎖圖譜使用如上鑑定的6個AFLP引物組合(即E32/M50、P34/M48、P31/M59、E32/M48、E31/M61和E36/M51)對300株BC3植物中的259株進行AFLP分析。利用生長室實驗中所測試的300株BC3植物的表型數據(如上描述)和這些AFLP數據，使用JoinMap V3.0進行連鎖分析。
產生了以下遺傳圖譜N08E32/M47-M178.40.0E32/M50-M362.07.5Lem-08-syl12.2P34/M48-M283.017.9P31/M59-M97.1 19.3E32/M48-M162.721.4E31/M61-M237.626.0E36/M51-M171.129.3兩個已作圖的蕪青特異的AFLP標記物位於一個約21cM的區域的兩側，其在內部蕪青圖譜上被確認。
使用同樣的AFLP數據和300株BC3植物的總體黑脛病分值(定量分值)還進行了QTL作圖(區間作圖(interval mapping))。鑑定的QTL峰與Lem-08-syl在遺傳圖譜上的位置對應，並且解釋了77.8％的黑脛病抗性變化(LOD值為68.12，LOD閾值為3.0)(見


圖1)。
總之，鑑定了6個與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物。最緊密連鎖的AFLP標記物是E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0。
實施例4在DH作圖群體中確證連鎖的AFLP標記物為了確證在AFLP標記物E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0的存在(或缺乏)與Lem-08-syl抗性的存在(或缺乏)之間具有完全相關(perfectcorrelation)，於2001年在加拿大和澳大利亞的田間試驗中分析了DH系(描述於實施例1)的黑脛病抗性。
DH系也被篩選AFLP標記物E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0的存在。從每個DH系的兩個葉盤提取DNA，使用E32/M50和P34/M48引物組合進行AFLP分析(如上描述)。對於PC(引物組合)E32/M50和PC P34/M48分別出現約362bp或283bp的條帶被記錄為正號(+)。使用了來自歐洲油菜栽培品種Kristina和Stellar的DNA作為陰性對照。同時，已知不含有Lem-08-syl的BC1S3系(34B)也被包含作為陰性對照。陽性對照包含已知含有Lem-08-syl的BC1S3-45B系。根據AFLP分析，對植物系是否含有Lem-08-syl，以及是否抵抗黑脛病感染進行了預測。預測被以下田間試驗所確證。
AFLP分析結果


R＝黑脛病抗性，S＝黑脛病易感性，1＝基於標記物的存在/缺乏含有兩個側翼AFLP標記物的DH系被預測含有Lem-08-syl，因此也被預測具有黑脛病抗性。為了測試這些DH系的黑脛病抗性，進行了田間試驗。
在加拿大的田間試驗在加拿大，DH系的種子以單行形式播種並作兩個重複。計算兩個重複的平均黑脛病分值，並示於下表。同時包括如Kristina、Stellar、Westar、Quantum、Dunkeld和/或Oscar之類的對照系。在成熟時以1到9的等級(採納自NIAB)評估每行的黑脛病抗性。
黑脛病分值1＝大部分植物死亡2-3＝有顯著比例的植物已死亡或將死4-6＝大部分植物在莖的基部發生潰瘍，但是少有植物死亡7-8＝在莖的基部有少量潰瘍，少有或沒有植物死亡9＝沒有外部的莖潰瘍症狀，沒有植物死亡


R＝黑脛病抗性，S＝黑脛病敏感性，(1)＝基於標記物的存在/缺失如上表所示，根據Lem-08-syl兩側AFLP標記物的存在所預測的黑脛病抗性表型被加拿大田間試驗所確證。
在澳大利亞的田間試驗選擇的DH系和各種對照系的種子被播種於澳大利亞的兩個地點。兩個地點都在商業Canola作物的茬地中進行播種，以提供高水平的疾病壓力。
在兩個地點，以3米的單行形式播種，進行兩個重複。在每一地點，黑脛病感染被評估兩次，一次在開花時，一次在成熟時。以1到9的等級，對每一行的抗性進行視覺評估。計算兩個重複的平均值。
黑脛病分值1＝大部分植物死亡2-3＝有顯著比例的植物已死亡或將死4-6＝大部分植物在莖的基部發生潰瘍，但是少有植物死亡7-8＝在莖的基部有少量潰瘍，少有或沒有植物死亡9＝沒有外部的莖潰瘍症狀，沒有植物死亡如下表所示，含有連鎖的AFLP標記物並被預測具有黑脛病抗性的DH系在田間在開花時也被觀測到了對黑脛病感染的抗性。一個例外是DH系77-3-6，它具有統計學不顯著的高於平均值的抗性，被歸為「中間體」。


