含硒環糊精及其在製備治療白內障藥物中的應用的製作方法

2023-10-30 18:40:22

專利名稱：含硒環糊精及其在製備治療白內障藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於高活性人工酶領域，特別涉及用環糊精製備具有穀胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性的含硒環糊精。
在分子水平上模擬酶活性部位的微環境，吸收酶中對催化起主導作用的因素，設計和合成較天然酶簡單得多的非蛋白分子，作為人工模擬酶是當今自然科學領域中的前沿課題之一。生物學家一直在利用化學模擬方法來闡明自然界中酶的催化行為。鑑於人工酶分子可能具有與天然酶相媲美的專一性和催化功能，而本身又相當穩定，預示著它在化工、酶學、醫藥學等領域具有廣闊的應用前景。為此，美國和歐洲國家都把對酶的人工模擬列入未來研究的發展規劃。近年來，人們已建立起許多小分子仿酶體系，如環糊精、冠醚、環番，環芳烴和卟啉等。
穀胱甘肽過氧化物酶(GPX)是生物體內重要的含硒酶。由於它具有優良的抗氧化性，對治療和預防白內障、克山病、心血管病、炎症及癌症等具有很大潛力。但由於該酶不穩定，來源有限，分子量大會引起人體免疫反應等缺點，極大限制了此酶在醫藥學方面的開發和應用。而含硒人工酶可克服天然酶的弱點，因此，對此酶進行人工模擬越來越受到科學工作者的重視。稱為「小分子硒酶」的GPX模擬物Ebselen(PZ51)，是人工酶的突出代表，其催化機制及生物學活性已被詳細研究過。動物實驗表明，PZ51具有廣譜抗炎活性，對糖尿病、腫瘤、心血管疾病均有療效(文獻1、2)，目前在國外已進入臨床試驗階段。但作為藥物，PZ51最大缺點是活性較低、水溶性差，為了克服PZ51的弱點，解決其水溶性差，進一步提高其活性，我們選用環糊精來模擬GPX。
本發明的目的在於提供一種工藝簡單、產率高、穩定性和活性高的GPX人工酶。
本發明的原理是利用環糊精的疏水空腔作為酶的底物結合部位，用化學法活化環糊精上的羥基，再以NaHSe取代，則將羥基變成硒氫基，從而在環糊精上引入酶的催化基團，再經氧化得到具有GPX活性的產品——含硒環糊精(見合成路線圖)。
環糊精有三種α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精。無論哪一種都可用上述原理(合成路線)製成含硒環糊精。但是，環糊精上被活化的羥基的位置不同，最後所製得的含硒環糊精的GPX活性也不同。我們發現，活化β-環糊精的2位羥基所得到的含硒環糊精的GPX活性較高。
下面以β-環糊精的2位羥基製備含硒環糊精來舉例說明製備過程1．雙硒橋聯環糊精的合成路線1)將β-環糊精的2位羥基用對甲苯基磺醯氯活化製成β-環糊精-2位羥基苯基磺酸酯；2)β-環糊精-2位羥基苯基磺酸酯的硒化用硒氫基取代苯基磺酸酯基；3)硒氫基在空氣中氧化硒氫基在空氣氧化生成雙硒橋聯環糊精。2．雙硒橋聯環糊精的製備過程是合成路線如圖所示 (1)NaHSe製備(參照文獻3)將81.1mg(2.15mmole)NaBH4溶解在裝有1ml水的小瓶中，再將79mg(1mmole)硒粉緩慢加入到NaBH4的溶液中，蓋上一插有針頭的膠蓋，此時可以看到水中產生大量氣體，並伴隨有熱量放出。由於反應過於劇烈，所以需在冰浴中進行，以控制反應速度，其反應方程式如下由於NaBH4與H+反應，還伴有少量H2Se氣體產生，為防中毒，必須在通風櫥中反應。反應結束後，有大量鹽析出。NaHSe極易氧化，故應通入N2保存。(2)β-CD 2位磺醯化(參照文獻4)產物為β-CD-2-位羥基苯磺酸脂，簡稱2-OTs-β-CD。將2.0g(1.76mmole)β-CD溶於80ml NaOH(0.15mol/L)溶液中，室溫滴加含2.0g(9.66mmole)p-TsCl的乙腈溶液5ml，滴加過程中不斷加入1mol/L NaOH使溶液pH＞12.5,3h滴加完畢再攪拌1h，加入1mol/L HCl中和至中性，加入100ml甲醇，濾去不溶物，減壓蒸去甲醇和大部分水至20ml，放入5℃冰箱一周後有鹽析出，過濾後以水為洗脫劑經Bio-gel P-2柱層析，收集第一峰，凍幹，得產物1.38g，產率為65％。(3)雙硒橋聯環糊精的製備將100mg(0.075mmole)2-OTs-β-CD溶於50mM磷酸緩衝液中，通高純氮去氧，加入100μl 1mol/L NaHSe(0.10mmole),60℃反應36h，然後使反應體系充分暴露在空氣中氧化，離心除硒，上清液經Bio-gel P-2柱(5.0×50cm)分離純化，以蒸餾水為洗脫液，流速為1ml/min,254nm紫外監測收集第一峰，凍幹，用丙酮洗三次，真空烘乾得淡黃色粉末狀雙硒橋聯環糊精79mg，產率為80％。3．雙硒橋聯β-CD的結構表徵(1)元素分析表1．雙硒橋聯β-CD的元素分析
合成的2位雙硒橋聯β-CD的元素分析結果列於表1中。
從表1看出對2-SeCD的元素分析實驗值與理論值基本符合，證明化合物的分子式為C84H138Se2·6H2O。(2)紅外光譜分析紅外光譜分析(KBr壓片)結果如表2所示。
