一種生物鹼的抗癌應用的製作方法

2023-10-09 12:53:59 2

專利名稱：一種生物鹼的抗癌應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物鹼，尤其是涉及一種生物鹼Exfoliazone的抗癌應用。
背景技術：
孤兒受體Nur77 (又稱為TR3或NGFI-B)，是核受體超家族的重要成員，它也是一種 立刻早期基因，其表達可以被血清、生長因子、十四烷醯佛波醋酸酯-13(TPA)以及鈣信號 迅速誘導(Zhang XK. et. al. , Expert Opin Ther Tar 2007 ；11 69~79 ；Mo 11 UM, et. al., Oncogene 2006 ；25 =4725-4743) 0 Nur77最初被認為是一種細胞存活因子，它可以從介導多 種存活信號通路，包括蛋白激酶A、蛋白激酶C、MAPK和NF-KB通路。Nur77表達的促生長作 用在多種腫瘤中都被證實(Chen GQ, et. al.，Int J Cancer 2002 ；99 171-8 ；Wu Q，et. al.， Carcinogenesis 2002 ；23 1583-1592)，已有報導表明，Nur77的mRNA在癌組織中的表達水 平明顯高於癌旁組織。最近，越來越多的證據表明，Nur77同時也是一種促凋亡分子。Nur77對凋亡的 作用首先在未成熟的胸腺細胞和T-細胞雜交瘤通過T-細胞受體信號的凋亡中被報導。 Nur77對細胞凋亡的作用已在多種類型的癌細胞中被證實，它可以對多種凋亡因子，如鈣 離子載體、依託泊甙(VP-16)、佛波酯、鎘以及 l，l-Bis(3，-indoly)-1-(p-subsatituted phenyl)methanes 做出應答(Stasik I，et. al. ,BBA-Mol Cell Res 2007 ； 1773 1483-1490 ； Gennari A, et.al. , Toxicol ApplPharmacol 2002 ；181 :27_31 ；Liu S, et. al. , World J Gastroenterol 2002 ；8 446-450 ；Wilson AJ, et. al.，Cancer Res 2003 ；63 5401-5407 ； Chintharlapalli S, et. al.，J Biol Chem 2005 ；280 :24903_24914·)。Nur77 的凋亡效應 具有臨床上的價值，當以環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼對病人進行治療時，瀰漫性大B細胞 淋巴瘤病人的存活率和Nur77亞家族成員Nor-I的表達水平相關(Shipp MA, et. al.，Nat Med 2002；8 :68_74·)。調控Nur77的增殖作用和凋亡作用的生物活性機制之一是通過Nur77的亞細胞定 位來實現的。Nur77通過其在細胞核中的作用實現生長促進，這一作用需要Nur77與靶基因 DNA反應調控元件相結合，即Nur77在細胞核內的轉錄激活作用具有誘導細胞增殖的功能。 而Nur77的凋亡作用不依賴於轉錄，在其DNA結合結構域缺失時，這種凋亡誘導作用仍可發 生。生物鹼Exfoliazone是一種從海洋生物中提取的生物鹼，Kimai等(KIMAI S. et al. , Isolationand structure of a new phenoxazine antibiotic, ^ ^Μ Exfoliazone, produced by Streptomycesexfoliates. Journal of Antibiotics,1990,43(12) 1606-1607.)的研究表明，從 Streptomycesexfoliatus 中提取的生物鹼 Exfoliazone 具
lifi^ffl 『 M Shinsuke (Shinsuke I. et. al.Exfoliazone and lavanducyanin,