S＝易感性，R＝抗性，I＝中間體，1＝基於連鎖AFLP標記物的存在/缺乏*＝顯著低於平均值的抗性***＝顯著高於平均值的抗性如下表所示，所有含有連鎖的AFLP標記物並被預測具有黑脛病抗性的株系在田間成熟時期也能抵抗黑脛病感染(DH系77-3-6再次成為例外)，雖然抗性水平在成熟時(即接近生長季節結束時)低於開花時期(星號的意義如上)。


總之，田間試驗的數據表明只要DNA中存在位於Lem-08-syl側翼的這兩個AFLP標記物，植物就能抵抗黑脛病感染。數據因此確證AFLP標記物與Lem-08-syl連鎖，並且它們可以被用於預測植物表型。
在基因組中含有Lem-08-syl和連鎖的AFLP標記物(包括蕪青特異的標記物)的DH系77-3-12的種子在2003年8月22日由Bayer BioScienceN.V.以保藏號PTA-5410保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC，10801University Blvd，Manassas，VA 20110-2209，USA)(種子的存活於2003年8月29日被確認)。
實施例5「Lem-08-syl AFLP鑑定方案」表明在商業可獲得的歐洲油菜栽培作物中缺乏Lem-08-syl使用與Lem-08-syl連鎖的標記物的AFLP分析(如實施例1所描述的)在下文稱為「Lem-08-syl AFLP鑑定方案」。在本發明一個實施方案中，使用如(但不限於)E32/M50-M362.0或E36/M51-M171.1之類的蕪青特異的AFLP標記物和/或連鎖的歐洲油菜標記物(例如P34/M48-M283.0)實施Lem-08-syl AFLP鑑定方案。
為了確證在一系列可獲得的歐洲油菜栽培作物中缺乏Lem-08-syl，使用引物組合(PC)E32/M50、PC E36/M51和PC P34/M48進行Lem-08-sylAFLP鑑定方案(見實施例1的描述)。
此方案對於合併的植物組的結果為

注釋正號(+)＝出現預期大小的片段(條帶)負號(-)＝沒有出現預期大小的片段(條帶)
ND未做POOL1Tapidor+Doubol+MohicanPOOL2Columbus+Aglona+ApachePOOL3Falcon+Silex+KanaPOOL4Express+Apex+BristolPOOL5Vivol+Polo(W)+OrientPOOL6Mandarin+Sh7+Wuhac96.40006POOL7Wuh5365+NAN93-1046+LE043-3POOL8Yu-dal+Wuhan96.40005+Sh97.1020POOL9Monty+Narendra+DrakkarPOOL10Kristina+SpokPOOL11Acrobat+Cyclone+Stellar此外，還使用AFLP標記物E32/M50-M362.0、P34/M48-M283、E36/M51-M171.1對以下品種Surpass400、Hyola60、Hyola50、Apex、Excel、Maluka、Quantum進行AFLP分析，確證了在其它植物品種中缺乏Lem-08-syl。在這一分析中，陽性對照品種(包括上述含有Lem-08-syl的DH系)如預期的表現出此抗性基因的存在。
以上結果表明商業冬油料種子油菜(WOSR)栽培品種和春油料種子油菜(SOSR)栽培品種(如Surpass400、Hyola60、Hyola50等等)不含有蕪青特異的AFLP標記物E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1，這確證了這些栽培品種缺乏蕪青染色體8上的包含Lem-08-syl的特異DNA片段。
實施例6繪製Surpass400黑脛病抗性基因座的圖譜為了對存在於Surpass400中的抗性基因座作圖，通過黑脛病感染易感性加拿大歐洲油菜品系與Surpass400(Pacific Seeds(Advanta)的商業黑脛病抗性栽培品種)的雜交產生了一個DH群體。Surpass400的黑脛病抗性明顯來自B.rapa ssp sylvestris與B.Oleracea ssp alboglabra的雜交[Li等人(2001，前引文)]。此DH群體的抗性於2002年在澳大利亞的田間試驗中被評估。開展AFLP分析以對黑脛病抗性作圖。
通過QTL分析可以繪製出3個抗性基因座的圖譜-一個主效基因座，定位於染色體N10上(A基因組)，這裡稱為Lem-10-syl，-一個基因座，定位於染色體N07上(A基因組)，這裡稱為Lem-07，-一個基因座，定位於染色體N14上(C基因組)，這裡稱為Lem-14。
在染色體N08上沒有發現抗性基因座。這些數據確證了Lem-08-syl並不存在於Surpass400中，雖然根據出版的信息，Surpass400也明顯含有來自野生型B.rapa ssp sylvestris的黑脛病抗性。
