黃瓜果實多刺基因ns的Indel標記及其應用的製作方法

2023-09-23 21:52:25

黃瓜果實多刺基因ns的Indel標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明「黃瓜果實多刺基因ns的Indel標記及其應用」，涉及生物技術輔助育種領域。本發明公開了與黃瓜果實多刺基因ns連鎖的Indel標記，其特徵在於：Indelns24-F/Indelns24-R：TTTGAATGGCAGAAGAGAGT/TCCCTCTTTATTTGTGAACC。所述Indel標記擴增的與黃瓜果實多刺基因ns連鎖的特徵條帶為216bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述Indel標記擴增的與黃瓜果實少刺基因Ns連鎖的特徵條帶為219bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示；採用本發明獲得的Indel標記，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行果實多刺材料的篩選，具有高效、限制少的優點，為選育多刺黃瓜提高了選擇效率，縮短了育種周期。
【專利說明】黃瓜果實多刺基因 ns的Indel標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術輔助育種領域，特別涉及一種黃瓜果實多刺基因 ns的Indel 標記及其在黃瓜育種材料選擇中的應用。

【背景技術】
[0002] 黃瓜（Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其風味清香、口感脆爽、營養 豐富，深受各國消費者的喜愛。作為重要的果菜類蔬菜，果實品質一直是黃瓜育種研究的重 點。黃瓜果實品質包括外觀品質和內在品質。通常說的品質性狀主要指商品性即外觀品 質，包括瓜色、瓜長、果刺多少、果刺顏色、果瘤大小、果色均勻度、光澤度、果稜、果實表面黃 色條紋等。果刺多少作為黃瓜重要的商品性狀之一，對商品銷售影響很大。一般來講，國內 市場上需求密刺黃瓜，目前生產上主推的品種絕大多數為密刺。研究黃瓜果刺多少的遺傳 規律及分子標記，對於選育符合市場需求的新品種具有重要意義。
[0003] 關於控制黃瓜果刺的相關基因，已報導的有五個基因，分別為s、S-2、S-3、SS和 ns。前人對於果刺多少的遺傳規律進行了多項研究。1984年Fanourakis首次報導了控制 黃瓜果實多刺的基因（ns)，少刺Ns對多刺ns為顯性。隨後Fanourakis和Simon的研究也 表明，黃瓜果實少刺對多刺為顯性，且與小刺基因（ss)存在連鎖關係。對於黃瓜果實多刺 基因的分子標記研究較少。苗晗等將果刺多少作為數量性狀來研究，在6號染色體（Chr. 6) 上檢測到主效QTL位點，並將主效QTL定位在了 Chr. 6上SSR14652-SSR20680內。可見，到 目前為止，與質量性狀基因 ns緊密連鎖的Indel標記尚未見報導。


【發明內容】

[0004] 本發明基於上述領域的空白，提供了與黃瓜果實多刺基因 ns連鎖的Indel標記， 並提供了其在選擇黃瓜果刺多少種質資源上的應用。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] -種與黃瓜果實多刺基因 ns連鎖的Indel標記，其特徵在於：其引物的核苷酸序 列如下：Indelns-24-F/Indelns_24-R :
[0007] TTTGAATGGCAGAAGAGAGT/TCCCTCTTTATTTGTGAACC ；
[0008] 所述引物擴增的與黃瓜果實多刺基因 ns連鎖的特徵條帶為216bp，核苷酸序列如 Seq ID No. 1 所示；
[0009] 所述引物擴增的與黃瓜果實少刺基因 Ns連鎖的特徵條帶為219bp，核苷酸序列如 Seq ID No. 2 所示。
[0010] 所述Indel標記在篩選具有果實多刺基因 ns的黃瓜種質資源中的應用，其特徵在 於，包括如下步驟：
[0011] (1)採用上述Indel標記的引物對待選黃瓜品種的基因組DNA分別進行PCR擴增；
[0012] (2)對PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測；
