誘導針對遺傳趨異性hiv-1毒株的中和性抗體的肽的製作方法
2023-10-09 11:47:49
專利名稱：誘導針對遺傳趨異性hiv-1毒株的中和性抗體的肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠誘導針對HIV-1的不同毒株和臨床分離物的中和性抗體的肽、以及用該肽誘導出的抗體，還涉及能把這些肽有效呈遞給免疫系統的肽-載體結合物的製備。更具體地說，本發明涉及針對HIV-1的疫苗的建立。
獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)是一型人免疫缺陷病毒(HIV-1)長期持續性感染的後期臨床表現。持續感染期間針對該病毒及病毒感染細胞的免疫反應通常不能介導感染的消除。疫苗會誘導出免疫反應，這些免疫反應能防止持續感染的確立，甚至能防止發展為愛滋病。多數針對HIV-1的疫苗都著眼於其表面糖蛋白gp160，該蛋白由gp120和gp41組成，負責病毒與細胞受體CD4的結合，並負責觸發後續的融合活性。
然而，就gp160而言，所觀察到的一些現象反對用整個gp160或gp120作為免疫原的作法提出了異議。體外實驗表明，gp120和gp120特異性抗體之間的協同作用阻斷了人T細胞的活化(Mittler等人，Science2451380，1989)。此外，已知gp160上的一些抗原區能誘導增強HIV-1感染的抗體(Jiang等，J.Exp.Med.1741557，1991)。
用合成肽作免疫原有許多優點。合成肽誘導的抗體具有預定的特異性，在病毒的情況下，可以對合成肽加以選擇使其具有病毒粒子表面的結構。合成多肽的有趣之處還在於它們能誘導正常條件下看不到的抗體反應。例如，有可能誘導出比整個蛋白誘導出的抗體反應範圍更寬的中和性抗體(Green等人，Cell28477，1982)。
此外，已證明含有HIV-1分離物HIV-1IIIb的gp120的部分V3環的肽所誘導出的抗體，能預防黑猩猩免受該HIV-1分離物的侵染(Emini等，Nature355728，1992)。
由於合成肽本身的免疫原性差，必須使其與具有佐劑作用的分子如破傷風類毒素或鑰孔血藍蛋白偶聯(Bittle等人，Nature29830，1982)。另一種作法是克隆一些與日本裂體吸蟲穀胱甘肽S-轉移酶融合的蛋白形式的小肽(Fikrig等人，Science250553，1990)。
另外，諸如牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒或流感病毒等病毒，可以作為免疫原的載體使用。用含有B型肝炎表面抗原(HBsAg)順序、單純性皰疹病毒糖蛋白D順序及流感病毒血細胞凝集素順序的重組牛痘病毒接種的家兔，產生針對所有上述三種外來抗原的抗體(Perkus等人，Science229981，1985)。此外，表達HIV-1的gp41上的抗原決定基的嵌合脊髓灰質炎病毒，能在家兔體內成功誘導出針對HIV-1的中和性抗體(Evans等人，Nature339385，1989)。
最近以來，也有可能用體外誘變法改變流感病毒的基因組(Enami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA873802，1990)。藉助這一技術，有可能加工出一種穩定的減毒甲型流感病毒(Muster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA885177，1991)。