在所有3個基因座具有來自Surpass400親本的抗性等位基因的植物具有7-8的黑脛病抗性分值(基於以上描述的1-9的等級)，因此是抗性的。在所有3個基因座具有加拿大親本的等位基因的植物具有3-4的黑脛病抗性分值，因此是易感的。
有可能黑脛病抗性基因座Lem-10-syl來自B.rapa ssp sylvestris(這將證實Rimmer等人的數據)，而Lem-07和Lem-14更可能來自歐洲油菜。有趣的是，沒有在染色體N02上發現抗性基因座，雖然Yu等人[Plant，AnimalMicrobe Genomes Jan 12-16，2002，Poster 460]描述了在染色體N02上存在來自蕪青的黑脛病抗性基因座。
實施例7Lem-08-syl與其它黑脛病抗性基因座的累積為了產生具有強烈和持久的黑脛病抗性的植物，不同的抗性基因座和抗性等位基因被組合於單個植株中(稱作抗性的堆疊(stack)或累積(pyramid))。在這一實施例中，Lem-08-syl與存在於Surpass400的抗性基因座(即Lem-10-syl、Lem-07和Lem-14)組合。
(a)開發含有Lem-08-syl抗性和Surpass400抗性的種群若干Surpass400植物被人工去雄，並與來自F2種群99-AN13的4-5株植物的花粉雜交。該99-AN13種群是具有Lem-08-syl的分離種群(segregating population)。
(b)種群的進一步發展少量的F1植物於2001年於高疾病壓力下生長。兩株表現出抗性表型的植物被自交和選擇。進一步的，F2和F3植物被自交，進行單植株選擇。只選取表現出抗性表型的植物。
為了確定觀測到的田間抗性是否是由於Lem-08-syl與一個或多個Surpass400抗性基因座的聯合存在所致，用與不同基因座連鎖的分子標記物(即例如與Lem-08-syl連鎖的標記物和與Lem-10-syl連鎖的標記物)篩選植物。選擇含有期望的抗性基因座組合的各單植株，而其它植物則被拋棄。
實施例8雜種種子生產方法以不同方式開發含有堆疊的黑脛病抗性的雜種歐洲油菜種子。
方案1抗性基因座在雜種種子中堆疊開發雄性不育(MS)雌性親本，該親本具有整合進其基因組的處於絨氈層特異啟動子pTA29控制下的芽孢桿菌RNA酶基因，並進一步在染色體N08上含有Lem-08-syl。為了開發這一雌性親本，用含有可操作地連接於芽孢桿菌RNA酶基因的pTA29的嵌合基因轉化含有Lem-08-syl的植物，或者含有可操作地連接於芽孢桿菌RNA酶基因的pTA29的雄性不育轉基因植物與含有Lem-08-syl的植物雜交。
開發雄性親本(RF)，在其基因組中含有pTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑，以及Lem-10-syl和/或其它黑脛病抗性基因座。
為了開發雜種種子，將MS親本與RF親本雜交，從雌性親本中收穫雜種種子。從這些種子生長起來的植物具有完全的育性，並在其基因組中含有Lem-08-syl和/或其它抗性基因座。
方案2在雌性親本(MS)中堆疊抗性基因座開發雄性不育(MS)的雌性親本，該親本具有整合進其基因組的處於絨氈層特異啟動子pTA29控制下的芽孢桿菌RNA酶基因，並進一步在其基因組中含有幾個黑脛病抗性基因座，如位於染色體N08的Lem-08-syl、位於染色體10的Lem-10-syl和/或其它基因座。為了開發這一雌性親本，用含有可操作連接於芽孢桿菌RNA酶基因的pTA29的嵌合基因轉化含有幾個黑脛病抗性基因座的植物，或者含有可操作連接於芽孢桿菌RNA酶基因的pTA29的雄性不育轉基因植物與在其基因組中含有幾個黑脛病抗性基因座的植物雜交。
開發在其基因組中含有pTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑的雄性親本(RF)。
為了開發雜種種子，將MS親本與RF親本雜交，從雌性親本中收穫雜種種子。從這些種子生長起來的植物具有完全的育性，並在其基因組中含有Lem-08-syl以及Lem-10-syl或其它抗性基因座。
此外，還開發出另兩個方案，這些方案是1)除以下不同點與上述方案1一致的方案，不同點在於Lem-08-syl抗性基因存在於RF植物中，和2)除以下不同點與上述方案2一致的方案，不同點在於Lem-08-syl抗性基因存在於RF植物中。
所有的方案被用於發展純雜種，所述雜種在它們的基因組中含有若干黑脛病抗性基因座。
相似的，可以發展僅含有Lem-08-syl的雜種種子。
實施例9Lem-08-syl向其它芸苔屬原種系的轉移通過以下方法將Lem-08-syl轉移到其它原種品系。含有Lem-08-syl的植物(供體植物，如來自以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的種子的植物)與缺乏Lem-08-syl的原種歐洲油菜系(原種親本/回歸親本)或品種雜交。使用以下的漸滲方案(Lem-08-syl被縮寫為N08)起始雜交 N08/N08(供體植物)×wt/wt(原種親本)F1植物N08/wtBC1雜交 N08/wt×wt/wt(回歸親本)
