運用SYBRGreenI螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術的製作方法
2024-03-08 18:16:15
運用SYBR Green I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種運用SYBR?Green?I螢光染料在試紙條上進行特異性DNA快速檢測的技術，它包括以下步驟：選擇尼龍膜作為試紙條的材料；將探針點到尼龍膜上，探針為待檢測的特異性核苷酸序列，然後紫外線照射，烘烤，黑暗乾燥儲存；以待測樣本為模板、以探針為模板設計的引物為引物，進行PCR擴增，之後94℃變性10min，立即放4℃，得到待測序列；緩衝液衝洗尼龍膜，在尼龍膜上點雜交液，其中雜交液中包含SYBR?Green?I和待測序列，室溫黑暗雜交，用緩衝液、去離子水順次清洗尼龍膜，用488-nm雷射的成像掃描儀成像，根據尼龍膜是否發光判定結果。該方法簡單﹑廉價﹑快速、適用於臨床快速診斷。
【專利說明】運用SYBR Green I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條
技術
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術應用領域，具體地說是一種運用SYBR Green I螢光染料在試紙條上進行特異性DNA快速檢測的技術。
【背景技術】
[0002]病原體檢測在很多研究領域一直都有很重要的應用價值，尤其是在醫療和食品行業。病原體的快速、準確檢測和識別是有效控制感染和早期治療的關鍵。但是，標準的病原體培養不僅需要在培養基上孵育至少8小時，還要進行額外的生化或免疫識別，既繁瑣又費時。相比之下，定量聚合酶鏈式反應(qPCR)和微陣列等基於核酸的檢測方法，更快速、靈敏，然而，這些方法中仍然有許多既複雜又昂貴。
[0003]近年來，已報導的側向層析檢測方法對紙質生物學鑑定的發展做出了巨大貢獻。側向層析檢測方法最初是用來進行免疫分析，它運用納米粒子和乳膠微球體能夠對潛在的核酸進行即時的可視化檢測。但是此方法標記步驟複雜，不能進行多重檢測。
【發明內容】
[0004]本發明所 要解決的技術問題是針對以上現有技術的不足，提供一種簡單、廉價、快速、適用於臨床快速診斷的進行特異性DNA檢測的試紙條技術。
[0005]本發明所採用的技術方案為:
[0006]一種運用SYBR Green I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，包括以下步驟:
[0007](I)試紙條材料的選擇:選擇尼龍膜作為試紙條的材料。
[0008](2)探針感知層的製備:將探針點到尼龍膜上，所述探針為待檢測的特異性核苷酸序列，然後用紫外線對尼龍膜進行照射，然後烘烤，最後黑暗乾燥儲存。該步驟可以有效提高探針與待測樣品的雜交信號。
[0009](3)待測樣本的目標序列獲得:運用普通PCR技術，根據待測樣本和探針的同源序列特徵設計一對引物進行PCR擴增，擴增完之後再94°C變性lOmin，然後立即放4°C，得到待測序列。
[0010](4)目標DNA的檢測:使用緩衝液衝洗固定了探針的尼龍膜，然後在尼龍膜上點上雜交液，其中雜交液中包含SYBR Green I和步驟(3)得到的待測序列，室溫黑暗雜交，接著用緩衝液、去離子水順次清洗尼龍膜，最後用488-nm雷射的成像掃描儀對溼潤的尼龍膜成像，根據尼龍膜是否發出綠色螢光判定結果的陰陽性。
[0011]如果待測樣本中存在待檢測的特異性核苷酸序列，那麼通過普通PCR擴增就能擴增出與探針互補的核苷酸片段，那麼雜交液中便存在能與尼龍膜試紙條上的探針序列互補形成雙鏈結構的序列，那麼SYBR Green I螢光染料就插入到該雙鏈DNA中，這樣在紫外線的照射下，顯出明亮的綠色螢光，此為陽性結果；反之，就是陰性結果。[0012]作為優選，所述步驟(1)中尼龍膜為長條狀，尺寸為3cmX 0.5cm。
[0013]作為優選，所述步驟(2)中探針為若干個，該若干個探針以固定的間隔點在尼龍膜上。所述若干個探針為某一疾病/病毒相關的若干個靶序列或相關疾病/病毒的若干個靶序列。如設置於尼龍膜試紙條上的探針為流感病毒A、B、H1、H3四種，這樣通過一次檢測就可以同時進行對上述四種流感病毒類型進行同時檢測，可以用於區分各種特異性DNA的類型，方便快速，檢測結果針對性強，精確度高，對比性強，可區分度高。
[0014]作為優選，所述步驟(2)中探針的濃度為500nM、用量為0.5μ L。通過實驗研究發現，當探針濃度為500ηΜ時，雜交信號達到飽和。
[0015]作為優選，所述步驟(2)中紫外線的波長為254nm、照射時間為2min。實驗發現，經紫外照射的尼龍膜與未經照射的相比，雜交信號提高了 20-30%。紫外照射促進了探針與尼龍膜的交聯反應，減少了雜交孵化階段從膜上逃離的探針DNA，因此，能得到更高的螢光信號。
[0016]作為優選，所述步驟(2)中烘烤的溫度為60°C、時間為5min。實驗發現，將紫外交聯過和未經紫外交聯的膜均60°C烘烤5分鐘，分別能將螢光信號提高20%和40%。實驗證實更長的烘烤時間並不能進一步提高雜交信號。
[0017]作為優選，所述步驟(4)緩衝液為TE緩衝液。
[0018]作為優選，所述步驟(4)雜交液中SYBR Green I的濃度為2.5mM、目標序列的濃度為 250nM。
[0019]作為優選，所述步驟(4)中室溫黑暗雜交的時間為5min。通過實驗研究發現，雜交5分鐘與雜交20分鐘產生的螢光信號相似，更長的雜交時間反而會使信號減弱。這可能是由於長時間的雜交孵化會導致一些固定了的探針從膜上釋放。
[0020]本發明將點在尼龍膜上未經修飾的核苷酸序列作為捕獲探針，檢測過程僅需要使靶DNA與SYBR Green I混合物孵育5分鐘，短暫清洗膜條之後，用平板掃描儀進行成像，如果在膜條特定位置出現螢光點，說明存在與此處探針互補的靶基因。與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果:
[0021](I)本發明開發了一種在尼龍膜上用紫外交聯(254nm，2min)和短暫熱處理(60°C，5min)來固定探針的方法，紫外交聯將DNA信號提高了 20%_30%，熱處理將DNA信號提聞了 20% ；
[0022](2)通過螢光染料的SYBR Green I顯色進行結果的判斷，無需對探針進行標記(如TaqMan?探針或分子信標(molecular beacon)),操作簡單,靈敏度高,特異性強,在很大程度上降低了檢測費用；
[0023](3)選用SYBR Green I作為螢光染料、尼龍膜作為試紙條的組合進行特異性DNA檢測，經過檢測，證實了該組合與包括 SYBR Green 1、LCGreen, EvaGreen, SYT09、SYTOl3,LightCycler480ResoLight在內的雙鏈DNA染料和包括尼龍膜、硝化纖維素膜、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)在內的紙質墊板的其他組合相比，其在進行核酸檢測時，信噪比最大，最適於進行試紙條特異性核酸的檢測；
[0024](4)本發明無需用到成本昂貴的生化或免疫儀器，僅需一臺普通的PCR儀便可實現特異性DNA的檢測，這使檢測成本大大降低；
[0025](5)本發明檢測方法操作簡單，結果顯示快速，專一針對性強，非常適合醫生在望聞問切、初步確認了幾種可疑的病因之後，進行進一步的病症確認，適用於臨床推廣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1所示的是運用本發明進行流感病毒A、B、H1、H3檢測的結果圖。
【具體實施方式】
[0027]以下結合實施例對本發明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有說明，本發明使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬【技術領域】人員通常理解的相同含義。
[0028]主要材料和試劑:
[0029]SYBR Green I 購於 Invitrogen (Life Technology Pte Ltd, Singapore);尼龍膜購於Bio-Rad (Hercules, USA);流感病毒A、B、Hl、H3樣本分別來自於4位感染流感病毒A、B、Hl、H3病人的鼻拭子浸出液；探針A、B、H1、H3、各引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。
[0030]實施例1:
[0031]本實施例旨在檢測流感病毒A、B、H1、H3以及它們的混合物。具體探針及靶DNA的核苷酸序列如表1.所示。
[0032]表1.流感病毒A、B、H1、H3探針及靶DNA序列
[0033]
【權利要求】
1.一種運用SYBR Green I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於包括以下步驟: (1)選擇尼龍膜作為試紙條的材料； (2)將探針點到尼龍膜上，所述探針為待檢測的特異性核苷酸序列，然後用紫外線對尼龍膜進行照射，然後烘烤，最後黑暗乾燥儲存； (3)運用普通PCR技術，以待測樣本為模板、以探針為模板設計的一對引物為引物進行PCR擴增，擴增完之後再94°C變性lOmin，然後立即放4°C，得到待測序列； (4)使用緩衝液衝洗固定了探針的尼龍膜，然後在尼龍膜上點上雜交液，其中雜交液中包含SYBR Green I和步驟(3)得到的待測序列，室溫黑暗雜交，接著用緩衝液、去離子水順次清洗尼龍膜，最後用488-nm雷射的成像掃描儀對溼潤的尼龍膜成像，根據尼龍膜是否發出綠色螢光判定結果的陰陽性。
2.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(1)中尼龍膜為長條狀，尺寸為3cmX0.5cm。
3.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(2)中探針為若干個，該若干個探針以固定的間隔點在尼龍膜上。
4.根據權利要求 3所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述若干個探針為某一疾病/病毒相關的若干個靶序列或相關疾病/病毒的若干個靶序列。
5.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(2)中探針的濃度為500nM、用量為0.5μ L。
6.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(2)中紫外線的波長為254nm、照射時間為2min。
7.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(2)中烘烤的溫度為60°C、時間為5min。
8.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(4)緩衝液為TE緩衝液。
9.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(4)雜交液中SYBR Green I的濃度為2.5mM、待測序列的濃度為 250nM。
10.根據權利要求1所述的運用SYBRGreen I螢光染料進行特異性DNA檢測的試紙條技術，其特徵在於:所述步驟(4)中室溫黑暗雜交的時間為5min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898229SQ201410151521
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】李孟皇, 邊紅武, 韓凝, 武金霞 申請人:杭州希諾生物科技有限公司