快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基及其製備方法
2023-09-24 01:39:00 1
專利名稱：快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基及其製備方法
技術領域：
本發明涉及衛生防疫檢測和環境水質監測技術，具體涉及一種用於快速檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌的培養基及其製備方法。
背景技術：
在水或食品中，大腸菌群和大腸桿菌被作為檢樣受腸道致病菌汙染的指標菌，是評價水質和食品衛生質量的重要指標之一，所以，能快速、準確地檢測出水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌具有十分重要的意義。目前，在中國對食品中的大腸菌群和大腸桿菌的檢測有兩個標準一是國家標準，即9管發酵法，只規定了大腸菌群的檢測，檢測步驟分為三步，後兩步為驗證實驗，耗時3天；二是進出口商品檢驗行業標準，即SN0169-92，對大腸桿菌檢測要求是，在進行大腸菌群和糞大腸菌群檢測的基礎上再進行平板分離，將可疑或典型菌落接於斜面上培養後，用培養物進行大腸桿菌的各項生化實驗後，根據其生化實驗的結果進行大腸桿菌的判斷，耗時約十天。而對環境水質的檢測，目前只規定了對大腸菌群的檢測方法和標準，為濾膜法和15管發酵法，濾膜法是先將水樣經過濾膜抽濾後，再將濾膜片放到培養基中進行培養，對典型或可疑菌落進行驗證實驗後得出結論，耗時2天；15管發酵法操作分為三步，後兩步為驗證實驗，耗時3天。不難看出，以上的各種方法明顯存在著實驗步驟繁鎖、用的培養基種類多、耗費時間長、檢測成本高的不足，需要加以改進。
近幾年來，各國在快速檢測方面做了很多工作，如中國的進出口商品檢驗行業標準SN0333-94規定，將4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷加入到LST(月桂基硫酸鹽胰蛋白腖)肉湯中進行大腸桿菌的最大可能值(MPN)檢測，雖然省去了傳統檢測方法的繁鎖步驟，但對於產氣不發螢光的試管仍需要驗證實驗，並且只能單一的檢測大腸桿菌。又如，主要用於檢測牛奶中大腸桿菌和大腸菌群的Violet Red Bile Agar(VRBA)培養基，該培養基以膽鹽作為雜菌抑制劑，加入中性紅作為目標菌生長代謝造成培養基pH值變化的顯色劑；當目標菌發酵乳糖產酸後，培養基pH值下降，菌落變為磚紅色，可以判定它為大腸菌群菌落。這種紅色菌落形成需要24-28小時，而要進行大腸桿菌的確定則需要再將紅色菌落接於煌綠乳糖膽鹽肉湯中發酵或EMB(伊紅美藍瓊脂)平板上劃線培養後才能得出結論，可以看出，該方法同樣需要驗證實驗，耗費的時間也長。
Colilert系統是一種對大腸菌群和大腸桿菌進行快速檢測的培養基，該培養基內含有鄰硝基苯基β-D-半乳糖苷和4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷兩種酶底物；前者是針對大腸菌群，大腸菌群在生長中能產生β-D-半乳糖酶，該酶分解ONPG後能產生黃色；後者是針對大腸桿菌，大腸桿菌在生長中能產生β-D-葡萄糖苷酶，該酶分解MUG後，在紫外光下產生藍紫色螢光。當樣品加入到這種培養基中，在24-28小時內就能根據產生黃色和螢光的情況對樣品進行大腸菌群和大腸桿菌的判定。雖然這種方法快速簡便，但也存在一些缺陷一是ONPG被分解後黃色的鄰-硝基苯易擴散到瓊脂中而影響到結果的觀察，二是MUG被分解後的螢光產生擴散很快，不容易觀察到，因而，1990年Clark提出運用該方法對飲用水進行大腸菌群和大腸桿菌的檢測時，存在著較高的假陰性率。此外，還有一些其它的快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的方法，但很多是一個實驗只能檢測一種目標菌，即在培養基中加入一種菌產生酶的酶底物，要檢測另一種目標菌則只能再選用另一種培養基，不僅增加法檢測的工作量，而且也造成原料和時間浪費。
發明內容
針對目前在大腸菌群和大腸桿菌檢測中存在的以上問題，本發明提供一種快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基及其製備方法，採用該培養基，只需24小時就能對水或食品檢樣中的大腸菌群和大腸桿菌進行定性或定量的分析，還能抑制革蘭氏陽性菌和非大腸菌群的革蘭氏陰性菌的生長，減少假陽性和假陰性出現的機率，提高檢測效率和檢測結果的準確性。
本發明所述的快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基，由含有蛋白腖3.5-5.0g、酵母浸膏2.0-3.0g、乳糖0.6-1.2g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.05-0.25g、氯化鈉6.0-7.5g、磷酸氫二鉀2.5-3.4g、磷酸二氫鉀0.7-1.2g、月桂基硫酸鈉0.1-0.2g、瓊脂0-15.0g的1000mL蒸餾水溶液和15-25mL的吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液及4.5-5.0mL頭孢磺啶溶液混合組成，最終pH值為6.9±0.2。當本培養基用於大腸菌群和大腸桿菌定性或MPN值檢測時，其中不加瓊脂。
蛋白腖和酵母浸膏屬於常規的培養基成分，為大腸菌群和大腸桿菌的生長提供有機的氮源，促進其生長，酵母浸膏還能促進受傷菌的修復。月桂基硫酸鈉作為抑菌劑加入到培養基中，能抑制革蘭氏陽性球菌和產孢子的雜菌生長。加入頭孢磺啶能抑制革蘭氏陽性菌和非大腸菌群的革蘭氏陰性菌的生長。這些抑菌劑的加入，有效地控制了假陽性和假陰性的出現，使檢測結果準確可靠。乳糖不僅給目標菌的生長提供了有機碳源，還是誘導劑，這是因為β-D-半乳糖苷酶是一種誘導酶，乳糖的加入使大腸菌群能更大量地產生這種酶，從而使反應現象更加明顯，便於觀察。氯化鈉、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的加入，給大腸菌群和大腸桿菌提供生長所需的礦物質，維持穩定的滲透壓，並維持培養液接近中性的pH值。因為乳糖和其它營養物在生長分解後會產酸，從而造成培養液過酸，妨礙菌的生長，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的加入能維持穩定的pH值，利於大腸菌群和大腸桿菌的生長。