BC1植物 50％N08/wt和50％wt/wt使用與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物選擇此50％的N08/wtBC2雜交 N08/wt(BC1植物)×wt/wt(回歸親本)BC2植物 50％N08/wt和50％wt/wt使用與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物選擇此50％的N08/wt反覆回交直到BC6BC6植物 50％N08/wt和50％wt/wt使用與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物選擇此50％的N08/wtBC6 S1雜交 N08/wt×N08/wtBC6 S1植物 25％N08/N08和50％N08/wt和25％wt/wt使用與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物選擇含有N08的植物來自個體BC6 S1植物的後代待測種子被測試Lem-08-syl的分離，以篩選Lem-08-syl純合的(N08/N08)BC6 S1植物。這些植物之後被用於生產種子。
在上述漸滲方案中，在每一代測試回交材料中與Lem-08-syl連鎖的AFLP標記物的存在，並選擇含有Lem-08-syl的株系。可以在田間試驗中測試植物的黑脛病抗性，並可以選擇具有高抗性的植物，以代替用連鎖的AFLP標記物測試Lem-08-syl的存在。然而，只有當Lem-08-syl將要漸滲入的原種系未含有高水平的黑脛病抗性時，這才是可行的。例如，如果原種系是具有非常高黑脛病抗性的Surpass400，則需要進行針對Lem-08-syl的標記物輔助的選擇(標記物輔助的育種)，因為在田間選擇含有期望的抗性基因座組合的材料極其困難。而如果原種親本是易感系，或至少抗性不如含有Lem-08-syl的株系，則上述方案中的MAS(分子輔助的選擇)可以被高黑脛病壓力下的田間選擇所替代。
序列表110拜爾生物科學公司(Bayer BioScience N.V.)120對Leptosphaeria maculans(黑脛病)真菌具有抗性的芸苔屬植物130BCS 03-200616020170PatentIn version 3.2210121116212DNA213人工序列220
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權利要求
1.在染色體8上含有蕪青染色體片段的芥菜植物，其中所述片段包含黑脛病抗性基因。
2.含有蕪青染色體R08的片段的芥菜植物，其中所述片段包含黑脛病抗性基因。
3.在染色體8上含有蕪青染色體片段的歐洲油菜植物，其中所述片段含有黑脛病抗性基因，並且其中所述歐洲油菜植物選自-含有整合進其基因組的轉基因的歐洲油菜植物；-含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與Surpass400植物的雜交；-在乾燥、脫脂的種子粉中含有的脂肪族芥子油苷的水平低於30mmol/g的歐洲油菜植物；-其種子的固體成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羥基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羥基-4-戊烯基-芥子油苷之任何一種或任何混合物的含量少於30微摩爾/克風乾無油固體的歐洲油菜植物；-產生的油(粉碎種子後)中芥子酸的含量少於油中總脂肪酸的2％的歐洲油菜植物；-歐洲油菜春油料種子油菜植物；-歐洲油菜冬油料種子油菜植物；-在N2染色體上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；-在N10染色體上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；-不含有作圖於染色體2和染色體10上的抗性基因的歐洲油菜植物，其中所述抗性基因來自B.rapa ssp sylvestris；-含有能引起植物雄性不育的轉基因，優選芽孢桿菌RNA酶基因的歐洲油菜植物；-含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與以下油料種子油菜品種中任一種的雜交除草劑抗性歐洲油菜品種、種子中具有高油含量的歐洲油菜品種、種子中具有高油酸含量的歐洲油菜品種、種子中具有低亞麻酸含量的歐洲油菜品種、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育轉基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
