一種檢測乳蛋白含量的光激化學發光免疫定量試劑盒及方法
2023-10-30 05:29:27
專利名稱：：一種檢測乳蛋白含量的光激化學發光免疫定量試劑盒及方法
技術領域：
：本發明涉及乳蛋白檢測領域，特別涉及一種檢測乳蛋白含量的光激化學發光免疫定量試劑盒及方法，適用於原料乳、乳製品、食品及飼料等乳蛋白含量的檢測。
背景技術：
：牛奶是一種組成複雜、結構有序、具有膠體溶液特徵的生物營養溶液，牛奶的營養素全面、易吸收，牛奶中含有的各種化學成分都是人體所必需的營養素，也是常人膳食中植物性蛋白質的重要補充。牛奶中大約含有3000種化合物，其中主要成分有水、脂肪、蛋白質、乳糖和礦物質，其微量成分有維生素、酶類、奩脂、色素、激素及生長因子、有機酸、氣體和體細胞等。牛奶中各主要成分的含量因牛種和品種(遺傳因素)、年齡和胎次、泌乳階段和季節、飼養管理條件、產奶水平和擠奶技術，以及奶牛的個體特徵和健康狀況等有一定的差別。牛奶約含3.5%的乳蛋白質(人奶約1.25%)，包括酪蛋白、a_乳清蛋白、乳球蛋白、乳球蛋白和脂球膜蛋白、多種酶類等，其中以酪蛋白為主佔蛋白總量86%左右，其次為a-乳清蛋白約佔總蛋白量的9%，乳球蛋白佔總蛋白量的3%左右，它們都含有全部必須的胺基酸，其相對含量與雞蛋蛋白近似，消化率較高，為96.1%。乳蛋白質含量是牛奶最重要的質量指標之一，對於製造幹酷和酸奶等乳製品的原料奶尤其重要，國家規定，只有乳蛋白質含量>的飲品才允許稱為含乳飲料。牛奶中的酶有來母牛乳腺組織、血漿及白細胞的，稱為原生酶，有來自微生物代謝產物的，稱為細菌酶，有幾種酶被用來控制和檢驗牛奶質量，最重要的有過氧化氫酶、酌酸酶和解脂酶等，牛奶中的酶對牛奶加工和乳品保存等方面都有影響。乳過氧化物酶是一種血紅素蛋白存在於乳中，牛奶中正常含量為30μg/ml，其分子量為77.5ku。乳過氧化物酶/硫氰酸鹽/過氧化氫(LP/SCN/H202)，簡稱為乳過氧化物酶體系(LP體系)，在牛奶中起強有力的抗菌作用，是牛乳天然抗菌能力的物質基礎。牛奶及乳製品的蛋白質含量檢測的現行國家標準是根據化學定氮法測算總氮含量來推算蛋白質含量，這也是國際通用的方法，但是這種方法不能分辨蛋白質的真偽，尤其是不能識別化學物質如三聚氰胺、尿素等添加後轉變成的「蛋白質」，「大頭娃娃米粉」、「三聚氰胺牛奶」事件的發生和蛋白含量檢測方法的落後有直接的關係。能夠精確定量檢測原料乳及乳製品中特定蛋白含量的方法有高效液相色譜、毛細管電泳和質譜聯用檢測，這些儀器設備非常昂貴需要數百萬元，日常維護和運行成本也很大，並且需要對樣品進行繁瑣的預處理，不適合生產中的常規檢查。現在已有採用酶聯免疫方法檢測牛奶及奶製品中的三聚氰胺，但是非均相反應，需要反覆清洗與分離，檢測程序繁瑣、耗時長、靈敏度和自動化程度不高，還有些比較方便快速的檢測方法只能定性檢測一個大致的含量範圍不能定量。光激化學發光免疫定量法是在化學發光免疫分析的基礎上引入雷射激發和納米微球技術，採用抗體特異性免疫捕獲目標分子，以發光物質作為信號放大系統，通過測定發光強度檢測免疫結合程度來定量，目標分子濃度和發光強度之間有很好的線性關係。光激化學發光免疫定量法成功的解決了上述檢測方法的不足，因為反應是在均相進行，操作簡單，樣品不需要預處理，既加快了反應速度，又避免了反覆分離與清洗的過程，可實現自動化操作，由於其高度的特異性、抗幹擾、測量速度快、靈敏度高、穩定性好等優點，有很好的應用前景。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏度高的特異性檢測乳蛋白含量的光激化學發光免疫定量試劑盒及方法。本發明通過將乳蛋白抗體包被的發光微粒、生物素標記的乳蛋白抗體(乳蛋白抗體與生物素的偶聯物)以及親和素包被的感光微粒，與被檢測樣品混合後，在均相條件下，乳蛋白抗體可迅速特異性捕獲樣品中的乳蛋白，形成感光微粒_抗體_乳蛋白_抗體_發光微粒複合體，在雷射激發下，感光微粒能使周圍環境中的氧轉化為高能態離子氧，發光微粒在近距離接受離子氧的激發後發射高能級光子，用光子計數器檢測這些高能級光子，光子數的多少即精確地反應乳蛋白分子的濃度，兩者之間有良好的線性關係，通過標準曲線將光強度換算成乳蛋白濃度。根據現有技術，反應中的高能態離子氧在溶液中生存時間只有4微秒，可傳播直徑約為200nm，當樣本中不含乳蛋白時，不能形成雙抗體夾心的複合體，因距離太遠活性氧離子無法傳遞到發光微粒表面就已經在溶液中迅速淬滅，發光微粒不能被激發無高能級光子產生。