[0013] (3)從檢測結果中篩選出現與黃瓜果實多刺基因 ns連鎖的Indel標記特徵條帶一 致的材料。
[0014] 所述PCR反應體系為：0.75ng/ul DNA模板，正向和反向引物各5ng/ul，0.5yL/ul G〇「aq? Green Master Mix，其餘為雙蒸水。
[0015] 所述PCR擴增程序為：94°C預變性4分鐘；94°C變性15秒，55 °C退火15秒，72 °C延 伸30秒；35個循環；72 °C保溫5分鐘，16 °C保存。
[0016] 所述凝膠電泳檢測是指將所述PCR擴增產物上樣用6 %的非變性聚丙烯醯胺凝 膠，在150V恆功率下進行電泳分離，再經銀染顯色，最後進行條帶統計。
[0017] 本發明以現有已知品種黃瓜果實多刺自交系WI 2757和少刺自交系Wis. SMR18為 親本構建FI、F2群體，對果實多刺基因 ns進行了遺傳規律分析。以F2群體為作圖材料， 利用BSA法和Indel技術，實現ns基因的染色體遺傳定位，並獲得緊密連鎖的Indel標記 Indelns-24,與ns的遺傳距離為I. lcM。所述Indel標記引擴增的與黃瓜果實多刺基因 ns 連鎖的特徵條帶為216bp，核苷酸序列如Seq ID No. 1 ;所述Indel標記擴增的與黃瓜果實 少刺基因 Ns連鎖的特徵條帶為219bp，核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0018] 通過利用96份核心種質材料對本發明所述的Indel標記進行驗證，結果證明該標 記在這些材料中用於分子標記輔助選擇的正確率為69. 8%。
[0019] 本發明不僅為黃瓜果實多刺基因 ns的精細定位和分子克隆奠定了基礎，同時 也為利用分子標記輔助選育果實多刺黃瓜新品種提供了高效的途徑。本發明基於開發 的Indel標記提供用於輔助篩選具有果實多刺基因的黃瓜新品種的方法，該方法中，採用 Indelns-24標記擴增待測品種的DNA，然後對擴增產物進行電泳檢測，擴增產物可能出現 三種情況：第一種是僅僅出現一條216bp條帶，這種為含黃瓜果實多刺基因 ns的隱型純合 材料；另一種是216bp條帶和219bp條帶都出現，這種是含黃瓜果實多刺基因 ns的顯性雜 合材料，第三種是僅僅出現219bp條帶，這種是不含黃瓜果實多刺基因 ns的顯性純和材料。 選出第一種條帶對應的材料，去掉第二種和第三種情況對應的材料。通過本發明提供的方 法，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行果實多刺基因的篩選，具有效率高、限制少、 較準確的優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖L是Indel標記Indelns-24在黃瓜親本材料WI 2757 (P1，果實多刺），Wis. SMR18 (P2,果實少刺），Fl世代單株及F2群體隨機單株的部分電泳檢測結果。
[0021] 圖2.是Indel標記Indelns-24驗證96份不同遺傳背景的黃瓜核心種質材料的 部分電泳檢測結果。

【具體實施方式】
[0022] 下面用來詳細說明本發明技術方案的【具體實施方式】用於進一步解釋本發明，而不 是限制本發明的範圍。如無特殊說明，下述實施例中使用的操作均為常規方法，所採用的試 劑均可以商購獲得。
[0023] 生物材料的來源和記載出處
[0024] WI 2757是歐洲溫室型黃瓜雌性系，生長勢中等，葉片中等偏小，果皮綠色，果實 多刺，白色果刺，無果瘤。為現有已知品種，在Xiaoming He等人於2013年8月在《Theor Appl Genet》第 8 期發表的文章 《QTL mapping of powdery mildew resistance in WI 2757cucumber》中也有記載。本實驗室有保存，保證自申請日起二十年內向公眾發放用於驗 證實驗。
[0025] Wis. SMR18是美國加工類型黃瓜自交系，生長勢強等，葉片掌狀，果皮深綠和白色 相間，黑色果刺，果實少刺。為現有已知品種，在Christopher S. Cramer和Todd C. Wehner 於1999年在《Euphytica》第110卷、第99 - 108頁發表的文章 《Little heterosis for yield and yield components in hybrids of six ucumber inbreds〉〉中也有記載。本實 驗室有保存，保證自申請日起二十年內向公眾發放用於驗證實驗。
