HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c的製作方法

2023-10-09 07:03:44

專利名稱：HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c的製作方法
技術領域：
本發明涉及HIV感染預後診斷領域，具體來說涉及ー種HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c，其可應用於在HIV感染早期進行預後評估，以給患者及時有效地隨訪、治療等幹預措施，以延長生存時間，提聞生存質量。
背景技術：
microRNA (miRNA)是近年來的研究熱點,它是ー種廣泛存在於真核生物中的單鏈小分子RNA，不具編碼功能，但它能夠結合於基因序列的側翼區域阻遏或抑制靶mRNA的翻譯，具有高度的保守性、時序性和組織特異性，目前在腫瘤、血液病、病毒感染等多種疾病的臨床診斷、治療及預後評價等領域發揮了重要作用。

愛滋病是ー個世界性的重大傳染病，嚴重威脅人們的健康和影響經濟社會的發展。HIV感染後，疾病進展速度不同，一般經8-10年進入愛滋病期，稱為「典型進展者」。但10%的感染者，在感染三年甚至一年內⑶4+T細胞顯著下降至350個/微升以下，稱為「快速進展者」。如快速進展者診斷後不能定期隨訪及儘早治療，則發病率及死亡率將持續上升，且增加傳播風險。目前，我國經性途徑HIV感染者不斷増加，男男性接觸中快速進展者比例較高，如果在HIV感染早期能對預後進行有效預測，區分快速進展者及典型進展者，個體化合理安排病人的隨訪及治療，不僅可以提高HIV感染者的生存時間及生存質量，對國家的愛滋病防治工作亦具有重要意義。目前，HIV感染疾病進展及預後評價的方式主要有以下幾種CD4+T細胞數量、病毒載量、免疫活化等其他指標。CD4+T細胞數量是HIV感染的靶細胞，可有效反映機體免疫狀態，但其檢測需要流式細胞儀，儀器及相應試劑價格昂貴，技術要求高，不適合普遍開展，且快速進展者及典型進展者在HIV感染早期，CD4+T細胞數量差異不夠顯著，不易對未來的疾病進展進行有效預測；病毒載量在HIV感染早期波動較大，且並不與臨床免疫狀態完全平行；免疫活化等指標雖有報導可預測疾病預後，但對設備要求高，需要專業人員的分析，標本最好選用新鮮標本，儲存運輸不便，難以推廣。近年來的研究表明，HIV感染和miRNA密切相關，miRNA可以通過作用於病毒本身或作用於免疫系統從而影響疾病進展，因此對HIV感染疾病進展的診斷也可能有相應的作用。與HIV感染相關的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在HIV感染後miRNA普遍下調，miR-17/92基因簇可抑制HIV感染等。雖然已在該領域進行了ー些研究，但是HIV感染早期疾病快速進展者的miRNA表達變化目前還沒有研究，在臨床和研究中，需尋找可有效預測疾病預後的miRNA標誌物。