所述的檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基的製備方法，其步驟如下(1)按上述培養基溶液的成分含量稱取蛋白腖、酵母浸膏、乳糖、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉和瓊脂，加入蒸餾水中加熱溶解；或者按上述培養基溶液的成分含量稱取蛋白腖、酵母浸膏、乳糖、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉，加入蒸餾水中加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至加熱前體積後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的15-25mL吲哚酚-β-D-葡萄糖苷和4.5-5.0mL頭孢磺啶。
由於大腸菌群在生長過程中會產生β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，所以，在培養基中就添加了一種該酶的底物——4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷。如果檢樣存在大腸菌群，則4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷就會被β-D-半乳糖苷酶所分解，游離出來的4-甲基傘形酮基團，在366mm紫外光下能產生螢光，從而表明檢樣中存在大腸菌群。
由於大腸桿菌在生長過程中會產生β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)，所以，在培養基中添加了一種該酶的底物——吲哚酚-β-D-葡萄糖苷，被該酶所分解後產生不溶性的靛藍色沉澱，從而表明檢樣中存在大腸桿菌。
由於上述兩種酶具有較強的特異性，本身為白色粉末，不發螢光，並且它們同時被作用後，反應現象不會互相干擾或受到外界環境的幹擾，因此，既能對水或食品檢樣中的大腸菌群進行檢測，同時又能對水或食品檢樣中的大腸桿菌進行檢測。
本發明是根據國外近年發展起來的酶促螢光和酶促顯色原理研製而成的，和現有技術對比具有以下優點能對飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌同時進行檢測，檢測的時間短、效率高；既能對大腸菌群和大腸桿菌進行定性檢測，又能對大腸菌群和大腸桿菌進行定量分析；能減少假陽性和假陰性出現的機率，檢測結果準確。
具體實施例方式
實施例1製備定性檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基。
(1)稱取蛋白腖3.5g、酵母浸膏2.0g、乳糖0.6g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.05g、氯化鈉6.0g、磷酸氫二鉀2.5g、磷酸二氫鉀0.7g、月桂基硫酸鈉0.1g，加蒸餾水至1000mL加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至1000mL後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的25mL濃度為15mg/mL吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和5.0mL濃度為1.1mg/mL頭孢磺啶溶液，即得到不含瓊脂的培養基，可快速定性檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌。
實施例2製備定性檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基。
(1)稱取蛋白腖5.0g、酵母浸膏3.0g、乳糖1.2g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.25g、氯化鈉7.5g、磷酸氫二鉀3.4g、磷酸二氫鉀1.2g、月桂基硫酸鈉0.2g，加蒸餾水至1000mL加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至1000mL後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的25mL濃度32mg/mL吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和4.5mL濃度為0.3mg/mL頭孢磺啶溶液，即得到不含瓊脂的培養基，可快速定性檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌。
實施例3製備定性檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基。
1)稱取蛋白腖4g、酵母浸膏2.5g、乳糖0.9g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.15g、氯化鈉6.5g、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀1g、月桂基硫酸鈉0.15g，加蒸餾水至1000mL加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至1000mL後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的20mL濃度為25mg/mL吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和5mL濃度為0.7mg/mL頭孢磺啶溶液，即得到不含瓊脂的培養基，可快速定性檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌。
實施例4製備檢測大腸菌群和大腸桿菌最大可能值(MPN值)的培養基。