[0026] 96份核心種質材料是本所構建的包含120份材料的核心種質的一部分，是從3318 份黃瓜資源裡面篩選出來的，均為現有已知品種。在2011年6月，呂婧發表的中國農業科 學院碩士學位論文《黃瓜種質資源群體結構分析與核心種質集篩選》第三章"核心種質資源 的構建"部分裡面有介紹，是從3318份黃瓜資源裡面篩選了 120份作為核心種質。本實驗 室有保存，保證自申請日起二十年內向公眾發放用於驗證實驗。
[0027] 主要試劑
[0028] Indel引物是本實驗室基於115份核心種質重測序的基因組信息、利用primer 3. 0軟體開發而來。重測序的基因組信息詳見Qi等在《Nature Genetics》雜誌2013年發 表的論文〈〈A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity〉〉。
[0029] SSR引物來自國際黃瓜基因組計劃（CUGI)，共2112對（Ren et al.，2009)。詳細 結果可以參見Ren等在PloS 0ne2009年第4期在線發表的文章 《An inteGrated Genetic and Cytoenetic map of the cucumber Genome》。
[0030] PCR 實驗使用 Shanghai PromeGa 公司的 GoTaq Green Master Mix ;
[0031] 凝膠電泳使用盈信陽光公司的40%非變性聚丙烯醯胺，將其稀釋至6%後使用。
[0032] 實施例1.與黃瓜果實多刺基因 ns連鎖的Indel標記的篩選
[0033] 步驟1.黃瓜果刺多少性狀鑑定
[0034] 試驗於2013年春季和秋季在中國農業科學院蔬採花舟研究所實驗基地進彳丁，以 WI2757(P1)和Wis. SMR18(P2)為父母本進行正反交、自交，獲得F1、F1'、F2群體。秋季利 用實驗大棚種植Pl、P2和Fl、F1'各30株，三次重複，隨機區組排列。種植F2群體182株。 株距25cm，行距55cm，按常規田間管理。在開花結果期，調查群體各單株上商品瓜（開花後 7?IOd)的果刺多少。計算分離比，使用Microsoft Excel 2003軟體進行數據統計分析， 使用SAS8. 0對結果進行卡方測驗。
[0035] 結果顯示：無論正反交後代Fl果刺均表現為少刺；在F2群體中，少刺與多刺植株 的分離比例為136:46,經卡方測驗符合3:1。由此可知，多刺性狀是由1對核基因控制的， 少刺（Ns)對多刺（ns)為顯性。
[0036] 步驟2. DNA提取和Indel分析
[0037] 取黃瓜植株的嫩葉，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）法提取親本及群體 各單株的基因組DNA。
[0038] PCR反應體系為：總反應體系IOyL, 3μ L DNA(2. 5ng· μ L-1)，正向和反向引物 (50ng · μ L-1)各 1 μ L，5 μ L Go ? 叫? Green Master Mix (Promega 公司產品）。
[0039] 引物使用黃瓜全基因測序開發的Indel引物。
[0040] PCR擴增程序為：94°C預變性4min ;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸
[0041] 30s，35 個循環；72°C保溫 5min，16°C forever。
[0042] 擴增產物用6 %非變性聚丙烯醯胺凝膠分離，電泳緩衝液為0. 5 X TBE，150V恆功 率電泳分離lh，電泳後銀染顯色，統計帶型。
[0043] 步驟3.初步定位的SSR分子標記篩選、數據統計及連鎖圖構建
[0044] 主要包括4步：（1)篩選在父母本間表現多態的分子標記；（2)在F2群體中選取 果實多刺、少刺單株的DNA各7個，根據BSA法構建果實多刺和少刺2個基因池，用基因池 篩選多態性引物；（3)利用獲得的多態性引物分析F2群體各單株基因型；(4)利用JoinMap 4.0軟體進行連鎖圖的繪製。