檢測時原料乳及乳製品等樣品不需要預處理可直接測定，仍然有很低的檢測背景值。因此，本發明通過下列技術方案來解決上述問題一種檢測乳蛋白含量的光激化學發光免疫定量試劑盒，其中包括乳蛋白抗體包被的發光微粒、生物素標記的乳蛋白抗體、親和素包被的感光微粒以及緩衝液溶劑。根據本發明，所說的乳蛋白是指哺乳動物乳如牛乳、羊乳或馬乳等乳中含有的蛋白質，例如酪蛋白、a-乳清蛋白、乳球蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、酌酸酶及解脂酶等；相應地，所說的乳蛋白抗體可以是以上述乳蛋白為抗原，以兔、鼠、羊等為免疫動物製備的單克隆抗體或多克隆抗體，包括各種亞型，本發明的試劑盒中使用的乳蛋白抗體可以選擇其中的一個或多個，通常可以從市場購得。本發明優選兔抗牛的α-酪蛋白(a-casein)多克隆抗體、兔抗牛的α-乳清蛋白(α-lactalbumin)多克隆抗體作為乳蛋白抗體為例來具體說明。較佳地，試劑盒中還包括乳蛋白標準品，可以是以上抗體對應的抗原，本發明的試劑盒中的標準品優選0.1μg/ml酪蛋白溶液、0.1μg/ml的a_乳清蛋白溶液。根據本發明，所述的緩衝液溶劑，即乳蛋白檢測時的反應溶液的溶劑可以是常規的適合抗原抗體反應的溶劑體系，如HEPES緩衝體系、Tris緩衝體系等。但本發明優選HEPES緩衝體系，可使檢測方法更穩定。更優選地，所述的緩衝液溶劑為pH8.0,0.025M的HEPES緩衝體系。所述的PH8.00.025M的HEPES緩衝溶液每IOOOml含有HEPES6g,BSAlg,GlycerIOOg,Dextran-500lg，TritonX-IOO5g,EDTA-Na-2H200.372g,Proclin-3000.5g。所述的緩衝液溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護作用的物質，以及防止微粒聚集的穩定試劑如Tween20，出於對試劑防腐及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優選100U/ml慶大黴素和0.05v/v%&Proclin300[2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MCI)]作為防腐劑。根據本發明，上述發光微粒是指填充有發光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒，其中，發光化合物可以是Dioxene(二氧雜環乙烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/Τ0Ρ0或Eu(TTA)3/Phen等，這些微粒可由市場上購得。發光微粒的發光量會直接影響最終檢測的發光效果，市場提供的發光微粒發光量一般會在50，00010，000,000光子數/IOOug發光微粒範圍內，本發明優選150，000350，000光子數/IOOug發光微粒。由於最終的檢測反應是均相反應，發光微粒的粒徑太小(<50nm)，會使製備過程中的清洗工作比較困難，不利於抗體連接，因此發光微粒的粒徑範圍應在50400nm之間，較好為100300nm之間，優選250nm。發光微粒的表面官團可以是任何能連接蛋白質的基團，如羧基、醛基、胺基、環氧乙基或滷代烷基等各種已知的可以連接蛋白質的官能團，最優化的微粒表面官能團為羧基或醛基，不同的微粒表面官能團，連接抗體的反應方式和條件也不相同。醛基表面的微粒有很好的親水性，顆粒均勻穩定，微粒表面容易修飾，並且與蛋白的反應比較容易，採用NaBH3CN還原胺化反應，反應生成的碳氮鍵穩定，抗體連接的效率高，重複性好，本發明選取醛基作為連接蛋白的官能團。較佳的，所述的乳蛋白抗體包被的發光微粒可由下述方法製得1)混合將發光微粒與乳蛋白抗體混合於MES緩衝液中，其中發光微粒的濃度為1040mg/ml；2)反應加入MES緩衝液配製的NaBH3CN溶液混合併反應；3)封閉加入MES緩衝液配製的Glycin(甘氨酸)及NaBH3CN溶液，混勻反應後，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產物，獲得乳蛋白抗體包被的發光微粒。較佳地，步驟1)中每Img發光微粒加入0.052mg的乳蛋白抗體。