potent growth promoting substances of rat liver cell line, RLN—8, produced by streptomyces exfoliatus and streptomyces aeriouvifer[J]. J Antibiot,1993,46 (8) 1232-1238)的研究表明，生物鹼Exfoliazone對鼠肝細胞系具有促生長作用，但未見其對
3癌細胞作用的報導。

發明內容
本發明的第一個目的在於，提供一種生物鹼Exfoliazone在製備治療癌症藥物中 的應用。本發明的第二個目的在於，提供一種孤兒受體Nur77作為作用靶點在篩選海洋生 物資源中的應用。所述生物鹼Exfoliazone可以誘導癌症細胞的凋亡，具體的，生物鹼Exfoliazone 可以誘導孤兒受體Nur77的表達，誘導孤兒受體Nur77出核，並且生物鹼Exfoliazone是通 過CRMl途徑誘導Nur77的出核轉運，最後引起肝癌細胞的凋亡，且生物鹼Exfoliazone的 凋亡效應依賴於Nur77的出核轉運。生物鹼Exfoliazone在製備治療癌症藥物中的應用，是生物鹼Exfoliazone作為 一種靶向Nur77凋亡途徑的調節因子。所述癌症為肝癌、肺癌等。所述治療癌症藥物以孤 兒受體Nur77作為作用靶點。所述以孤兒受體Nur77作為作用靶點在篩選海洋生物資源中 的應用。所述篩選是篩選作用於孤兒受體Nur77誘導腫瘤細胞凋亡的生物鹼Exfoliazone 等一類海洋生物資源。所述誘導腫瘤細胞凋亡是通過誘導孤兒受體Nur77的表達。所述誘 導腫瘤細胞凋亡是通過誘導孤兒受體Nur77出核且依賴於Nur77的出核轉運。本發明提供的作用於Nur77誘導腫瘤細胞凋亡可以用於指導篩選其它生物鹼，從 中獲取具有抗腫瘤活性的化合物，並可將獲得的藥物進而製備可作用於孤兒受體Nur77誘 導腫瘤細胞凋亡的活性與功能的藥物。本發明涉及的是從海洋生物中提取的一種生物鹼Exfoliazone，其具有誘導腫瘤 細胞凋亡，且凋亡效應依賴於Nur77的出核轉運。生物鹼Exfoliazone作為一種靶向Nur77 凋亡途徑的新的調節因子，將成為一種非常有效的癌症治療藥物。本發明根據海洋藥物資源與核受體的關係，得到一種生物鹼Exfoliazone能夠誘 導腫瘤細胞的凋亡，且凋亡效應依賴於Nur77的出核轉運。


圖1顯示生物鹼Exfoliazone對Nur77mRNA水平的調控結果。圖2顯示生物鹼Exfoliazone對肝癌細胞H印G2中Nur77蛋白的表達量調控結果。 該誘導作用具有良好的時效和量效關係。圖3顯示生物鹼Exfoliazone誘導內源Nur77出核。圖4顯示生物鹼Exfoliazone誘導外源Nur77的出核(通過CRMl途徑誘導)。圖5顯示生物鹼Exfoliazone誘導外源Nur77的凋亡(通過CRMl途徑誘導)。圖6顯示生物鹼Exfoliazone對肝癌細胞!fepG2生長的抑制作用。圖7顯示生物鹼Exfoliazone誘導H印G2細胞的凋亡。圖8顯示生物鹼Exfoliazone誘導!tepG2細胞PARP蛋白切割。圖9顯示Annexin V/PI雙染檢測生物鹼Exfoliazone對!fepG2細胞的凋亡。圖10顯示外源Nur77介導生物鹼Exfoliazone的凋亡效應。圖llNur77敲除的MEF細胞中生物鹼Exfoliazone的凋亡效應顯著下降。
圖12顯示生物鹼Exfoliazone在!fepG2細胞中誘導的凋亡效應依賴於Nur77的 出核轉運。圖13顯示生物鹼Exfoliazone對肺癌細胞H460生長的抑制作用。圖14顯示生物鹼Exfoliazone對Nur77mRNA水平的調控結果。圖15顯示生物鹼Exfoliazone對肺癌細胞H460中Nur77蛋白的表達量調控結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本 發明而非用於限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如《分子克隆實驗室手冊》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。