在這方面，流感病毒的優點是可以得到許多變異體，從而有可能進行反覆的接種。另外，流感病毒能誘導出強的體液免疫和細胞免疫反應，這對抗HIV-1疫苗途徑是有利的。
本發明的目的是提供一些就整個gp160而言只略有免疫原性的肽順序，這些肽順序可用於誘導對HIV-1的不同毒株和/或臨床分離物具有中和活性並且/或者能抑制哺乳動物體內由HIV-1引起的細胞融合的抗體。
本發明的另一目的是提供誘導由黏膜表面分泌的針對HIV-1病毒和病毒感染細胞的分泌抗體的方法。本發明假定，在黏膜組織中誘導抗HIV-1 IgA抗體特別為預防和防止有潛在危險個體的HIV-1感染提供了一種有力的工具，因為包括HIV-1在內的許多病毒感染都是通過呼吸道、胃腸道和生殖道的黏膜表面傳播的。
達到上述目的的方法是製備由化學合成法或微生物學方法得到的7或8個胺基酸的小肽，這些肽優選是由編碼以下順序的核酸順序衍生的Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser(單字母代碼為ELDKWAS)、Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser(LELDKWAS)、Glu Leu Asn Lys TrpAla Ser(ELNKWAS)、Leu Glu Leu Asn Lys Trp AlaSer(LELNKWAS)、Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser(ELDNWAS)或LeuGlu Leu Asp Asn Trp Ala Ser(LELDNWAS)。
然後，可以將上述6個胺基酸順序中的至少一個(優選所有的)有效地呈遞給免疫系統，以便誘導抗體的形成和釋放，這些抗體對HIV-1毒株具有中和活性並且/或者能抑制由這些病毒引起的細胞融合。
本發明的主要目標是提供一種有前途的抗HIV-1疫苗，這種疫苗是以含有至少一種上述肽，優選含有所述上述六種肽的混合物的製劑為基礎的。本發明的特有特徵和優選實施方案描述如下。
在本發明的一個優選實施方案中，使限定人單克隆抗體2F5(由雜交瘤細胞系2F5製得，該細胞系的PHLS保藏號為90091704，保藏日為1990年9月17日)抗原決定基順序的胺基酸順序Glu Leu AspLys Trp Ala(ELDKWA)，與位於gp41上限定2F5抗原決定基的ELDKWA順序附近的Ser或Leu與Ser二者連接，從而分別建立肽順序Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser(ELDKWAS)和Leu Glu Leu Asp LysTrp Ala Ser(LELDKWAS)，再將其插入到載體分子即流感病毒HA的抗原位點B中。
經修飾的攜有外源胺基酸順序ELDKWAS或LELDKWAS的「嵌合」HA融合蛋白，在優選以注射形式施用於哺乳動物特別是人的免疫系統後，能非常有效地誘導出針對所呈遞的ELDKWAS或LELDKWAS順序的抗體。用該方法得到的抗體對HIV-1的不同毒株和/或臨床分離物具有中和活性。
然而，現已證明，由於已知的HIV-1病毒的多形性，甚至gp41的高度保守的(L)ELDKWAS胺基酸順序內也會發生突變，而這一順序相應於HIV-1分離物BH10的胺基酸661-668(LELDKWAS)或662-668(ELDKWAS)。本說明書中採用的核苷酸和胺基酸編號相應於Los Alamos資料庫中採用的HIV-1分離物BH10的gp160的編號(Myers等人，Data Base Human Retrovirusand Aids)。這些突變尤其影響所述順序中間的Asp(D)和/或Lys(K)胺基酸，從而降低了病毒對被攜有2F5抗原決定基的抗體中和的敏感性。然而，用本發明的一些肽能成功克服這種不希望的病毒迴避機制，這些肽中Asp(D)或相鄰的Lys(K)被天冬醯胺(N)置換。
