滅活內源性過氧化物酶的方法及其應用的製作方法

2023-09-24 03:56:05 1

專利名稱：：滅活內源性過氧化物酶的方法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種滅活內源性過氧化物酶的方法及其應用。
背景技術：
：免疫組化技術目前已經在臨床和科研中得到較為廣泛的應用，能夠為組織中蛋白的定位及相關功能研究提供較為重要的信息。影響染色效果的因素較多，包括內源性過氧化物酶的處理、微波抗原修復過程、抗體、組織固定液、抗原的所在部位以及DAB顯色時間等。內源性過氧化物酶能否被成功封閉是目前認為影響免疫組化染色效果的關鍵步驟之一，因為如果不能完全封閉組織中的內源性過氧化物酶活性，將會造成免疫組化的假陽性染色，極大的幹擾結果的判斷。在免疫組化操作過程中使用稀釋的過氧化氫封閉液進行內源性過氧化物酶的封閉已經成為免疫組化不可缺少的步驟之一，沿用已有多年。除了內源性過氧化物酶的封閉外，抗原修復是影響結果的另一個較為關鍵的步驟。熱修復是目前在免疫組化操作過程中使用最為廣泛的修複方法，包括微波高溫熱修復、高壓鍋熱修復和水浴熱修復等。Shietal在1991年改進了微波高溫介導的抗原熱修復的方法，到目前為止微波高溫熱修復是最為推薦的修複方法。修復液的pH值、濃度和離子組成等，均會對免疫組化的染色效果產生影響，選擇合適的抗原修復液對於成功的進行抗原修復非常重要。有研究表明金屬離子對於抗原修復不僅是是非必需的，而且其毒性作用可能會對最終的染色效果產生影響。儘管目前枸櫞酸鹽緩衝液(pH6.0)使用最為廣泛，但有研究比較了多種抗原修復液的修復效果，其中包括枸櫞酸鹽緩衝液、枸櫞酸緩衝液(檸檬酸緩衝液)、EDTA、PBS和雙蒸水等，表明從枸櫞酸/檸檬酸緩衝液(pH6.0)獲得的染色效果最為理想。
發明內容本發明的一個目的是提供一種免疫組化中的滅活內源性過氧化物酶的方法。本發明所提供的免疫組化中的滅活內源性過氧化物酶的方法，是用微波處理組織切片，滅活內源性過氧化物酶；所述微波的頻率為2.45GHz、功率為650800w，所述處理的時間為1015分鐘。本發明的另一個目的是提供一種免疫組化中的滅活內源性過氧化物酶及抗原修復的方法。本發明所提供的免疫組化中的滅活內源性過氧化物酶及抗原修復的方法，是將組織切片置於裝有抗原修復液的容器1中，再將所述容器1置於裝有水的容器2中，然後進行如下微波處理所述微波的頻率為2.45GHz、功率為650800w，所述處理的時間為1015分鐘。上述微波的功率具體可為720w;上述處理的時間具體可為15分鐘。其中，所述抗原修復液為0.OIM、pH為6.0的檸檬酸緩衝液。上述方法在免疫組化中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的另一個目的是提供一種免疫組化方法。本發明所提供的一種免疫組化方法，包括用上述方法進行抗原修復和滅活內源性過氧化物酶的步驟。通過對各種組織的實驗證明，本發明的滅活內源性過氧化物酶的方法，既可以滅活內源性過氧化物酶，又可以起到抗原修復的作用，而且操作簡單、省時省力。因此，在免疫組化中應用本發明的滅活內源性過氧化物酶的方法，可以將抗原修復和內源性過氧化物酶的封閉合併為一步，進而省略了用稀釋的過氧化氫封閉液來滅活內源性過氧化物酶的步驟，使得免疫組化的操作步驟更為精簡，影響因素進一步減少。