本發明中使用的試劑脂質體2000、Trizol 購自 Invitrogen 公司，普黴素 A(LMB)購自 sigma ;ECL、山 羊抗兔、山羊抗鼠辣根過氧化物酶二抗購自Thermo公司；Cy3標記的山羊抗鼠二抗購自 Cheniconinternational ；Nur77 多抗(sc-5569)、PARP (sc-556494)及 FITC 標記的山羊抗 兔二抗購自Santa Cruz ； β-actin抗體購自Sigma公司；PVDF膜購自Millipore0無特別 註明外，其它化學試劑均購自Sigma公司。所採用的生物鹼Exfoliazone為北京大學醫學部林文翰教授的實驗室分離 和鑑定(有關化學結構已公開，見參考文獻Journal of Antibiotics，1990，43 (12) 1606-1607)。其結構式如下實施例1在!fepG2細胞中生物鹼Exfoliazone對於Nur77表達的誘導作用1、細胞培養選擇肝癌細胞株H印G2 (ATCC)，用10%小牛血清的DMEM培養基，在37°C含5% C02 的細胞培養箱培養於6孔組織培養板中，24h後換液，飢餓12h後進行加藥(不含血清) 處理。生物鹼Exfoliazone溶解於DMSO(DMS0終濃度< 0. )中，分別以10 μ mol/L、 20 μ mol/L處理6h，陰性對照組用同樣濃度的DMSO處理6h，而陽性對照組用佛波酯IOOng/ mL (TPA)處理3h，具體處理如下(1)陰性對照組(DMSO)(2)陽性對照組(TPA)(3)生物鹼 Exfoliazone 組(10 μ mol/L)(4)生物鹼 Exfoliazone 組(20 μ mol/L)收集細胞，以備提取RNA。
2、轉錄水平分析Nur77的表達細胞以TRIZOL提取RNA，然後進行RT-PCR，最後PCR產物用1 %瓊脂糖膠進行分 析，結果如圖1所示。由圖1的結果可知，在H印G2肝癌細胞中，生物鹼Exfoliazone可顯著上調 Nur77mRNA 的表達。3、蛋白水平分析Nur77的表達為了確證時效及量效關係，用生物鹼Exfoliazone處理H印G2細胞，處理濃度為 10ymol/L，20ymol/L，處理時間為6，12h，以未以任何處理的!fepG2細胞作為對照。細胞以改進的RIPA裂解緩衝液(50mM Tris_Hcl，pH 7. 4 ； 150mM NaCl ；5mM EDTA ； 1% NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS)於冰上裂解30min。以相同上樣量，8% SDS-PAGE 電泳，轉膜，以 5 % 脫脂奶粉的 TBST(50mM Tris-HCl (pH 7. 4), 150mM NaCl and 0. 1 % Tween20)室溫封閉lh，於室溫2h或4°C過夜孵育一抗，室溫孵育二抗lh，ECL顯色，曝光。 結果如圖2所示。由圖2的結果可知，在!fepG2細胞中，以10、20 μ mol/L生物鹼Exfoliazone作用 於H印G2細胞6h後，高濃度的生物鹼Exfoliazone (20 μ mol/L)可以誘導Nur77的表達；當 作用細胞12h後，低濃度的生物鹼Exfoliazone (10 μ mol/L)即可誘導Nur77表達水平的顯 著提高。以上結果表明，生物鹼Exfoliazone可有效誘導H印G2細胞Nur77蛋白的表達，且 這種誘導作用是時間和劑量依賴型的，表明其生物學功能的發揮有可能與作用時間和劑量 呈一定的相關性。4、生物鹼Exfoliazone誘導內源Nur77出核選擇肝癌細胞H印G2，用含10%胎牛血清的DMEM培養基(購自Hyclone)，在37°C 含5% C02的細胞培養箱培養於24孔組織培養板中，24h後換液和進行加藥(不含血清) 處理。生物鹼Exfoliazone溶解於DMSO(DMS0終濃度< 0. )中，以10 μ mol/L處理6h， 對照組用同樣濃度的DMSO處理6h，具體處理如下(1)對照組(DMSO)(2)生物鹼 Exfoliazone 組(3)用普黴素A(LMB) (10ng/mL)預處理後，加入生物鹼Exfoliazone組。