可以利用至少一種所述肽，優選所有六種所述肽的混合物，製備用於誘導抗體的藥物，這些抗體對HIV-1的不同毒株和/或臨床分離物具有中和活性，並且/或者能抑制HIV-1引起的細胞融合。
在另一個實施方案中，可以使用同樣的肽來製備一種藥物，這種藥物在優選鼻內施用於哺乳動物後能誘導出由黏膜表面分泌的抗HIV-1 IgA抗體。這些肽既可以每種肽單獨使用，也可以與至少一種其他所述肽混合使用。
在本發明的另一個實施方案中，所述六種肽中的至少一種與一種載體連接。這種載體可以是例如病毒，優選減毒和/或重組形式的病毒。最好使用流感毒、杆狀病毒或牛痘病毒。小肽與諸如病毒蛋白或完整病毒等載體連接後，增強了這些嵌合肽—載體結合物或嵌合融合蛋白呈遞給免疫系統後誘導抗體的效力。
特別有利的是以與載體病毒蛋白的融合蛋白形式使用每一種上述肽，其中至少一種本發明的胺基酸順序替換了至少一部分病毒載體蛋白，或者插入到病毒蛋白的至少一個抗原位點中。所以，這一特徵構成了一個重要的實施方案。在一個優選的實施方案中，所述病毒蛋白是流感病毒的血細胞凝集素(HA)、流感病毒的神經氨酸苷酶(NA)或B型肝炎病毒的表面抗原。在另一個實施方案中，該表面蛋白可得自優選為重組形式的杆狀病毒或牛痘病毒。
本發明還涉及任一種由7個或8個胺基酸組成的上述肽和/或肽—載體結合物或融合蛋白在藥物製備中的應用，所述藥物用於誘導抗體，這些抗體對HIV-1的不同毒株和/或臨床分離物具有中和活性，並且/或者抑制HIV-1引起的細胞融合。更具體地說，打算提供一種有效的疫苗用於對受HIV-1威脅的個體進行預防和/或對HIV-1感染患者進行治療，尤其是預防感染髮展成愛滋病，所述疫苗的基礎是至少一種所述肽，優選所有六種所述肽的混合物，以及/或者與載體連接的所述六種肽。
在另一個優選實施方案中，利用所述六種肽和/或與載體連接的所述六種肽來製備和生產藥物製劑，這些藥物在施用於哺乳動物的免疫系統後能誘導出由動物或人類患者的黏膜表面分泌出的抗HIV-1IgA抗體。在這種情況下優選鼻內施用。
因此，本發明的所述六種肽和/或肽—載體結合物還可以用於生產一種藥物，用於預防危險個體的HIV-1感染。
看來，本發明的這一特有特徵使人們有望通過按照本發明在黏膜表面誘導抗HIV-1特異性分泌IgA抗體，提供一種早在病毒進入哺乳動物體內的最初階段就有效進攻侵入病毒的醫學工具。據信，先有技術治療HIV-1感染患者的方法至少在某種程度上不能防禦疾病，因為病毒主要在血流中被追蹤，而且是在很晚的階段，即廣泛分布於體液系統中之後才被追蹤的。
本發明進一步涉及一種具有HIV-1中和活性並能夠防止由HIV-1引起的細胞融合的抗體，其特徵在於，該抗體是由六種所述肽之一誘導的。
在一個優選實施方案中，所述抗體是一種分泌抗體，優選為抗HIV-1 IgA抗體，最好是由黏膜表面分泌的抗體。
進一步，本發明還涉及用微生物學方法或化學方法製備所述六種肽中任一種的方法。
在一個實施方案中，所述六種肽是按標準生物醫學程序化學合成的，優選用Applied Biosystems431A型肽合成儀進行合成。
在另一個實施方案中，所述胺基酸順序是用一種微生物學方法得到的，該方法包括如下步驟在宿主生物的基因組中插入一段核苷酸順序，用標準微生物學培養技術進行基因組的表達，分離至少一種(優選多種)所述肽，其中所述核苷酸順序選自a)相應於所述六種肽之一的核苷酸順序；b)與a)中的核苷酸順序之一雜交的核苷酸順序；c)用簡併法由a)中的核苷酸順序之一推測出的核苷酸順序。