(1)稱取蛋白腖3.5g、酵母浸膏2.0g、乳糖0.6g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.05g、氯化鈉6.0g、磷酸氫二鉀2.5g、磷酸二氫鉀0.7g、月桂基硫酸鈉0.1g，加蒸餾水至1000mL加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至1000mL後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的25mL濃度為15mg/mL的吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和5.0mL濃度為1.1mg/mL的頭孢磺啶溶液，得到的培養基可快速檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌的最大可能值。
實施例5製備定量檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基。
(1)稱取蛋白腖5.0g、酵母浸膏3.0g、乳糖1.2g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.25g、氯化鈉7.5g、磷酸氫二鉀3.4g、磷酸二氫鉀1.2g、月桂基硫酸鈉0.2g、瓊脂12g，加蒸餾水至1000mL加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至1000mL後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的15mL濃度為32mg/mL的吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和4.5mL濃度為0.3mg/mL的頭孢磺啶溶液，得到的培養基可快速定量檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌。
實施例6製備定量檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基。
1)稱取蛋白腖4g、酵母浸膏2.5g、乳糖0.9g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.15g、氯化鈉6.5g、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀1g、月桂基硫酸鈉0.15g、瓊脂15g，加蒸餾水至1000mL加熱溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至1000mL後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的20mL濃度為25mg/mL的吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和5mL濃度為0.7mg/mL的頭孢磺啶溶液，得到的培養基，可快速定量檢測飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌。
權利要求
1.快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基，由含有蛋白腖3.5-5.0g、酵母浸膏2.0-3.0g、乳糖0.6-1.2g、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷0.05-0.25g、氯化鈉6.0-7.5g、磷酸氫二鉀2.5-3.4g、磷酸二氫鉀0.7-1.2g、月桂基硫酸鈉0.1-0.2g、瓊脂0-15.0g的1000mL蒸餾水溶液和15-25mL吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液及4.5-5.0mL頭孢磺啶溶液混合組成，最終pH值為6.9±0.2。
2.根據權利要求1所述的快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基，其特徵在於，其中的吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液的濃度為15-32mg/mL，頭孢磺啶溶液濃度為0.3-1.1mg/mL。
3.如權利要求1所述的快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基的製備方法，其步驟如下(1)按上述培養基溶液的成分含量稱取蛋白腖、酵母浸膏、乳糖、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉和瓊脂，加入蒸餾水加熱溶解；或者按上述培養基溶液的成分含量稱取蛋白腖、酵母浸膏、乳糖、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉，加入蒸餾水中溶解；(2)待以上溶液冷卻後，用蒸餾水補足該溶液至加熱前體積後，調節它的pH值至6.9±0.2，放入高壓滅菌釜中，加熱至121℃±1℃，保持15-20分鐘滅菌，然後，自然冷卻；(3)當以上溶液冷卻至50℃±5℃時，加入剛配製的並分別過濾除菌的15-25mL吲哚酚-β-D-葡萄糖苷溶液和4.5-5.0mL頭孢磺啶溶液。
全文摘要
本發明涉及快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基，由含有蛋白腖、酵母浸膏、乳糖、4－甲基傘形酮－β－D－半乳糖苷、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉、瓊脂或不含瓊脂的蒸餾水溶液和吲哚酚－β－D－葡萄糖苷溶液及頭孢磺啶溶液混合組成。按規定含量稱取蛋白腖、酵母浸膏、乳糖、4－甲基傘形酮－β－D－半乳糖苷、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉和瓊脂(或不加瓊脂)，加入蒸餾水中加熱溶解；將以上溶液調節好pH值後放入高壓滅菌釜中滅菌，然後冷卻至50℃±5℃時，加入過濾除菌的吲哚酚－β－D－葡萄糖苷溶液和頭孢磺啶溶液。能定性或定量對飲用水、環境水或食品中的大腸菌群和大腸桿菌同時進行檢測，時間短、效率高、檢測結果準確。
文檔編號C12Q1/04GK1796568SQ20041008165
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月28日 優先權日2004年12月28日
發明者黃小平, 王瑜 申請人:重慶食品工業研究所