反應板中各孔溶液的總體積均為1ml，生物鹼Exfoliazone的濃度均為10 μ mol/ L0細胞經處理6h後，0.5%胰酶消化，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，再用Triton穿 膜，最後加入DAPI (0.01mg/mL)染色。甘油封片，螢光顯微鏡下觀察細胞核的形態，結果如 圖3所示。根據圖3的結果可知，生物鹼Exfoliazone作用後的細胞中，Nur77大多呈胞質 分布，而無生物鹼Exfoliazone處理的細胞，Nur77大多分布在細胞核中。說明生物鹼 Exfoliazone能夠有效誘導IfepG2細胞中內源Nur77的出核轉運。5、生物鹼Exfoliazone誘導外源Nur77出核選擇肝癌細胞H印G2，用含10%胎牛血清的DMEM培養基(購自Hyclone)，在 37°C含5% C02的細胞培養箱培養於24孔組織培養板中，在細胞密度達到80%左右，將 GFP-Nur77用脂質體2000轉入H印G2中，24h後換液和進行加藥(不含血清)處理。生物 鹼Exfoliazone溶解於DMSO (DMS0終濃度< 0. 1 % )中，以10 μ mol/L處理6h，對照組用同樣濃度的DMSO處理6h，具體處理如下(1)對照組(DMSO)(2)生物鹼 Exfoliazone 組(3)用普黴素A(LMB) (10ng/mL)預處理後，加入生物鹼Exfoliazone組。反應板中各孔溶液的總體積均為1ml，生物鹼Exfoliazone的濃度均為10 μ mol/ L0細胞經處理6h後，0.5%胰酶消化，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，再用Triton穿 膜，最後加入DAPI (0.01mg/mL)染色。甘油封片，螢光顯微鏡下計數凋亡細胞。凋亡細胞根 據細胞形態上典型的細胞質皺縮，膜起泡以及核凝縮、破碎加以識別。至少300個細胞，多 於5個隨機視野。結果如圖4和5所示。根據圖4的結果可知，ΙΟμπιοΙ/L生物鹼Exfoliazone處理轉染後的IfepG2細 胞6h，發現GFP-Nur77出核，重新定位於細胞質中。根據圖5的結果可知，在細胞中轉入 GFP-Nur77後，用LMB預先處理!fepG2細胞，再加入生物鹼Exfoliazone共同處理6h，LMB也 可顯著阻斷外源GFP-Nur77的出核轉運。由此可知，生物鹼Exfoliazone通過CRMl途徑誘 導Nur77的出核轉運。上述結果表明生物鹼Exfoliazone可以誘導Nur77出核，且是通過CRMl途徑來 誘導的。實施例2生物鹼Exfoliazone誘導肝癌細胞IfepG2的凋亡1、生物鹼Exfoliazone對!fepG2細胞的生長抑制作用H印G2細胞以5 X IO3/孔接種於96孔板，5% C02、37°C條件下培養24h後，加入濃 度為1、10、20、30和40ymol/L的生物鹼Exfoliazone，以等量的DMSO作為對照組，每組均 設置6個重複孔。藥物分別處理24,48和72h後，加MTT液(5mg/mL，20 μ L/孔)，孵育4h 後加DMS0(150 μ L/孔)，振蕩，顯色。用酶聯免疫檢測儀在波長490nm下讀取吸光度，採用 公式細胞生存率=(實驗組吸光度平均值/對照組吸光度平均值)X 100%，計算細胞生 存率。結果如圖6所示。根據圖6的結果可知，生物鹼Exfoliazone可顯著抑制!fepG2細胞的生長，這種作 用呈現劑量依賴性和時間依賴性的關係，在藥物處理24、48和72h後，生物鹼Exfoliazone 半數抑制濃度(IC5tl)分別為35、16和8 μ mol/L。2、生物鹼Exfoliazone誘導!fepG2細胞凋亡的形態變化選擇肝癌細胞H印G2，用含10%胎牛血清的DMEM培養基(購自Hyclone)，在37°C 含5% C02的細胞培養箱培養於24孔組織培養板中，24h後換液和進行加藥(不含血清)處 理。生物鹼Exfoliazone溶解於DMSO(DMS0終濃度< 0. 