嵌合融合蛋白或肽—載體結合物可以按以下實施方案來製備，該實施方案包括用化學方法或微生物學方法，使選自所述六種肽的胺基酸順序與一種載體(優選病毒或病毒蛋白)連接。
在一個優選實施方案中，製備與載體(優選病毒或病毒蛋白)連接的所述六種肽的方法是微生物學方法，該方法包括以下步驟使一個核苷酸順序與一個相應於載體胺基酸順序的核苷酸順序連接，將連接後的核苷酸順序轉移到一個宿主生物中，用標準微生物學技術進行連接後順序的表達，分離至少一種(優選多種)與載體連接的所述肽，其中所述核苷酸順序選自a)相應於所述六種肽的胺基酸順序之一的核苷酸順序；b)與a)中的核苷酸順序之一雜交的核苷酸順序；c)用簡併法由a)中的核苷酸順序之一推測出的核苷酸順序。
在另一個實施方案中，製備與載體(優選病毒或病毒蛋白)連接的所述六種肽的方法的特徵是使至少一個核苷酸順序與相應於載體病毒蛋白胺基酸順序的核苷酸順序連接，從而置換至少一部分相應於病毒蛋白胺基酸順序的核苷酸順序，或者插入到所述順序相應於病毒蛋白抗原位點的至少一個位點中，其中所述核苷酸順序選自a)相應於所述六種肽的胺基酸順序之一的核苷酸順序；b)與a)中的核苷酸順序之一雜交的核苷酸順序；c)用簡併法由a)中的核苷酸順序之一推測出的核苷酸順序。
在一個具體實施方案中，所施用的病毒蛋白選自流感病毒的血細胞凝集素、流感病毒的神經氨酸苷酶和B型肝炎病毒的表面抗原。在另一個特徵性實施方案中，用流感病毒、杆狀病毒或牛痘病毒作為宿主生物，這些病毒都優選為重組形式。
在除WSN(在下列實施例中主要述及該病毒株)以外的流感病毒株的HA抗原位點B中插入所述六種肽的順序，同樣會產生能誘導中和性抗HIV-1抗體並防止HIV-1驅動性細胞融合的融合蛋白和/或嵌合病毒。
另外，將這些順序導入流感病毒HA的其他位點或導入流感病毒的神經氨酸苷酶(NA)中，將產生能誘導中和性抗HIV抗體並防止HIV驅動性細胞融合的肽—載體融合蛋白和/或嵌合病毒。
以下實施例將進一步說明本發明，這些實施例決不限制本發明的範圍。
實施例1抗原決定基圖譜測定用Towbin等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA764350，1979)的免疫印跡法鑑定單克隆抗體2F5的抗原決定基。以與穀胱甘肽轉移酶融合肽的形式克隆出HIV-1分離物BH10的gp41重疊片段的肽。通過克隆在質粒pGEX-2T(Pharmacia)的BamHI和EcoRI位點之間的gp41相應寡核苷酸的雜交，得到不同的融合肽。將重組質粒轉化到大腸桿菌DH5株中，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導融合肽的表達。然後用穀胱甘肽-Sepharose 4B柱純化大腸桿菌提取液，把純化的提取液加到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠上，用電泳法分離，用銀染色和免疫印跡法分析蛋白表達情況(
圖1)。免疫印跡數據表明，人單克隆抗體2F5的抗原決定基包含相應於gp160的胺基酸662-667的胺基酸順序ELDKWA。
圖1說明人單克隆抗體2F5的特異性(見實施例1)。
圖2說明攜有2F5抗原決定基順序的嵌合血細胞凝集素的構建(見實施例2)。
圖3說明用嵌合流感病毒免疫的小鼠抗血清的ELISA滴度(見實施例3)。
圖4說明用重組杆狀病毒感染細胞免疫的小鼠的ELISA滴度(見實施例5)。