圖1為人體胃黏膜標本未經過氧化氫封閉液處理，陽性染色顯示的為內源性過氧化物酶的表達(xioo)圖2為人體胃黏膜標本的蘇木素-伊紅染色結果與圖1為同一連切標本(X200)圖3為人體胃黏膜標本未經過氧化氫封閉液處理，陽性染色顯示的為內源性過氧化物酶的表達(X200)圖4為人體胃黏膜標本只經過微波高溫熱修復，未經過氧化氫封閉液處理，並未見內源性過氧化物酶的陽性表達(X200))圖5為同時經過微波高溫熱修復和過氧化氫封閉液的處理(一)抗原修復前用3%的過氧化氫封閉液處理圖6為人體胃黏膜標本同時經過微波高溫熱修復和過氧化氫封閉液的處理(二)抗原修復前用0.3%的過氧化氫封閉液處理，未見內源性過氧化物酶的陽性表達(X200)圖7為人體胃黏膜標本同時經過微波高溫熱修復和過氧化氫封閉液的處理(三)抗原修復後用3%的過氧化氫封閉液處理，未見內源性過氧化物酶的陽性表達(X200)圖8為人體胃黏膜標本同時經過微波高溫熱修復和過氧化氫封閉液的處理(四)抗原修復後用0.3%的過氧化氫封閉液處理，未見內源性過氧化物酶的陽性表達(X200)圖9為內源性過氧化物酶在人體胃黏膜標本紅細胞中的分布(X400)圖10為紅細胞中的內源性過氧化物酶只經過微波高溫熱修復處理，未經過氧化氫封閉液處理，內源性過氧化物酶被滅活(X400)圖ll為人體結腸黏膜組織只經過微波高溫熱修復處理，未經過氧化氫封閉液處理，未見內源性過氧化物酶陽性染色(X400)圖12為人體小腸黏膜組織只經過微波高溫熱修復處理，未經過氧化氫封閉液處理，未見內源性過氧化物酶陽性染色(X200)圖13為內源性過氧化物酶在小鼠肝臟中的正常分布(X400)圖14為微波高溫熱修復對小鼠肝臟中內源性過氧化物酶的滅活作用(X400)圖15為內源性過氧化物酶在小鼠脾臟中的正常分布(X400)圖16為微波高溫熱處理對小鼠脾臟中內源性過氧化物酶的滅活作用(X400)圖17為胃癌組織的蘇木素-伊紅染色結果(與下圖18為同一組織連切標本)(X400)圖18為使用省略過氧化氫封閉處理後的程序進行免疫組化操作的結果(一)Bax抗原在胃癌組織中的陽性表達(X400)圖19為胃癌組織的蘇木素-伊紅染色結果(與下圖20為同一組織連切標本)(X200)圖20為使用省略過氧化氫封閉處理後的程序進行免疫組化操作的結果(二)Bax抗原在胃癌組織中的陽性表達(X400)圖21為使用省略過氧化氫封閉處理後的程序進行免疫組化操作的結果(三)Bcl-2抗原在人結腸組織中的陽性表達(X400)圖22為使用省略過氧化氫封閉處理後的程序進行免疫組化操作的結果(四)Bax抗原在人小腸組織中的陽性表達(X400)具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。實施例l、通過微波加熱封閉內源性過氧化物酶一、本實施例中所使用的各實驗方法本實施例中所使用的各實驗方法如表l所示。表l、不同的內源性過氧化物酶封閉程序tableseeoriginaldocumentpage6表中各實驗的具體方法如下(1)脫蠟再水化的實驗步驟為二甲苯I20min—二甲苯II20min—無水乙醇I10min—無水乙醇IIlOmin—95%乙醇10rain—90%乙醇10min—80%乙醇10min—蒸餾水；用PBS衝洗2次，每次5min。(2)本發明改進的微波高溫熱處理的實驗步驟為I.將組織切片置於切片架上，然後放入一裝有0.01M檸檬酸緩衝液(pH6.0)的塑料盒中，蓋上蓋子，但不要太緊以保證氣體能夠相互流動；II.將塑料盒放入一稍大的微波加熱盒中，內裝有適量的自來水，蓋上一相對較松的蓋子，防止水分過度蒸發導致乾片；III.