其中，上述步驟1)_3)中的緩衝液可以是相同的反應緩衝液，可為MES緩衝液、磷酸緩衝液，優選MES緩衝液，濃度優選0.05M,pH為6.0。步驟4)清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟採用反應緩衝液透析，每次45小時，更換緩衝液4次。透析清洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應緩衝液洗滌，超聲處理打開沉澱，如此反覆35次。離心法清洗時離心力會使發光微粒暫時聚集在一起，但經過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此本發明優選採用離心法清洗方式。根據本發明，所述生物素標記的乳蛋白抗體中，生物素標記抗體的方法採用常規的方法(《生物實驗室系列一分子免疫學實驗指南》)進行，生物素與抗體的摩爾比較佳為5501，優選301。根據本發明，所述親和素包被的感光微粒可根據現有技術製備(馬宏偉，趙衛國，潘柏申，血清心肌肌鈣蛋白I光激化學發光免疫測定法的建立[J].檢驗醫學，2007，22(4)398-401)，親和素包被的感光微粒採用NaBH3CN的還原胺化反應法製備，親和素(Avidin)與感光微粒的質量比例無特殊限制，較佳為1310，優選15。市售感光微粒均適用於本發明，微粒粒徑較佳為180260nm，優選220nm。本發明採用上述的試劑盒檢測乳蛋白的光激化學發光免疫定量方法，其可包括下列步驟1)在反應孔中加入稀釋後的待測樣品、加有緩衝液溶劑的乳蛋白抗體包被的發光微粒混懸液及生物素標記的乳蛋白抗體混懸液，獲得初始反應溶液，充分混合；2)加入加有緩衝液溶劑的親和素包被的感光微粒混懸液獲得最終反應溶液進行反應；3)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值。較佳地，步驟1)中的乳蛋白抗體包被的發光微粒混懸液的濃度為50μg/ml，生物素標記的乳蛋白抗體混懸液的濃度為4μg/ml；步驟2)中的親和素包被的感光微粒混懸液的濃度為80μg/ml。步驟2)所述的反應條件可同常規。步驟3)可採用現有技術，所述的激發光光源波長範圍為600800nm，優選640680nm；發射光檢測波長範圍為500680nm，優選610620nm。本發明的試劑盒和檢測方法以納米級高分子微粒為基礎，採用特異性抗體免疫捕獲和化學發光相結合的定量檢測技術來測定樣本中酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等乳蛋白含量，用於判斷產品的質量優劣，具有快速、均相(免衝洗)、高靈敏、高通量和操作簡單的特點，使用本發明的乳蛋白定量檢測方法替代非特異性的化學定氮法檢測乳蛋白含量，可以用於特異性、快速、準確、靈敏地檢測乳及乳製品、蛋白類食品、飼料等產品中的乳蛋白含量，從而從根本上杜絕在產品中摻入含氮化合物或非乳蛋白的蛋白質冒充乳蛋白含量的事件。圖1是實施例4.1組配的試劑盒的特異性檢測結果圖。檢測樣品分別是牛奶、酸奶、a_酪蛋白溶液、水、豆漿、牛血清白蛋白水溶液、水解酪蛋白溶液和魚蛋白水溶液，縱坐標是光量子讀數反映樣品中酪蛋白含量的高低。圖2是酪蛋白標準曲線圖圖3是實施例4.2組配的試劑盒測定的a_乳清蛋白標準曲線圖具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。在下述實施例中，原料、試劑、儀器來源如下，其中所說的乳蛋白或乳蛋白抗體是以α-酪蛋白及其兔抗牛的多克隆抗體，α-乳清蛋白及其鼠抗牛的多克隆抗體，和乳過氧化物酶及其兔抗牛的多克隆抗體為例來說明。原料及試劑廠家酪蛋白抗體AbcamSSSSCaseinproteinSigmaα-乳清蛋白抗體α-lactalbumin-antibodyBethylα-乳清蛋白α-IactalbuminproteinSigma生物素Biotin-X-X-NHSSigmaTLC595%4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES華美生物工程公司三羥甲基氨基甲烷乙酸鹽TrisSigma牛血清白蛋白BSAEquitech/proteasefree甘氨酸Sigma氰硼氫化鈉NaBH3CNAcros感光微粒(粒徑220nm)博陽生物科技公司發光微粒(粒徑150-300nm)博陽生物科技公司儀器型號廠家粒徑儀Model370Nicomp酶標儀MultiSKANMK3Iabsystem紫外可見分光光度計752P上海光譜有限公司螢光分光光度計F95上海稜光技術有限公司光激化學發光分析系統博陽生物科技公司各個反應體系緩衝液配製1)ρΗ8.0的HEPES緩衝液成分為0.05MHEPES、0.3MNaCl禾口0.0015MEDTA-Na-2H20，還含有0.lw/v%&BSA及100U/ml慶大黴素和質量百分比為0.05%的Proclin300。