圖1顯示含有HIV-1(分離物BH10)的gp160重疊片段的融合肽的免疫印跡。含有胺基酸597-677(泳道2)、634-677(泳道3)和648-677(泳道4)的構建體與抗體2F5有反應，相反，含有胺基酸667-677(泳道5)的融合肽則不顯示陽性反應。這初步表明單克隆抗體2F5的抗原決定基是由gp160的648-667位順序內的胺基酸構成的。根據這些結果，使這一區域的六聚體重疊肽與穀胱甘肽S-轉移酶融合。
如圖1b所示，含有胺基酸順序GLU LEU ASP LYS TRP ALA(胺基酸662-667，泳道2)的肽與抗體2F5有高度的反應性，而含有胺基酸順序LEU ASP LYS TRP ALA SER(LDKWAS，胺基酸663-668，泳道3)或ASP LYS TRP ALA SER LEU(DKWASL，胺基酸664-669，泳道4)的肽與單克隆抗體的反應性則降低。含有胺基酸順序LEU GLU LEU ASP LYS TRP(LELDKW，胺基酸661-666，泳道1)的肽未顯示出明顯的反應性。這些數據表明，單克隆抗體的抗原決定基含有相應於HIV-1 BH10分離物的gp160上的胺基酸662-667的胺基酸順序GLU LEU ASP LYS TRP ALA(ELDKWA)。在這方面，相應於該抗原決定基順序的合成肽和含有該順序的融合蛋白都能夠抑制由2F5抗體介導的中和作用。
實施例2質粒和嵌合流感病毒的構建所採用的所有基因操作都按Sambrook等人所述的標準程序進行(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York，1989)。如圖2所示，將gp41順序Leu GluLeu Asp Lys Trp Ala Ser(LELDKWAS)或Glu Leu Asp Lys Trp AlaSer(ELDKWAS)插入到流感WSN病毒HA的抗原位點B中。用pT3/WSN-HAm1作模板，利用得自流感病毒WSN HAm1的有意義引物和反義引物(其中反義引物還含有相應於gp160 1981或1984-2004位的21或24個核苷酸的插入)，得到一種PCR產物，用該PCR產物置換質粒pT3/WSN-HAm1(Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905214-5218，1993)的Pst I-Hind III片段，從而構建出質粒pHA-ELDKWAS和pHA-LELDKWAS。以同樣的方式製備質粒pHA-ELNKWAS、pHA-LELNKWAS、pHA-ELDNWAS和pHA-LELDNWAS。
WSN HA的順序由Hiti等人提供(J.Virol.41，730-734，1982)，gp160的順序由Swissprot資料庫(出入碼為ENVSHIV10)提供。按照經Enami和Palese等人修改的(J.Virol.652711-2713，1991)Enami等人的方法(proc.Natl.Acad.Sci.873802-3805，1990)，將由上述質粒得到的RNA轉染到MDBK細胞中，並選擇和製備嵌合病毒。
實施例3用嵌合流感病毒免疫的小鼠的免疫及抗體反應取若干OF-1小鼠，用嵌合流感-ELDKWAS病毒(小鼠M1、M2、M3、M4)或流感-LELDKWAS病毒(小鼠M5)免疫。小鼠先用102TCID50鼻內免疫，6周後用5×105TCID50進行一次鼻內加強免疫，3周後用20μg蔗糖純化的活病毒進行腹膜內免疫，再過3周後用不完全弗氏佐劑中的20μg經SDS變性的病毒進行最後一次加強免疫。鼻內免疫時，小鼠處於乙醚麻醉狀態。對野生型WSN對照病毒(wt1、wt2)採用同樣程序。最後一次加強免疫12天後將小鼠放血，使抗血清在56℃下滅活1小時，測定抗血清的ELISA滴度和中和活性。