微波功率為2.45GHz，調至650800w(中、高火)，連續加熱1015min，中途可稍停察看液體量，必要時可稍添加緩衝液，但也需適當延長加熱時間；IV.從微波中移出所有加熱器皿，打開微波盒的蓋子，其餘保持原狀，自然冷卻至室溫，所需時間約45-60min;V.取出切片，PBS緩衝液衝洗3次，每次5min。本發明根據傳統方法在微波修復步驟稍加修改，避免反覆添加修復液帶來不良效果，又能保持恆定的抗原修復條件。(3)傳統的微波高溫熱修復的實驗步驟為將組織切片放入裝有修復液的容器中直接微波輻射加熱，時間沒有固定，有1015分鐘，有5分鐘X2次，並且較多的選擇使用解凍檔，明顯的縮短抗原修復時間。但是，帶來的問題是時間太短無法達到較好的抗原修復效果；時間若超過57分鐘，液體揮發較快，反覆添加修復液將無法保持抗原修復所需的溫度。(4)過氧化氫封閉的實驗步驟為將切片置於0.3%或3%的過氧化氫封閉液中，室溫避光孵育15min;PBS衝洗5minX3次。(5)DAB顯色的實驗步驟為將切片置於DAB顯色液中，室溫孵育1015min;自來水終止反應，並充分衝洗。(6)組織標本的石蠟切片製備方法如下I.固定將所取新鮮組織用4%多聚甲醛液固定68小時，固定液的量應超過所固定組織重量的610倍。II.脫水使用階段乙醇脫水，順序依次為80X乙醇lh—90X乙醇lh—95%乙醇Ilh—95X乙醇IIlh—無水乙醇Ilh—無水乙醇IIlh。III.透明二甲苯I30min—二甲苯IIlh。IV.浸蠟及包埋石蠟I2h—石蠟II2h—包埋。V.載玻片的預處理l(經多聚賴氨酸處理)泡酸過夜後，用流水充分衝洗，蒸餾水浸洗，無水乙醇浸泡過夜，取出擦淨；多聚賴氨酸按l:10比例(體積比)用雙蒸水稀釋，混勻後直接塗抹於酸預處理過的載玻片上，5min後置於37'C烤箱中過夜烤乾，裝盒儲存備用。載玻片的預處理2(未經多聚賴氨酸處理)泡酸過夜後，用流水充分衝洗，蒸餾水浸洗，無水乙醇浸泡過夜，取出擦淨；置於37"C烤箱中過夜烤乾，裝盒儲存備用。此玻片用於H-E染色。VI.每份組織均製成厚度4nm的切片。所有切片均需經37'C烤箱烤片過夜，裝盒後4'C儲存備用。下述各實施例中，將由步驟V中預處理1所述方法得到的切片稱作"經多聚賴氨酸處理的切片"(作為實驗組，即用於免疫組化染色)，將由步驟V中預處理2所述方法得到的切片稱作"未經多聚賴氨酸處理的切片"(作為對照組，用於蘇木素-伊紅染色，輔助檢測內源性過氧化物酶在組織中的分布和輔助判斷細胞性質)。(7)蘇木素-伊紅(H-E)染色步驟二甲苯I9min—二甲苯II9min—無水乙醇I5min—無水乙醇Il5min—95X乙醇5min—90X乙醇5min—80X乙醇5min—蒸餾水衝洗一蘇木素染液57min—流水短暫衝洗(自來水)一分色液lmin—反藍液lmin—蒸餾水衝洗一伊紅染液2min—自來水衝洗一80X乙醇2min——90%乙醇2min—95X乙醇2min—無水乙醇I2min—無水乙醇II2min二甲苯I2min—二甲苯H2min—中性樹膠封片。(8)結果判定方法記分方法均參照Rahman等的標準並作適當修改，具體判定方法如下染色強度記分無色O分；淡黃色l分；黃色2分；棕褐色3分。陽性細胞數記分〈25%，1分;26%50%，2分;51%75%，3分;>75%，4分。根據染色強度和陽性細胞數計分之和進行判斷0分為陰性(-)，12分為弱陽性(+)，35分為陽性(++)，67分為強陽性(+++)。