2)pH8.0的Tris緩衝液的成分為0.IMTris,0.3MNaCl和0.0015MEDTA-Na-2H20，0.lw/v%的BSA及100U/ml慶大黴素和質量百分比為0.05%的Proclin300。3.樣品稀釋緩衝液溶劑配製是PH8.025mMHEPES緩衝液每1000ml含有HEPES6g,BSAlg,Glycer100g,Dextran-500lg,TritonX_1005g，EDTA_Na_2H200.372g,Proclin-3000.5g。實施例1乳蛋白抗體包被的發光微粒的製備製備方法1)發光微粒混懸液處理吸取發光微粒於高速冷凍離心機中12000rpm離心30分鐘，棄去上清，加入一定量0.05M、pH6.0的MES緩衝液(以下簡稱MES反應緩衝液)，超聲使微粒重新懸浮，用MES反應緩衝液調節發光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理用MES反應緩衝液透析乳蛋白抗體，透析完成後測定濃度，並用MES反應緩衝液調節濃度至8mg/ml。3)以125的體積比將MES反應緩衝液、步驟2)的乳蛋白抗體溶液、步驟1)的發光微粒混懸液及三部分進行混合，迅速混勻，得到反應液。4)用MES反應緩衝液配製25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟3)所得反應液125的體積比加入，迅速混勻，37°C旋轉反應48小時。5)用MES反應緩衝液配製75mg/ml的Glycin溶液和25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟4)所得反應液2110的體積比加入步驟4)所得反應液中，混勻，37°C旋轉反應2小時。6)用MES反應緩衝液配製200mg/ml的BSA溶液，其與步驟5)所得反應液體積比為58，迅速混勻，37°C旋轉反應16小時。7)用0.05M、pH8.0的MES緩衝液12000rpm離心3min,清洗三次，最後用pH8.0的MES緩衝液進行懸浮，測定粒徑在150300nm範圍，用pH8.0的MES緩衝液調節溶液體積使固體含量為10mg/ml。實施例2乳蛋白抗體與生物素偶聯物的製備製備方法1)抗體處理按常規將乳蛋白抗體用0.1MNaHC03溶液透析，測定抗體濃度並調節至lmg/ml02)按常規用DMS0配製16.17mg/ml的Biotin(生物素)溶液。3)標記取步驟1)處理好的lmg/ml乳蛋白抗體與步驟2)配好的Biotin溶液，按照生物素和抗體溶液201的體積比進行混合，迅速混勻，28°C靜置反應1216小時。4)按常規將反應好的乳蛋白抗體與生物素的偶聯物用pH8.OTris緩衝液透析。5)將步驟4)透析好的生物素和抗體的偶聯物吸出轉移至乾淨離心管中，取樣測定抗體濃度，PH8.OTris緩衝液調節濃度至0.5mg/ml。6)按照步驟3)將生物素與抗體按照不同體積比製備偶聯物，用pH8.OTris緩衝液稀釋成g/ml，按照實施例5方法檢測lOOng/ml標準品溶液每孔發光光子量tableseeoriginaldocumentpage8從發光強度判斷，20401比較好，優選301，但是不同的抗體之間有一定的差距。實施例3親和素包被的感光微粒的製備可以採用現有技術，具體製備方法如下1)感光微粒混懸液處理選用粒徑為220士40nm的感光微粒，吸取一定量的感光微粒於高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩衝液，超聲震蕩至微粒重新懸浮，加入MES反應緩衝液調節感光微粒濃度至100mg/ml。2)親和素溶液配製稱量一定量Avidin，加MES反應緩衝液溶解至8mg/ml。