圖3A顯示流感-ELDKWAS抗血清與C末端含有ELDKWA順序的穀胱甘肽S-轉移酶(GST)融合肽的結合。用ELISA法測定順序。在室溫下，用溶解在碳酸鹽緩衝液(pH9.6)中的4μg/mlGST-ELDKWA融合肽塗布96孔微量滴定板(100μl/孔)4小時。然後用PBS/0.05％Tween洗滴定板。加入稀釋在PBS/1％BSA/0.05％Tween中的抗血清，於室溫下保溫1小時。洗滌後，與結合有辣根過氧化物酶的羊抗小鼠IgGγ-鏈抗體一起保溫，從而對抗體進行檢測。用鄰苯二胺二鹽酸鹽作底物對滴定板進行染色。用2.5M H2SO4停止反應，對滴定板進行測定(測定波長為492nm，參比波長為620nm)。
圖3B除了檢測抗體時使用與辣根過氧化物酶結合的羊抗小鼠IgA抗體外，採用與如圖3A所述相同的程序。用合胞體抑制測定法測定抗血清的中和活性。抑制合胞體形成50％的血清稀釋度的倒數(EC50)示於表1。小鼠M1-M3的抗血清在不同的血清稀釋度下都中和整個試驗組。抗血清M4和M5中和HIV-1分離物MN和RF，但不中和IIIB。由WSN野生型病毒誘導的抗血清以最低的血清稀釋度(1∶20)進行測試時，不中和任何HIV-1分離物。
表1針對嵌合流感病毒產生的血清對HIV-1的中和作用中和滴度(EC50)抗血清MN RF IIIBM153 95 20M224 40 160M334 160 67M429 24 未測M520 34 24進行合胞體抑制測定時，所用的指示細胞系是Chaffee等人(J.Exp.Med.168605，1988)所述的AA-2細胞系，所用的病毒接種物是HIV-1的MN、RF和IIB株的冰凍原種。所有病毒原種都稀釋到每毫升101.9-102.5TCID50。用培養基將小鼠抗血清稀釋2倍，並分配到96孔微量滴定板中(每個稀釋度4次重複)。在50μl經稀釋的抗血清中加入50μl病毒，病毒/抗體混合物於4℃下預保溫2小時。為進行感染，在每孔中力入100μlAA-2細胞(5×106個細胞/ml)。5天後記錄指示HIV-1感染的合胞體是否存在。按照Reed和Muench所述的方法(Am.J.Hyg.27493，1938)估測50％抑制劑量(EC50)。給出了抑制合胞體形成50％的血清稀釋度的倒數(EC50)。
實施例4攜有延長2F5抗原決定基的嵌合血細胞凝集素由重組杆狀病毒的表達如實施例1所述製備含有所述六種肽的嵌合血細胞凝集素。這些嵌合血細胞凝集素的編碼順序鄰接限制酶位點BamHI，並插入到質粒Bluebac III(Invitrogen，San Diego，CA)的BamHI位點中。按照Groebe等人(Nucleic Acids Res.，184033，1990)和Felgner等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413，1987)所述的方法進行轉染實驗，以便得到含有嵌合血細胞凝集素的重組杆狀病毒。所得的重組嵌合杆狀病毒可用於誘導HIV-1中和性抗體。