4.含有蕪青染色體R08的片段的歐洲油菜植物，其中所述片段含有黑脛病抗性基因，並且其中所述歐洲油菜植物選自-含有整合進其基因組的轉基因的歐洲油菜植物；-含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與Surpass400植物的雜交；-在乾燥、脫脂的種子粉中含有的脂肪族芥子油苷的水平低於30mmol/g的歐洲油菜植物；-其種子的固體成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羥基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羥基-4-戊烯基-芥子油苷之任何一種或任何混合物的含量少於30微摩爾/克風乾無油固體的歐洲油菜植物；-產生的油(粉碎種子後)中芥子酸的含量少於油中總脂肪酸的2％的歐洲油菜植物；-歐洲油菜春油料種子油菜植物；-歐洲油菜冬油料種子油菜植物；-在N2染色體上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；-在N10染色體上不含有黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物；-不含有作圖於染色體2和染色體10上的抗性基因的歐洲油菜植物，其中所述抗性基因來自B.rapa ssp sylvestris；-含有能引起植物雄性不育的轉基因，優選芽孢桿菌RNA酶基因的歐洲油菜植物；-含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物的後代，其中所述後代來自含有所述黑脛病抗性基因的歐洲油菜植物與以下油料種子油菜品種中任一種的雜交除草劑抗性歐洲油菜品種、種子中具有高油含量的歐洲油菜品種、種子中具有高油酸含量的歐洲油菜品種、種子中具有低亞麻酸含量的歐洲油菜品種、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育轉基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
5.權利要求1-4中任一項的植物，其中所述黑脛病抗性基因已經通過遺傳轉化轉移到所述植物中。
6.權利要求1-5中任一項的植物，其中所述蕪青是B.rapa ssp.sylvestris。
7.權利要求1-6中任一項的植物，其中所述抗性基因包含Lem-08-syl。
8.權利要求7的植物，其中所述Lem-08-syl與至少一種選自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6、E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1的AFLP標記物相關聯。
9.權利要求8的植物，其中所述Lem-08-syl與AFLP標記物E32/M50-M362.0或AFLP標記物E36/M51-M171.1相關聯。
10.權利要求7的植物，其中所述Lem-08-syl與至少一種選自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6的AFLP標記物相關聯。
11.來自以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的種子的歐洲油菜植物。
12.權利要求1-11中任一項的植物，進一步在其基因組中包含位於不同染色體上的至少一個額外的黑脛病抗性基因。
13.權利要求12的植物，其中所述額外的抗性基因位於染色體N10、N14和/或N7上，或所述額外的抗性基因來自以下任一種歐洲油菜栽培品種Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60和Surpass400。
14.權利要求12或13的植物，其中所述額外的黑脛病抗性基因座來自蕪青。
15.權利要求1-14中任一項的植物，其中所述植物在其基因組中還含有處於絨氈層特異啟動子控制下的芽孢桿菌RNA酶基因。
16.權利要求1-15中任一項的植物的種子，其含有所述黑脛病抗性基因。
17.權利要求16的種子，其中所述種子是雜種種子。
18.以保藏號PTA-5410保藏於ATCC的種子。
19.產生在基因組中含有幾個抗性基因座的雜種歐洲油菜種子的方法，包括-用歐洲油菜植物的花粉對雄性不育的權利要求1-15中任一項的植物授粉，其中所述歐洲油菜植物(a)在其基因組中含有處於絨氈層特異的啟動子控制下的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，和(b)在染色體N10、N07和N14中任一染色體上含有黑脛病抗性基因，和-從所述雄性不育植物收穫雜種種子。