[0045] 共顯性標記的統計方法：與母本（WI 2757) -致的帶型記為a，與父本（Wis. SMR18) -致的帶型記為b，雜合的帶型記為h。
[0046] 顯性標記的統計方法：若母本為顯性標記，則分離群體中和母本帶型一致的單株 記為d，和父本帶型一致的記為b ;若父本為顯性標記，則分離群體中和母本帶型一致的單 株記為a，和父本帶型一致的記為c，未擴增出的或模糊不清的記為u。
[0047] 結果顯示：
[0048] 用2112對351?引物對？1〇? 2757)和？2(町8.5]\?18)進行篩選，其中在兩個親本 間表現多態的引物有282對，多態率13. 4%。
[0049] 結合BSA法建池，進一步篩選得到了 8個SSR多態性標記。
[0050] 利用篩選出的多態性標記對WI 2757 XWis. SMR18組合的F2群體進行分析，結合 調查性狀數據利用J〇inmap4. 0構建連鎖圖。結果8個標記和ns被定位在同一連鎖群上 (L0D = 10)。
[0051] 將本發明得到的連鎖圖與已發表的黃瓜遺傳圖譜（Ren et al.，2009 ;Miao et al，2011)比較，發現本連鎖群與第2染色體上共有7個共有標記，據此將ns基因定位在第 2染色體上。
[0052] 步驟4. ns連鎖群分子標記加密及本發明所述Indel標記的確定
[0053] 針對初定位的染色體區段，利用本實驗室之前重測序的數據尋找Indel位點，利 用primer 3. 0軟體在這些Indel位點上設計引物，對連鎖群進行分析加密標記。在目標區 段共設計了 40對Indel標記，用雙親篩選出有多態性的有3對標記，多態率7. 5%。。加上 之前在此區域設計的SSR類型的有多態性的引物，上群體後得到一個總長度為26. 3cM包含 15個標記的連鎖群，獲得與果實多刺基因 ns連鎖距離為I. IcM的Indel標記Indelns-24。
[0054] 步驟5. PCR擴增所得差異片段的回收純化及測序
[0055] (1)目的片段的回收
[0056] 採用煮沸法。具體操作為：先從膠上將目標條帶挖下來裝入I. 5mL的Eppendorf 管內，向管內加入100 μ L超純水，加水量視膠帶顏色深淺而定；常溫下浸泡24h，轉入95°C 水浴鍋（或PCR儀）中煮30min後，5000rpm離心3min。產物即可取上清3 μ L做模板進行 PCR擴增，剩餘產物置-20°C保存備用。
[0057] (2)目的片段的純化
[0058] 用PCR產物直接純化方法。在PCR產物中加入2倍體積的無水乙醇，_20°C過夜放 置，1，2000rpm離心5min就可以得到純化產物。
[0059] (3)目的片段與載體的連接
[0060] 反應體系為 10 μ L :PMD18_T VectorL 0 μ L ;Ligation buffer I 5. 0 μ L ;目的片 段 4· Ομ L。
[0061] 在超淨工作檯上加樣，混勻反應物，短暫離心，16°C連接約lh，過夜也不影響連接 效率。
[0062] (4)連接產物的轉化
[0063] 1)取出感受態細胞，SolutionA，SolutionB，置於冰上融化；
[0064] 2)感受態（50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 預冷去離子水；
[0065] 3)用冷卻的無菌槍頭將上述懸浮液分裝到I. 5mL離心管，每管加入105 μ L，再加 入5 μ L的目的DNA，輕旋混勻；
[0066] 4) 42°C水浴熱激90s，注意不要晃動離心管；
[0067] 5)快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻3?5min ;
[0068] 6)加入500 μ L LB液體培養基。在37°C，150rpm搖床上預培養Ih ;
[0069] 7)將菌液塗布到含有 100 μ g · mL-lAmp、25 μ g · mL-lIPTG 和 40 μ g · mL-lX-GAL 的LB固體培養基上，用一無菌的彎頭玻棒輕輕的將菌液均勻塗開，置於室溫直至液體被吸 收；
[0070] 8)倒置平板，37°C培養12?16h。
[0071] (5)重組質粒的藍白斑篩選