實施例5用重組杆狀病毒感染細胞免疫的小鼠的免疫和抗體反應用重組杆狀病毒以1-5的感染複數(MOI)感染用於免疫的Sf9細胞，感染3天後收集細胞。將細胞用PBS洗二次，並以5×106個細胞/ml的濃度重新懸浮於無菌PBS中。這些細胞在Westem印跡中與單克隆抗體2F5發生特異反應，表明這些細胞含有攜帶ELDKWAS或LELDKWAS順序的血細胞凝集素。以二周的間隔給Balb/cA小鼠四次腹膜內注射1×106個感染的Sf9細胞使小鼠免疫(Van Wyyke Coelingh等人，Virology1604465，1987)。第四次免疫7天後，將小鼠放血，測定抗血清的ELISA滴度。圖4顯示在如實施例2所述進行的ELISA中，由重組杆狀病毒得到的抗血清與一種合成肽的結合，該合成肽含有順序Gly Gly Gly Glu Leu Asp Lys TrpAla(GGGELDKWA)。
分泌抗體的誘導用所述六種肽中的至少一種，優選用所述六種肽的混合物進行免疫，使IgG ELDKWA特異性ELISA滴度顯著提高。另外，與用ELDKWA順序進行的免疫不同的是，用所述六種肽進行的免疫也產生顯著的IgA反應。意外的是，在黏膜水平上也觸發該IgA免疫反應。
實施例6用流感-ELDKWAS病毒免疫的Balb/c小鼠的呼吸道分泌物中的IgA抗體用102PFU鼻內免疫小鼠，4周後用105PFU以同樣的途徑進行加強免疫。再過4周後用107PFU鼻內(IN)或腹膜內(IP)進行第三次免疫。第三次免疫8周後收集並合併洗鼻液，用ELISA法測定這些樣品與肽ELDKWA的反應性。作為對照(WT併集液)，合併用野生型(WT)流感病毒免疫的小鼠的洗鼻液並進行分析。採用與IN組相同的免疫方案(參見圖5)。所誘導出的抗體主要是由鼻黏膜產生的，可以看出抗體滴度極高。從圖5還可以看出，鼻內施用流感-ELDKWAS病毒產生的HIV-1中和性抗體的濃度比腹膜內施用時要高。
實施例7用流感-ELDKWAS病毒免疫的Balb/c小鼠的小腸分泌物中的IgA抗體用102PFU鼻內免疫小鼠，4周後用105PFU以相同的途徑進行加強免疫。再過4周後用107PFU鼻內(參見圖6a)或腹膜內(圖6b)進行第三次免疫。第三次免疫8周後收集並提取含有從小腸黏膜釋放的抗體的糞便，用ELISA法測定這些樣品與肽ELDKWA的反應性。INO、INR、INB和INS是鼻內接受第三次免疫的小鼠的樣品，樣品IPO、IPR、IPRS和IPS是從腹膜內接受第三次免疫的
權利要求
1.一種肽，該肽能夠誘導對HIV-1的不同毒株和/或臨床分離物具有中和活性並且/或者能抑制由HIV-1引起的細胞融合的抗體，該肽的特徵在於，該肽由選自ELDKWAS、LELDKWAS、ELDNWAS、ELNKWAS、LELDNWAS和LELNKWAS的胺基酸順序組成。
2.權利要求1的肽，其特徵在於該肽與一種載體連接。
3.權利要求2的肽，其特徵在於該肽是優選為重組形式的病毒的一部分，該病毒最好選自流感病毒、杆狀病毒和牛痘病毒。
4.權利要求2或3的肽，其特徵在於，至少一種所述胺基酸順序置換了一種病毒蛋白的至少一部分胺基酸順序，或者插入到一種病毒蛋白的至少一個抗原位點中。
5.權利要求4的肽，其特徵在於病毒蛋白選自流感病毒的血細胞凝集素(HA)、流感病毒的神經氨酸苷酶(NA)和B型肝炎病毒的表面抗原。
6.權利要求4的肽，其特徵在於病毒蛋白得自優選為重組形式的杆狀病毒或牛痘病毒。
7.六種由七個或八個胺基酸的順序組成的肽中的至少一種，優選所有六種，在製備一種藥物中的應用，所述胺基酸順序選自ELDKWAS、LELDKWAS、ELDNWAS、ELNKWAS、LELDNWAS和LELNKWAS，所述藥物用於誘導對HIV-1的不同毒株和/或臨床分離物具有中和活性並且/或者能抑制由HIV-1引起的細胞融合的抗體。
8.權利要求1的肽在製備一種藥物中的應用，所述藥物用於在優選以鼻內途徑給予哺乳動物時誘導由黏膜表面分泌的抗HIV-1 IgA抗體。