20.產生雜種歐洲油菜種子的方法，包括-用在其基因組中含有處於絨氈層特異的啟動子控制下的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的歐洲油菜植物的花粉對雄性不育的權利要求1-15中任一項的植物授粉，和-從所述雄性不育植物收穫雜種種子。
21.含有蕪青染色體R08的片段的雜種歐洲油菜種子，其中所述片段包含黑脛病抗性基因座，其中所述雜種歐洲油菜種子發育成植株，所述種子的固體成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羥基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羥基-4-戊烯基-芥子油苷之任何一種或任何混合物的含量少於30微摩爾/克風乾無油固體。
22.權利要求21的雜種種子，其中所述黑脛病抗性基因位於染色體N08上。
23.來自權利要求21或22的雜種種子的植物。
24.增加黑脛病抗性持久性的方法，包括在歐洲油菜植物基因組中組合至少兩個，優選至少3個黑脛病抗性基因座，其中所述抗性基因座是Lem-08-syl和Lem-10-syl或Lem-07。
25.權利要求24的方法，其中所述基因組是A基因組。
26.將權利要求3或4的黑脛病抗性基因轉移進其它歐洲油菜植物中的方法，包括將權利要求3或4的植物與其它歐洲油菜植物雜交，收集來自所述雜交的F1雜種種子，將來自所述F1種子的F1植物自交或雜交一代或多代，並篩選來自所述自交或雜交的植物是否存在所述的蕪青染色體片段，以及選擇含有所述片段的植物。
27.權利要求26的方法，其中所述篩選是利用與所述黑脛病抗性基因座連鎖的分子標記物進行的。
28.權利要求27的方法，其中所述篩選根據Lem-08-syl AFLP鑑定方案進行。
29.檢測Lem-08-syl在歐洲油菜或芥菜組織或種子的DNA中存在與否的方法，包括實施Lem-08-syl AFLP鑑定方案。
30.用於在歐洲油菜或芥菜DNA樣品中檢測Lem-08-syl的試劑盒，其中所述試劑盒含有一個或多個能夠擴增與Lem-08-syl連鎖的DNA標記物的PCR引物對。
31.權利要求30的試劑盒，其中所述PCR引物對選自引物對E32/M50、P34/M48、P31/M59、E32/M48、E31/M61和E36/M51。
32.權利要求31的試劑盒，其中所述引物對能夠分別擴增約362bp、283bp、97bp、162bp、237bp或171bp的DNA片段。
33.權利要求30到32中任一項的試劑盒，其還包含種子或組織，其中提取自所述種子或組織的DNA可以被用作陽性或陰性對照。
34.用於歐洲油菜的AFLP標記物，其選自E32/M50-M362、E36/M51-M171.1、P34/M48-M283。
35.AFLP標記物E32/M50-M362、E36/M51-M171.1、P34/M48-M283、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6中任一種在監測Lem-08-syl在芸苔屬油料種子植物中的漸滲中的用途或在芸苔屬油料種子植物的AFLP分析中的用途。
36.AFLP標記物E32/M50-M362、E36/M51-M171.1或P34/M48-M283在監測Lem-08-syl在歐洲油菜中的漸滲中的用途。
37.來自以保藏號PTA-5410保藏的種子的植物細胞，此植物細胞在適當的培養基中體外培養後產生在染色體N08上具有黑脛病抗性基因的植物，所述抗性基因來自蕪青。
38.權利要求1-15中任一項的植物在生產油料種子菜籽油或油料種子菜籽餅中的用途。
39.權利要求1-15中任一項的植物在生產染色體8上具有黑脛病抗性基因的種子中的用途，其中所述抗性基因來自蕪青。
40.權利要求1-15中任一項的植物在生產染色體8上具有黑脛病抗性基因的油料種子油菜作物中的用途，其中所述抗性基因來自蕪青。
41.權利要求19、20和24到28中任一項的方法，其還包括選自如下的步驟獲得在染色體8上含有黑脛病抗性基因的加倍單倍體植物、體外栽培、克隆或無性繁殖。
全文摘要
本發明涉及真菌疾病抗性，特別是針對由Leptosphaeria maculans引起的黑脛病疾病的抗性。提供基因組中含有野生型蕪青種質染色體8的片段的芸苔屬植物和種子，其中此片段含有黑脛病抗性基因座。進一步提供與所述黑脛病抗性基因座連鎖的分子標記物和使用這些標記物的方法。還提供具有堆疊的黑脛病抗性基因座的芸苔屬植物和種子。
文檔編號A01H5/10GK1653883SQ200410102880
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者E·迪德裡克森, B·拉加, J·博特曼 申請人:拜爾生物科學公司