3)混合將處理好的感光微粒混懸液、8mg/ml的親和素以及MES反應緩衝液，以2:5:1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。4)反應MES反應緩衝液配製25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟3)的反應液125的體積比加入，迅速混勻，37°C旋轉反應48小時。5)封閉MES緩衝液配製75mg/ml的Glycin溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與步驟4)的反應液2110的體積比加入步驟4)的溶液中，混勻，37°C旋轉反應2小時。6)再加入200mg/ml的BSA溶液(MES反應緩衝液)，其與反應液體積比為58，迅速混勻，37°C旋轉反應16小時。7)清洗向反應好的溶液中加入pH8.0MES緩衝液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入新鮮PH8.0的MES緩衝液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最後用少量的緩衝液溶劑進行懸浮，測定固含量，用緩衝液溶劑調節濃度至10mg/ml。實施例4試劑盒的組配4.1組建檢測乳蛋白的光激化學發光免疫定量試劑盒，使其包含下列組分，其中乳蛋白抗體包被的發光微粒、乳蛋白抗體和生物素偶聯物和親和素包被的感光微粒以緩衝液溶劑為溶劑介質配成實際檢測所需濃度的混懸液，所述濃度可以根據需要進行調整。1)試劑a50ug/ml酪蛋白抗體包被的發光微粒混懸液2)試劑b:4yg/ml酪蛋白抗體和生物素偶聯物混懸液3)試劑c80ug/ml親和素包被的感光微粒混懸液4)標準品溶液0.1ug/ml酪蛋白溶液4.2組建檢測乳蛋白的光激化學發光免疫定量試劑盒，使其包含下列組分1)試劑a50ug/mla-乳清蛋白抗體包被的發光微粒混懸液2)試劑b:4yg/mla-乳清蛋白抗體和生物素偶聯物混懸液3)試劑c80ug/ml親和素包被的感光微粒混懸液4)標準品溶液0.1ug/ml的a-乳清蛋白溶液。實施例5牛奶樣品中酪蛋白濃度檢測5.1用試劑盒檢測牛奶中酪蛋白含量分別取10ii、9.5ii、10.5iU牛奶(超市購買盒裝)加樣品緩衝液至1ml，混合均勻，從中吸取lOiil加樣品緩衝液至1ml，混合均勻，再次從中吸取10i!加樣品緩衝液至lml，混合均勻，為樣品檢測溶液。移液器吸取檢測溶液5yl於96孔檢測板，依次加入10yl試劑a(50i!g/ml酪蛋白抗體包被的發光微粒)和lOyl試劑b(4yg/ml酪蛋白抗體和生物素偶聯物)，將檢測板放入檢測儀，設定程序條件為振動，37°C孵育20min，加入25iU試劑c(80ug/ml親和素包被的感光微粒)，37°C孵育15min，680nm激發光逐孔照射，檢測波長610620nm，檢測發光光子量。根據標準曲線計算樣品中乳蛋白的濃度，也可以用回歸方程法計算出樣本中乳蛋白的含量。tableseeoriginaldocumentpage105.2試劑盒特異性試驗分別取0.lml牛奶、酸奶、酪蛋白標準品溶液、水、豆漿、牛血清白蛋白水溶液、水解酪蛋白、魚蛋白水溶液，按照5.1中的方法，檢測發光光子量，比較試劑盒的特異性，結果見下圖。5.3試劑盒線性檢測取適量0.1ug/ml的酪蛋白標準品溶液用樣品緩衝液稀釋配成0.001ug/ml、0.006ug/ml,0.01ug/ml,0.03ug/ml,0.06ug/ml,0.1ug/ml共6個濃度的酪蛋白定標溶液，按照上述5.1中的方法測定乳蛋白的濃度，重複3次求平均值，做線性分析，R2=0.9924。實施例6牛奶中a-乳清蛋白濃度檢測6.1用試劑盒進行檢測取0.lml牛奶(超市購買盒裝)加樣品緩衝液至1ml，混合均勻，從中吸取0.01ml加樣品緩衝液至1ml，混合均勻，再次從中吸取0.01ml加樣品緩衝液至1ml，混合均勻，為樣品檢測溶液。移液器吸取檢測溶液5ill於96孔檢測板，依次加入10u1試劑a(50ug/mla-乳清蛋白抗體包被的發光微粒)和10yl試劑b(4ug/mla-乳清蛋白抗體和生物素偶聯物)，將檢測板放入檢測儀，設定程序條件為振動，37°C孵育20min，自動加入25yl試劑c(80ug/ml親和素包被的感光微粒)，37°C孵育15min，680nm激發光逐孔照射，檢測波長610620nm，檢測發光光子量。