所有結果均經三位發明人在專業病理醫師幫助下分別閱片，若有疑義共同商議後確定。統計學處理採用SPSS13.0軟體，陽性率之間的比較採用X檢驗，P〈0.05即認為存在統計學差異。二、內源性過氧化物酶的封閉效果與過氧化氫封閉液的濃度和新舊無關目前，多數推薦使用稀釋的3%過氧化氫液作為內源性過氧化物酶的封閉液，但也有推薦0.3%的過氧化氫液，認為都可以達到理想的封閉效果，並且絕大多數都建議過氧化氫封閉液應該現配現用。本實驗所用的O.3。/。過氧化氫封閉液是由美國Neomarkers公司試劑盒提供，是稀釋好的即用型的過氧化氫封閉液(即不是現配現用的)；3%濃度的過氧化氫封閉液則是由100%的過氧化氫液經蒸餾水稀釋而來，現用現配，即為新的過氧化氫封閉液。濃度有高(3%)有低(0.3%)。材料來源及切片的製備以8份人胃黏膜組織為實驗原料。材料來源8份人胃黏膜活檢標本均來自北京大學第三醫院消化科內鏡中心。8份人胃黏膜標本石蠟切片的製備方法同步驟一中(6)所述一致。下述試驗中，第3至第6種方法中各實驗步驟與步驟一中(1)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)中所述相同。取上述8份人胃黏膜組織標本各1張，分別用表1中第3種方法進行實驗。實驗設3次重複，結果表明8份人體胃黏膜標本中均未見內源性過氧化物酶的陽性染色(X200)(圖5)。取上述8份人胃黏膜組織標本各1張，分別用表1中第4種方法進行實驗。實驗設3次重複，結果表明8份人體胃黏膜標本中均未見內源性過氧化物酶的陽性染色(X200)(圖6)。取上述8份人胃黏膜組織標本各1張，分別用表1中第5種方法進行實驗。實驗設3次重複，結果表明8份人體胃黏膜標本中均未見內源性過氧化物酶的陽性染色(X200)(圖7)。取上述8份人胃黏膜組織標本各1張，分別用表1中第6種方法進行實驗。實驗設3次重複，結果表明8份人體胃黏膜標本中均未見內源性過氧化物酶的陽性染色(X200)(圖8)。綜上結果表明，儘管過氧化氫封閉液有新有舊(實驗方法3和5中所用3%過氧化氫封閉液，為現用現配的所謂新的過氧化氫封閉液，實驗方法4和6中所用0.3%過氧化氫封閉液，為公司提供的所謂舊的過氧化氫封閉液)，濃度有高有低，並且封閉有在抗原修復前也有在抗原修復後，但是對最終的結果並沒有產生影響，所有組織中的內源性過氧化物酶均被完全封閉，各種方法之間並沒有差異。因此，可以得出結論組織中內源性過氧化物酶的封閉效果與過氧化氫封閉液的濃度及新舊無關。三、微波加熱封閉內源性過氧化物酶活性(一)以人胃黏膜組織為實驗原料驗證微波加熱能封閉其中內源性過氧化物酶活性(本實驗中各實驗步驟與步驟一中(1)、(2)、(5)、(6)和(7)中所述相同，其中微波處理方法為本發明的改進的微波方法，其具體條件為微波功率為2.45GHz，調至720w(中、高火)，連續加熱15min。1、材料及切片的製備材料來源及切片的製備與步驟二中所述一致。2、內源性過氧化物酶在人胃黏膜組織中的分布取8份人胃黏膜組織的經多聚賴氨酸預處理的石蠟切片各1張，用表l中所示的第l種方法進行實驗，經脫蠟再水化後直接滴加DAB工作液顯色，DAB特異性的顯色過氧化物酶，而此操作並未使用外源性的過氧化物酶，如辣根過氧化物酶等，因此結果顯示的即為內源性的過氧化物酶在組織中的分布情況；同時，取8份人胃黏膜組織的未經多聚賴氨酸預處理的石蠟切片各l張，按照一中(7)所述方法進行蘇木素-伊紅染色，輔助判斷細胞性質(圖2)。