1 % )中，以30 μ mol/L處理24h， 對照組用同樣濃度的DMSO處理24h。反應板中各孔溶液的總體積均為1ml。細胞經處理6h後，0. 5%胰酶消化，PBS洗3 次，4%多聚甲醛固定，再用Triton穿膜，最後加入DAPI (0.01mg/mL)染色。甘油封片， 螢光顯微鏡下觀察細胞核的形態，結果如圖7所示。根據圖7的結果可知，處理24h，對照組細胞界限清晰，胞漿豐富，胞核圓形或橢圓 形，飽滿，染色質均勻分布，而30 μ mol -L"1生物鹼Exfoliazone處理後，!fepG2細胞核變圓、 縮小，染色質濃縮呈斑塊狀。3、生物鹼Exfoliazone誘導!fepG2細胞的PARP蛋白降解
選擇肝癌細胞H印G2，在37°C和5%二氧化碳培養箱培養於24孔板組織培養板中， 24h後，分別用加有5、10、20 μ M生物鹼Exfoliazone的無血清的DMEM處理24h。細胞以改 進的RIPA裂解緩衝液(50mM Tris_Hcl，pH 7.4 ； 150mM NaCl ；5mM EDTA ；1%ΝΡ-40,0. 5%脫 氧膽酸鈉，0. 1% SDS)於冰上裂解30min。以相同上樣量，8% SDS-PAGE電泳，轉膜，以5% 脫脂奶粉的 TBST (50mM Tris-HCl (pH 7. 4)，150mMNaCl and 0. 1 % Tween-20)室溫封閉 lh， 於室溫2h或4°C過夜孵育一抗anti-PARP(l 1000稀釋)，室溫孵育二抗lh，ECL顯色，曝 光。結果如圖8所示。如圖8所示，生物鹼Exfoliazone可以誘導113kD的PARP蛋白被降解為89kD的 特異性降解產物。隨生物鹼Exfoliazone作用濃度的延長89kD的降解產物量逐漸增多。4、利用Annexin-V/PI雙染檢測生物鹼Exfoliazone誘導！fepG2的凋亡在無血清DMEM 培養基(購自 Hyclone)中用 1、10、20 μ mol/L 生物鹼 Exfoliazone 處理H印G2肝癌細胞24h，以不加生物鹼Exfoliazone的細胞作為陰性對照，以紫杉醇 (Taxol) 100nmol/L處理為陽性對照。細胞根據Vybrant Apoptosis Assay Kit#2操作手冊 染色 PI 和 AnnexinV，用流式細胞儀(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析。用 EXP032ADC 軟體(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析,結果如圖9所示。結果表明，用lOOnmol/L的紫杉醇處理H印G2細胞24h，可引起細胞大量死亡，細胞 的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為42. 4%和15. 9%。而用生物鹼Exfoliazone處理H印G2 細胞，細胞主要表現為早期凋亡，並且呈明顯的劑量依賴關係，1、10和20 μ mol/L分別處理 !fepG2細胞24h後，細胞的早期凋亡率分別為1. 1%、10%和44. 2%，而晚期凋亡率分別為 3.4%、4. 9%和9.7%，壞死細胞幾乎檢測不到，這表明生物鹼Exfoliazone能夠誘導!fepG2 細胞凋亡，而不是壞死。上述結果表明，生物鹼Exfoliazone誘導!fepG2的凋亡。實施例3生物鹼Exfoliazone誘導HepG2細胞的凋亡依賴於Nur77的表達水平以 及Nur77的出核轉運為了研究Nur77在生物鹼Exfoliazone誘導的凋亡所起的作用，用Nur77的抗體 和DAPI共同染色生物鹼Exfoliazone處理後的!fepG2細胞(細胞培養同實施例2. 5)，結果 如圖10所示。根據圖10的結果可以看出，10μmol/L生物鹼Exfoliazone處理H印G2細胞 24h，相對於對照組，HepG2細胞沒有發生顯著的凋亡效應；而當轉入外源GFP_Nur77，再用 10 μ mol/L生物鹼Exfoliazone處理!fepG2細胞24h，細胞凋亡率提高約60%。