[0072] 經37°C培養後，在塗布X-Gal/IPTG的LB平板上出現少量藍色菌落和較多的白色 菌落，其中白色菌落為重組克隆子。挑取白色單菌落塗抹在劃好方格的LB液體培養基中， 37°C，150rpm過夜培養。
[0073] (6)菌落PCR的檢測
[0074] 吸取1 μ L菌液作為模板進行PCR擴增。取4 μ L PCR產物，經1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，與PCR Marker標準分子量相比較檢測插入片段的大小，與插入目的片段大小一致 的克隆即為陽性克隆。
[0075] (7)克隆後載體的測序與分析
[0076] 取3個陽性克隆菌液在甘油（330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液）中各保存兩份， 一份-20°C保藏，一份送去測序。
[0077] 其中Indel標記引物Indel-24擴增出的與黃瓜果實多刺基因 ns連鎖的片段的核 苷酸序列如Seq ID No. 1所示；與黃瓜果實少刺基因 Ns連鎖的片段的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0078] 實施例2.本發明所述Indel標記的驗證
[0079] 利用實施例1獲得的與ns基因連鎖的Indel標記Indelns-24在96份不同遺傳 背景的黃瓜核心種質材料中進行驗證，以確定該標記用於分子標記輔助選擇的準確性。驗 證程序採用與實施例1中的步驟2中描述的PCR擴增和檢測方法來進行。
[0080] 採用現有已知的96份不同遺傳背景的黃瓜種質材料中重複驗證本發明所述的 Indel標記，結果表明共有67份材料的帶型反映的表型數據與田間調查結果一致，經計算 正確率為69. 8%，部分材料的PAGE膠電泳檢測結果見圖2。
【權利要求】
1. 一種與黃瓜果實多刺基因ns連鎖的Indel標記，其特徵在於：其引物的核苷酸序列 如下：Indelns-24-F/Indelns_24-R: TTTGAATGGCAGAAGAGAGT/TCCCTCTTTATTTGTGAACC； 所述引物擴增的與黃瓜果實多刺基因ns連鎖的特徵條帶為216bp，核苷酸序列如Seq IDNo. 1 所示； 所述引物擴增的與黃瓜果實少刺基因Ns連鎖的特徵條帶為219bp，核苷酸序列如Seq IDNo. 2 所示。
2. 權利要求1所述Indel標記在篩選具有果實多刺基因ns的黃瓜種質資源中的應用， 其特徵在於，包括如下步驟： (1) 採用上述Indel標記的引物對待選黃瓜品種的基因組DNA分別進行PCR擴增； (2) 對PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測； (3) 從檢測結果中篩選出現與黃瓜果實多刺基因ns連鎖的Indel標記特徵條帶一致的 材料。
3. 根據權利要求2所述的應用，所述PCR反應體系為：0. 75ng/ulDNA模板，正向和反 向引物各 5ng/ul，0.5yL/ulGoTaqKGreenMasterMix,其餘為雙蒸水。
4. 根據權利要求2或3所述的應用，所述PCR擴增程序為：94°C預變性4分鐘；94°C變 性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒；35個循環；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
5. 根據權利要求2-4任一所述的應用：所述凝膠電泳檢測是指將所述PCR擴增產物上 樣用6%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，在150V恆功率下進行電泳分離，再經銀染顯色，最後進 行條帶統計。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313018SQ201410510396
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月24日
【發明者】張聖平, 顧興芳, 苗晗, 劉書林, 王燁 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所