結果如圖l、3和9所示，有大量免疫組化染色陽性的細胞，其中，棕褐色顆粒即為內源性過氧化物酶的表達。圖1和圖3中，絕大多數細胞經普通病理學方法(蘇木素-伊紅染色)被確定為嗜酸性粒細胞；圖9中，幾乎所有的陽性細胞都為紅細胞。因此，嗜酸性粒細胞和紅細胞可以被認為是人體胃組織中內源性過氧化物酶的主要來源。該結論將會在人體其它組織和小鼠部分組織中進一步被論證。3、微波加熱能封閉人胃黏膜組織中內源性過氧化物酶活性取與步驟2中相同來源的8份人胃黏膜組織的經多聚賴氨酸預處理的石蠟切片各1張，用表l中所示的第二種方法進行實驗，不加過氧化氫封閉液進行內源性過氧化物酶的封閉，切片經過微波熱處理後直接滴加DAB顯色。實驗均設3次重複。結果表明在所有的8份人胃黏膜組織切片中，均未見內源性過氧化物酶的陽性染色(圖4);作為內源性過氧化物酶另一主要來源的紅細胞也能被成功封閉(圖io)。因此，微波熱修復起著抗原修復和滅活內源性過氧化物酶的雙重作用，嗜酸性粒細胞和紅細胞中的內源性過氧化物酶活性均可以微波滅活。(二)以人小腸和人結腸組織為實驗原料驗證微波加熱能封閉其中內源性過氧化物酶活性(本實驗中各實驗步驟與步驟一中(1)、(2)、(5)、(6)和(7)中所述相同，其中微波處理方法為本發明的改進的微波方法，其具體條件為微波功率為2.45GHz，調至650w，連續加熱10min。1、材料及切片的製備以人小腸組織和人結腸組織為實驗原料。選擇人的胃腸道組織是因為胃腸道已經被公認為是內源性過氧化物酶豐富的組織。材料來源本研究包括小腸和結腸組織91例，其中正常小腸組織40例，小腸腺癌組織7例、正常結腸組織30例和結腸腺癌組織14例。新鮮組織均來自北京大學第三醫院消化科造影室和消化內鏡中心，活檢前均已徵得患者或家屬同意並籤署知情同意書。活檢標本取出後直接置於4%多聚甲醛液中固定，固定液的量應超過所固定組織重量的610倍，做好標記及記錄(包括姓名、性別、年齡、病歷號、腸鏡或造影號、臨床診斷、部位、來源及數目)後帶回實驗室進行後續處理。44份人結腸組織和47份人小腸組織的石蠟切片的製備方法同上述(6)中所述一致。2、內源性過氧化物酶在人結腸組織和人小腸組織中的分布腸道組織是經前人實驗證實的內源性過氧化物酶較為豐富的組織。操作步驟同(一)中2所述，結果表明嗜酸性粒細胞和紅細胞是組織中內源性過氧化物酶的主要來源。3、微波加熱能封閉人結腸組織和人小腸組織中內源性過氧化物酶活性取與步驟2中相同來源的人結腸組織和人小腸組織石蠟切片，分別用表l中所示的第二種方法進行實驗，不加過氧化氫封閉液進行內源性過氧化物酶的封閉，切片經過微波熱處理後直接滴加DAB顯色。共處理了44份結腸組織和47份小腸組織。結果表明，在44份人結腸組織切片(圖ll)和47份人小腸組織切片(圖12)中，均未見內源性過氧化物酶的陽性染色，證明微波加熱可以滅活人結腸組織和小腸組織中的內源性過氧化物酶活性。(三)以小鼠的肝臟和脾臟組織為實驗原料驗證微波加熱能封閉內源性過氧化物酶活性(本實驗中各實驗步驟與步驟一中(1)、(2)、(5)、(6)和(7)中所述相同，其中微波處理方法為本發明的改進的微波方法，其具體條件為微波功率為2.45GHz，調至800w，連續加熱15min。1、材料及切片的製備以小鼠的肝臟和脾臟組織為實驗原料，因為紅細胞是內源性過氧化物酶的另一主要來源，考慮到肝臟和脾臟是血供極為豐富的組織，因此選擇小鼠的肝臟和脾臟組織標本作為實驗原料。材料來源來自小鼠，共3隻；小鼠由北京大學醫學部動物實驗中心提供。