說明Nur77 介導生物鹼Exfoliazone的凋亡效應。為了進一步證明Nur77的表達同細胞凋亡誘導之間的關係，將Nur77基因敲除的 MEF細胞(MEF Nur77+的H印G2細胞用10、20 μ M的生物鹼Exfoliazone處理24h，細胞根 據 VybrantApoptosis Assay Kit#2 操作手冊染色 PI 和 AnnexinV，用流式細胞儀(Beckman Coulter EPICSALTRA)分析。用 EXP032ADC 軟體(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析，結 果如圖11所示。根據圖11結果可以看出，10、20 μ mol/L生物鹼Exfoliazone處理後，MEF細胞的 早期凋亡率分別為8%和41. 1%，而同樣濃度生物鹼Exfoliazone處理的MEF Nur77+細 胞，早期凋亡率下降為3. 6%和4. 6%。這一結果表明生物鹼Exfoliazone的凋亡效應是由Nur77介導的。如果Nur77的出核轉運在生物鹼Exfoliazone誘導的細胞凋亡中起作用，抑制 Nur77的出核將可以減少細胞凋亡。因此，轉染GFP-Nur77的H印G2細胞在LMB存在或是缺 乏的情況下，以生物鹼Exfoliazone 10 μ mol/L處理6h。然後AnnexinV/PI雙染檢測細胞 凋亡，結果見圖12。根據圖12的結果表明，10 μ mol/L生物鹼Exfoliazone使H印G2細胞早期凋亡率 為10%，LMB的加入使凋亡率大幅下降為1.8%，細胞基本不發生凋亡。以上結果說明，生 物鹼Exfoliazone的凋亡效應依賴於介導Nur77的出核轉運。以上的結果說明生物鹼Exfoliazone誘導的細胞凋亡不僅依賴於Nur77的表達水 平也依賴於其出核轉運。實驗例4生物鹼Exfoliazone對肺癌細胞H460的生長抑制作用及對Nur77的誘 導作用1、生物鹼Exfoliazone對H460細胞的生長抑制作用選擇肺癌細胞株H460(ATCC)，用10%小牛血清的DMEM培養基，在37°C含5% C02 的細胞培養箱培養。以5X IO3/孔接種於96孔板，5% C02、37°C條件下培養24h後，加入濃 度為 0,1. 25,2. 5,5,10,20,40,80 μ mol/L 的生物鹼 Exfoliazone，以等量的 DMSO 作為對照 組，每組均設置6個重複孔。藥物處理24h後，加MTT液(5mg/mL，20 μ L/孔)，孵育4h後 加DMSO (150 μ L/孔)，振蕩，顯色。用酶聯免疫檢測儀在波長490nm下讀取吸光度，採用公 式細胞生存率=(實驗組吸光度平均值/對照組吸光度平均值)X 100%，計算細胞生存 率。結果如圖所13示。根據圖13的結果可知，生物鹼Exfoliazone可顯著抑制H460細胞的生長，這種作 用呈現劑量依賴性關係，在藥物處理24h後，生物鹼Exfoliazone半數抑制濃度(IC5tl)分別 為 13.6 μ mol/L。2、生物鹼Exfoliazone對Nur77的誘導作用選擇肺癌細胞株H460，用10%小牛血清的DMEM培養基，在37°C含5% C02的細胞 培養箱培養於6孔組織培養板中，24h後換液，飢餓12h後進行加藥(不含血清)處理。生 物鹼 Exfoliazone 溶解於 DMSO (DMS0 終濃度< 0. 1% )中，分別以 10 μ mol/L、20 μ mol/L 處 理6h，陰性對照組用同樣濃度的DMSO處理6h，而陽性對照組用佛波酯lOOng/mL (TPA)處理 3h，具體處理如下(5)陰性對照組(DMSO)(6)陽性對照組(TPA)(7)生物鹼 Exfoliazone 組(10 μ mol/L)(8)生物鹼 Exfoliazone 組(20 μ mol/L)收集細胞，以備提取RNA。2. 1轉錄水平分析Nur77的表達細胞以TRIZOL提取RNA，然後進行RT-PCR，最後PCR產物用1 %瓊脂糖膠進行分 析，結果如圖14所示。由圖14的結果可知，在肺癌細胞H460中，生物鹼Exfoliazone可顯 著上調Nur77mRNA的表達。2. 2蛋白水平分析Nur77的表達