9.權利要求2-6中任一項的肽在製備一種藥物中的應用，所述藥物用於誘導對HIV-1的不同毒株和臨床分離物具有中和活性並能抑制由HIV-1引起的細胞融合的抗體。
10.權利要求2-6中任一項的肽在製備一種藥物中的應用，所述藥物用於在優選以鼻內途徑給予哺乳動物時誘導由黏膜表面分泌的抗HIV-1 IgA抗體。
11.權利要求1-6中任一項的肽在製備一種藥物中的應用，所述藥物用於預防和防止危險個體的HIV-1感染。
12.一種具有HIV-1中和活性並能夠防止由HIV-1引起的細胞融合的抗體，其特徵在於該抗體是由權利要求1的肽中的一種誘導的。
13.權利要求12的伉體，其特徵在於該抗體是一種分泌抗體，優選為一種抗HIV-1 IgA抗體，最好是由黏膜表面分泌的。
14.製備權利要求1的肽的方法，其中至少一種所述胺基酸順序是由化學方法或微生物學方法產生的。
15.權利要求14的方法，其中所述方法是一種微生物學方法，該方法包括在宿主生物的基因組中插入一段核苷酸順序，用標準微生物學培養技術進行基因組的表達，分離至少一種(優選多種)所述肽，其中所述核苷酸順序選自a)相應於所述胺基酸順序之一的核苷酸順序；b)與a)中的核苷酸順序之一雜交的核苷酸順序；c)用簡併法由a)中的核苷酸順序之一推測出的核苷酸順序。
16.製備權利要求2-6中任一項的肽的方法，該方法包括用化學方法或微生物學方法，使權利要求1的胺基酸順序與一種載體(優選為病毒或病毒蛋白)連接。
17.權利要求16的方法，其中所述方法是微生物學方法，該方法包括以下步驟使一個核苷酸順序與相應於載體胺基酸順序的核苷酸順序連接，將連接後的核苷酸順序轉移到一個宿主生物中，用標準生物學技術進行連接後順序的表達，分離至少一種(優選多種)與載體連接的肽，其中所述核苷酸順序選自a)相應於所述胺基酸順序之一的核苷酸順序；b)與a)中的核苷酸順序之一雜交的核苷酸順序；c)用簡併法由a)中的核苷酸順序之一推測出的核苷酸順序。
18.權利要求17的方法，其中使a)-c)中至少一個核苷酸順序與相應於載體病毒蛋白胺基酸順序的核苷酸順序連接，從而置換至少一部分相應於病毒蛋白胺基酸順序的核苷酸順序，或者插入到所述順序相應於病毒蛋白抗原位點的至少一個位點中。
19.權利要求18的方法，其中使用相應於一種病毒蛋白的核苷酸順序，所述病毒蛋白選自流感病毒的血細胞凝集素、流感病毒的神經氨酸苷酶、以及B型肝炎的表面抗原。
20.權利要求15和17-19中任一項的方法，其中用一種病毒作為宿主生物，所述病毒選自優選為重組形式的流感病毒和牛痘病毒。
全文摘要
描述了一種能誘導抗體的肽，這些肽優選包括由黏膜表面分泌的分泌抗體，這些抗體對HIV-1的不同毒株和臨床分離物具有中和活性，並能抑制由HIV-1引起的細胞融合。所述肽由7個或8個胺基酸的順序組成。該順序分別相應於HIV分離物BH10的gp160的gp41上662-668位的順序(ELDKWAS)或661-668位的順序(LELDKWAS)。所述肽優選包括由順序ELDNWAS、ELNKWAS、LELDNWAS或LELNKWAS組成的肽，或者在遺傳上由上列順序編碼的肽相應於所述胺基酸順序的核苷酸順序，或與所述核苷酸順序雜交的順序、或用簡併法由所述核苷酸順序推測出的順序。優選的是，這些肽置換一種病毒蛋白的一部分或若干部分胺基酸順序，或者插入在一種病毒蛋白的抗原位點中(例如通過各核苷酸順序的融合)，然後在生物表達系統中進行融合基因的表達。
文檔編號C07K7/06GK1135237SQ94194035
公開日1996年11月6日 申請日期1994年9月12日 優先權日1993年9月11日
發明者H·卡廷格, T·穆斯特 申請人:波利門科學生物免疫研究有限公司