表2．雙硒橋聯β-CD的紅外光譜
從表2分析，紅外光譜出現了磺酸酯的特徵吸收峰1177,1364cm-1和苯環的特徵吸收峰1598,1496,845和815cm-1而在SeCD中磺酸酯和苯環的特徵吸收消失，說明磺酸酯已被硒氫基(-SeH)置換下來，而CD的結構特徵未變化。(3)核磁共振分析表3雙硒橋聯環糊精的1HNMR、13CNMR譜
利用D2O為溶劑測定了雙硒橋聯環糊精的。1H NMR和13C NMR，其結果列於表3中，所得數據表現出2位羥基取代的結構特徵，結果表明硒氫基被引入環糊精的2位。(4)質譜分析雙硒橋聯環糊精的分子量由雷射質譜測定為2393.7(理論值C84H138Se2.2393)，與計算值十分吻合，進一步證明合成的化合物是以硒橋聯形式存在。(5)硒價態及含量分析利用X-射線光電子能譜技術，以鎂(MgKα)作靶，測定了模擬物中硒的價態為-1價。標準物硒代胱氨酸(Se-Cyss)的電子能譜圖的Se(3d,5/2)電子結合能為55.1eV，模擬物的電子結合能為54.9eV，表明硒的價態與標準物很接近。進一步確證了模擬物的硒結合形式與硒代胱氨酸一致，為硒橋聯形式。
綜合上述結構分析，確定雙硒橋聯環糊精的結構如下
4．雙硒橋聯環糊精酶活性及穩定性(1)硒橋聯環糊精的GPX活力[5]測活體系700μL，含50mmol/L磷酸鉀緩衝液，pH7.0,1mmol/L疊氮鈉，1mmol/L穀胱甘肽，0.25mmol NADPH,1U穀胱甘肽還原酶，加入0.5mmol/L H2O2啟動反應，在340nm處監測NADPH被氧化的吸光度的變化。測定酶活力時，以蒸餾水代替人工酶為空白對照。模擬酶活力單位定義為每分鐘每微摩爾人工酶消耗1微摩爾NADPH為一個活力單位。
表4雙硒橋聯環糊精的酶活力
(2)雙硒橋聯環糊精的穩定性雙硒橋聯環糊精在pH7.0,50mmol/L PBS溶液中保存半年活力保持92％，乾粉酶活力保持不變。5．雙硒橋聯環糊精治療白內障的效果取32隻患先天性白內障的大鼠，分兩組治療組和對照組，每組16隻。治療組每天滴眼0.33U(GPX活性單位)的雙硒橋聯環糊精，15天後，14隻鼠眼的白內障消逝，另兩隻鼠眼的白內障也有很大程度的減輕。對照組每天用同樣量的未硒化的環糊精滴眼，15天後，白內障程度沒有減輕。經15天試驗後的大鼠，反應靈敏、健康狀況良好。由此可見，雙硒橋聯環糊精可有效治療白內障。
本發明有如下特點1．製備方法簡單，合成步驟少，產率高，可擴大生產。
2．人工酶模型簡單，以環糊精空腔為底物結合部位，以雙硒橋為催化基團。
3．本發明製備的含硒環糊精GPX活力高，為世界上最好的小分子GPX模擬物PZ51的7倍。
4．雙硒橋聯環糊精作為藥物可克服天然GPX不穩定，來源有限，分子量大會引起人體免疫反應，不易過膜等缺點。
5．雙硒橋聯環糊精穩定。
6．它具有優良的抗氧化性，對治療和預防白內障、心血管病、炎症及癌症等具有非常大的應用潛力。
綜上所述，本發明所述的含硒環糊精製備工藝簡單，產率高，可大量生產，且含硒環糊精GPX活性高、穩定性好、能有效治療白內障。同時可克服天然酶用作藥物產生的免疫原性大，過膜困難，不穩定等缺點。因此，在醫藥上具有巨大的應用潛力。
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5)Wilson SR,Zucker PA,Spcetor AR,J.Am.Chem.Soc.,1989,111:593權利要求
1.一種由合成路線(1)所製取的含硒環糊精，其特徵在於所述的環糊精可以為α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精中的任何一種，用化學法活化環糊精上的羥基，再以NaHSe取代羥基變成硒氫基，在環糊精上引入酶的催化基團，經氧化得到具有GPX活性的含硒環糊精； (1)
2.一種如權利要求1所述的含硒環糊精，其特徵在於活化β-環糊精的2位羥基所得到的含硒環糊精結構式如(2)所示； (2)
3.如權利要求1或2所述的含硒環糊精，其特徵在於具有較高的穀胱甘肽過氧化物酶活性；
4.權利要求1或2或3所述的含硒環糊精在製備治療白內障藥品中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種含硒環糊精。採用簡單的化學合成法,以環糊精疏水空腔作為酶的底物結合部位,以雙硒橋為催化基團,將催化基團與結合部位配置在一起,成功製備出具有較高穀胱甘肽過氧化物酶活性的小分子含硒環糊精。本發明所述含硒環糊精具有製備工藝簡單、產率高、可大量生產、穀胱甘肽過氧化物酶活性高、穩定性好等特點,在治療白內障等方面具有巨大的應用潛力。
文檔編號A61P27/00GK1306009SQ00133040
公開日2001年8月1日 申請日期2000年11月17日 優先權日2000年11月17日
發明者羅貴民, 劉俊秋, 任曉君, 閻崗林, 牟穎, 楊同書, 沈家驄 申請人:吉林大學