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用生物鹼Exfoliazone處理H460細胞，處理濃度為10、20 μ mol/L，處理時間為 12h，以未以任何處理的H460細胞作為對照。細胞以改進的RIPA裂解緩衝液(50mM Tris_Hcl，pH 7. 4 ； 150mM NaCl ；5mM EDTA ； 1% NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS)於冰上裂解30min。以相同上樣量，8% SDS-PAGE 電泳，轉膜，以 5 % 脫脂奶粉的 TBST(50mM Tris-HCl (pH 7. 4), 150mM NaCl and 0. 1 % Tween20)室溫封閉lh，於室溫2h或4°C過夜孵育一抗，室溫孵育二抗lh，ECL顯色，曝光。 結果如圖15所示。由圖15的結果可知，在H460細胞中，以1、10、20 μ mol/L生物鹼Exfoliazone作 用於H460細胞12h後，均能誘導Nur77的表達；且這種誘導作用是劑量依賴型的，隨著著處 理濃度的增高，其誘導Nur77的蛋白量也增多。這表明其生物學功能的發揮有可能與作用 劑量呈一定的相關性。綜上所述，本發明的生物鹼Exfoliazone通過誘導Nur77表達及其出核轉運，從而 誘導腫瘤細胞的凋亡。因此本發明的生物鹼Exfoliazone可以用於製備治療癌症的以孤兒 受體Nur77作為作用靶點的藥物。另外，孤兒受體Nur77可以作為作用靶點用於篩選生物 鹼Exfoliazone等一系列的海洋生物資源。
權利要求
一種生物鹼Exfoliazone在製備治療癌症藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述癌症為肝癌或肺癌。
3.如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述治療癌症藥物以孤兒受體Nur77作為作 用靶點。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述以孤兒受體Nur77作為作用靶點在篩選 海洋生物資源中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於所述篩選是篩選作用於孤兒受體Nur77誘導 腫瘤細胞凋亡的海洋生物資源。
6.如權利要求4或5所述的應用，其特徵在於所述海洋生物資源為生物鹼。
7.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述誘導腫瘤細胞凋亡是通過誘導孤兒受體 Nur77的表達。
8.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述誘導腫瘤細胞凋亡是通過誘導孤兒受體 Nur77出核且依賴於Nur77的出核轉運。
全文摘要
一種生物鹼的抗癌應用，涉及一種生物鹼。提供生物鹼Exfoliazone在製備治療癌症藥物應用以及孤兒受體Nur77作為作用靶點在篩選海洋生物資源中的應用。所述Exfoliazone可誘導癌症細胞的凋亡，Exfoliazone可誘導孤兒受體Nur77的表達，誘導孤兒受體Nur77出核，並且Exfoliazone是通過CRM1途徑誘導Nur77的出核轉運，最後引起肝癌細胞的凋亡，Exfoliazone的凋亡效應依賴於Nur77的出核轉運。Exfoliazone作為一種靶向Nur77凋亡途徑的調節因子，將成為一種非常有效的癌症治療藥物。所述治療癌症藥物以孤兒受體Nur77作為作用靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101947225SQ20101029656
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者張曉坤, 曾錦章, 韋楊燁 申請人:廈門大學