根據標準曲線計算樣品中a_乳清蛋白的濃度，也可以用回歸方程法計算出樣本中乳清蛋白的含量。利用專業電腦軟體可以直接讀取濃度結果，便於大量樣本的快速分析。6.2試劑盒精密度試驗取二個已知濃度的a_乳清蛋白溶液於同一個96孔檢測板，每孔5yl共加9孔，按照6.1中的方法，測定a_乳清蛋白濃度，計算變異係數CV%。結果表明變異係數範圍在6.27.2%之間，變異係數小於10%。tableseeoriginaldocumentpage106.3試劑盒線性檢測取適量0.1ug/ml的a-乳清蛋白標準品溶液用樣品測定緩衝液稀釋配成lOOng/ml,30ng/ml,10ng/ml,3ng/ml,lng/ml,0.3ng/ml共6個濃度的a_乳清蛋白定標溶液，用緩衝液為空白對照，按照上述6.1中的方法測定乳蛋白的濃度，重複3次求平均值，做線性分析，R2=0.9988。tableseeoriginaldocumentpage11權利要求一種檢測乳蛋白的光激化學發光免疫定量試劑盒，其特徵在於其包括乳蛋白抗體包被的發光微粒、生物素標記的乳蛋白抗體、親和素包被的感光微粒以及緩衝液溶劑。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的緩衝液溶劑為PH8.025mMHEPES緩衝液。3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述的PH8.025mMHEPES緩衝液每IOOOml含有HEPES6g,BSAlg,Glycer100g,Dextran-500lg，TritonX-1005g，EDTA-Na_2H200.372g,Proclin-3000.5g。4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的乳蛋白抗體包被的發光微粒由下述方法製得1)混合將發光微粒與乳蛋白抗體混合於MES緩衝液中，其中發光微粒的濃度為1040mg/ml；2)反應加入MES緩衝液配製的NaBH3CN溶液混合併反應；3)封閉加入MES緩衝液配製的Glycin及NaBH3CN溶液，混勻反應後，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產物，獲得乳蛋白抗體包被的發光微粒。5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於步驟1)中每Img發光微粒加入0.052mg的乳蛋白抗體。6.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述的MES緩衝液的濃度為0.05M、pH為6.0。7.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的乳蛋白選自酪蛋白、乳清蛋白和乳鐵蛋白。8.一種採用如權利要求17任一項所述的試劑盒檢測乳蛋白的光激化學發光免疫定量方法，其特徵在於包括下列步驟1)在反應孔中加入稀釋後的待測樣品、加有緩衝液溶劑的乳蛋白抗體包被的發光微粒混懸液及生物素標記的乳蛋白抗體混懸液，獲得初始反應溶液，充分混合；2)加入加有緩衝液溶劑的親和素包被的感光微粒混懸液獲得最終反應溶液進行反應；3)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於步驟1)中的乳蛋白抗體包被的發光微粒混懸液的濃度為50μg/ml，生物素標記的乳蛋白抗體混懸液的濃度為4μg/ml；步驟2)中的親和素包被的感光微粒混懸液的濃度為80μg/ml。10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於步驟3)所述的激發光光源波長範圍為600800nm；發射光檢測波長範圍為500680nm。全文摘要本發明公開了一種檢測乳蛋白的光激化學發光免疫定量試劑盒和方法。該試劑盒包括乳蛋白抗體包被的發光微粒、生物素標記的乳蛋白抗體、親和素包被的感光微粒以及緩衝液溶劑。本發明的試劑盒和方法可以快速、靈敏、準確、專一性測定原料乳和乳製品及其他產品中酪蛋白、乳清蛋白等乳蛋白含量。文檔編號G01N21/63GK101813699SQ20091020582公開日2010年8月25日申請日期2009年10月9日優先權日2009年10月9日發明者毛曉伏申請人:毛曉伏