發明內容
本發明提供了一種新的HIV感染疾病進展相關的miRNA作為疾病進展的分子標誌物，該 miRNA 為 miR-200c，其序列為 5』-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3』 (SEQ ID NO: I)。發明人發現，miR-200c在HIV感染早期(120天)快速進展者外周血單個核細胞中的含量相比典型進展者明顯降低，可以預測感染一年後疾病進展情況，由此可見，降低的miR-200c與HIV感染疾病進展及預後密切相關。在上述發現的基礎上，本發明提供了 miR-200c在製備診斷HIV感染疾病進展的診斷試劑中的用途。具體地，所述診斷試劑通過檢測被試者外周血單個核細胞中miR_200c的含量，並與HIV感染典型進展者平均水平相比較來診斷HIV感染疾病進展，其中，miR-200c在HIV感染快速進展者外周血單個核細胞中的含量相對於典型進展者顯著下降。在ー個特定的實施方案中，使用定量PCR的方法來檢測被試者外周血單個核細胞中miR-200c含量。本發明還提供了一種診斷HIV感染疾病進展的診斷試劑盒，其包括(I)外周血單個核細胞總RNA提取試劑， (2) RNA 加 polyA 試劑，(3) RT-PCR 試劑，(4)定量 PCR 試劑。其中，定量PCR試劑中包括HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c的特異性正向引物，優選地，其序列為 5』 -GTAATAGTGCCCGGTAA-3』 (SEQ ID NO :7)。在ー個特定的實施方案中，所述外周血單個核細胞總RNA提取試劑中包括序列為5，-CAACCTCCTAGAAAGA-3』 (SEQ ID NO :2)的 External Control-1 ;所述 RNA 加 polyA 試劑中包括序列為 5』-TGAGCAACGCGAACAA-3』 (SEQ ID NO :3)的 External Control-2 ;所述RT-PCR 試劑中包括序列為 5』 -CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3』 (SEQ ID NO 4)的RT-Primer (其中，V為A或C或G，N為A或T或C或G);所述定量 PCR 試劑中包括序列分別為 5』 -CTCACACGACTCACGACAC-3』 (SEQ ID NO :5)和 5』 -CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3』 (SEQ ID NO :6)的通用反向引物 UPM-short 和UPM-long。使用本發明的HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c診斷HIV感染疾病進展具有操作簡單，安全無創傷，高特異性，高靈敏性以及易於大量篩查的特點。
具體實施例方式I.外周血單個核細胞中總RNA的提取抽取11名HIV感染快速進展者感染120天5ml血液，同時抽取6名HIV感染疾病典型進展者及4名正常人對照血液各5ml作為對照，密度梯度離心法收集外周血單個核細胞,用PBSlml重懸細胞，置於I. 5ml的RNase/DNase-free離心管中。使用RNA提取試劑盒(北京曠博生物技術有限公司)自外周血單個核細胞中提取總RNA,每250 ii I外周血單個核細胞中加入I U I (20nM)序列為5』-CAACCTCCTAGAAAGA-3』(SEQ ID NO :2)的External Control-I (上海生エ生物工程技術有限公司合成)來監控外周血單個核細胞中RNA的提取質量。提取的總RNA使用Thermo NanoDrop2000c測定濃度。2.三步法定量檢測外周血單個核細胞中的miRNA(I)加 polyA 尾:i.在無RNA酶的PCR管(Axygen公司，200 ii I)中配製加polyA尾的反應液，體系為 20 ii I。姆 20 ii I 體系中加入 I U I (20nM)序列為 5』 -TGAGCAACGCGAACAA-3』 (SEQ IDNO 3)的External Control-2 (上海生エ生物工程技術有限公司合成)來監控miRNA的加
尾及反轉錄質量。
組分Ml入Ift(Iil)
External Co_i-2 (20nM)I
E.Coli polyA polymerase0.5
E.Coli polyA polymerase I O^Buffer2dATP (IOmM)2
UMAVS\iHI\A.
RNase - free water14-x
RNase Inhibitor0.5
—總律積_ 20 _(注加入的RNA體積由RNA的濃度確定，x=500ng/RNA濃度，本實驗所使用的酶均為北京曠博生物技術有限公司的產品。)ii.將裝有配置好反應液的PCR管放入PCR儀(Thermo)中37°C孵育I小時。(2 ) RT-PCR 得到 cDNA 單鏈i.向(I)得到的反應液中加入 0. 5u I (0. 5ng/iil)序列為 5，-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3』 (SEQ ID NO :4)的 RT-Primer (上海生エ生物工程技術有限公司合成)，70°C孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。ii.配製反轉錄反應液
紐分加入i'lt(pl)
M-MLV Reverse TranscriptaseI
M-MLV Reverse Transcriptase Sxbuffer8dNTP mix (IOmM)2
RNase InhibitorI
RNase-free water8
總休枳20(注所用產品均為北京曠博生物技術有限公司的產品。)iii.將i與ii得到的溶液混合，50°C孵育50min後70°C保溫15min，置冰上冷卻，得到cDNA。iv.將iii得到的產物稀釋至I U I體系中含有Ing總RNA的反轉錄產物，分裝後-20°C保存。(3)qPCR 定量檢測i.在2ml EP管(Axygen公司)中配製反應液
權利要求
1.ー種HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c，其序列如SEQ ID NO 1所示。
2.權利要求I所述HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c在製備HIV感染預後的診斷試劑中的用途。
3.權利要求2所述用途，其中，所述診斷試劑通過檢測被試者外周血單個核細胞中miR-200c的含量，並與HIV感染典型進展者平均水平相比較來判斷HIV感染疾病進展。
4.權利要求3所述用途，其中，miR-200c在HIV感染快速進展者外周血單個核細胞中的含量相對於典型進展者顯著下降。
5.權利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法來檢測被試者外周血單個核細胞中miR-200c 含量。
6.一種診斷HIV感染疾病進展的診斷試劑盒，其包括 (1)外周血單個核細胞總RNA提取試劑，(2)RNA 加 polyA 試劑，(3)RT-PCR 試劑， (4)定量PCR試劑； 其中，定量PCR試劑中包括權利要求I所述HIV感染疾病進展標誌物miR-200c的特異性正向引物。
7.權利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述外周血單個核細胞總RNA提取試劑中包括序列為 SEQ ID NO 2 的 External Control-I
8.權利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述RNA加polyA試劑中包括序列為SEQID NO:3的 External Control-2。
9.權利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述RT-PCR試劑中包括序列為SEQID NO :4的RT-Primer0
10.權利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述定量PCR試劑中包括序列分別為SEQIDNO 5和6的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
11.權利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c的特異性正向引物的序列如SEQ ID NO 7所示。
全文摘要
本發明提供了一種HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c，及其在製備HIV感染疾病進展診斷試劑中的用途。HIV感染快速進展者miR-200c在外周血單個核細胞中的含量比典型進展者外周血單個核細胞中的含量低，能夠預測感染一年後疾病進展程度。本發明還提供了一種診斷HIV感染疾病進展的診斷試劑盒。使用本發明的HIV感染疾病進展分子標誌物miR-200c診斷疾病進展具有操作簡單，安全無創傷，高特異性，高靈敏性以及易於大量篩查的特點。
文檔編號C12N15/113GK102839173SQ20121030584
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者尚紅, 李啟靖, 張子寧, 徐俊傑, 付雅靜 申請人:中國醫科大學附屬第一醫院, 北京曠博生物技術有限公司