3隻小鼠的肝臟和脾臟組織石蠟切片的製備方法同上述(6)中所述一致。2、內源性過氧化物酶在小鼠的肝臟和脾臟組織中的分布取小鼠的肝臟和脾臟組織的經多聚賴氨酸預處理的石蠟切片，分別用表l中所示的第l種方法進行實驗，經脫蠟再水化後直接滴加DAB工作液顯色，DAB特異性的顯色過氧化物酶，而此操作並未使用外源性的過氧化物酶，如辣根過氧化物酶等，因此結果顯示的即為內源性的過氧化物酶在組織中的分布情況。同時，取小鼠的肝臟和脾臟組織的未經多聚賴氨酸預處理的石蠟切片各l張，按照一中(7)相同步驟進行蘇木素-伊紅染色，輔助判斷細胞性質實驗設3次重複。結果，如圖13所示，表明了內源性過氧化物酶在小鼠肝臟中的正常分布情況；如圖15所示，表明內源性過氧化物酶在小鼠脾臟中的正常分布情況。3、微波加熱能封閉小鼠的肝臟和脾臟組織中內源性過氧化物酶活性取與步驟2中相同來源的小鼠的肝臟和脾臟組織的經多聚賴氨酸預處理的石蠟切片，分別用表1中所示的第2種方法進行實驗，不加過氧化氫封閉液進行內源性過氧化物酶的封閉，切片經過微波熱處理後直接滴加DAB顯色。實驗設3次重複。在小鼠肝臟組織切片中未見內源性過氧化物酶的陽性染色(圖14)，在小鼠脾臟組織切片中未見內源性過氧化物酶的陽性染色(圖16);證明微波加熱可以滅活小鼠的肝臟和脾臟組織中內源性過氧化物酶的活性。實施例2、微波加熱封閉內源性過氧化物酶活性在免疫組化中的應用本實施例通過兩種方法觀察Bax抗原和Bc1-2抗原在組織中的表達情況，第一種方法是傳統的免疫組化方法，第二種方法是利用微波加熱封閉內源性過氧化物酶的免疫組化方法，通過抗原檢測效果和免疫組化染色效果的比較，看本發明的利用微波加熱封閉內源性過氧化物酶的免疫組化方法是否有效。一、實驗中用到的材料和試劑材料及來源本實施例以人的胃癌組織及上述結腸和小腸組織為實驗材料。材料來源結腸和小腸組織標本來源同上，胃癌組織標本均來自北京大學第三醫院消化科內鏡中心。人胃癌組織石蠟切片的製備方法同實施例l中(6)中所述一致。抗體一抗為Anti-BaxAb-1鼠抗人單克隆抗體，購自Neomarkers公司(LabVision,UK)，為即用型抗體；Bel-2為鼠抗人單抗，購自美國Sigma公司(SaintLouis)，稀釋濃度為l:600;二抗包括在SP檢測試劑盒中。SP檢測系統(Neomarkets公司(LabVision,Fremont,USA))。DAB等常規試劑購自北京中杉公司。二、檢測內源性過氧化物酶在上述組織中的分布情況本實驗是為了證明下面的免疫組化方法沒有假陽性的存在。取未經多聚賴氨酸預處理的人胃癌組織石蠟切片，經過蘇木素-伊紅染色，確定內源性過氧化物酶在其中的分布情況及輔助判斷細胞性質。結果如圖17和19所示，表明了人胃癌組織中內源性過氧化物酶的正常分布情況。三、免疫組化方法檢測Bax抗原和Bcl-2抗原在上述各組織中的表達情況方法一利用傳統方法進行免疫組化操作(使用過氧化氫封閉液進行常規封閉)對Bax抗原在人胃癌組織和人小腸組織中表達情況檢測及Bcl-2抗原在人結腸組織中表達情況檢測的的實驗步驟均如下I.脫蠟再水化二甲苯I20min—二甲苯Il20inin—無水乙醇I10min—無水乙醇IIlOmin—95%乙醇10min—90%乙醇10min—80%乙醇10min—蒸餾水；用PBS衝洗2次，每次5min。II.抗原修復(AR):同實施例l一中(3)所述。III.內源性過氧化物酶的封閉使用現用現配3%的過氧化氫封閉液，室溫避光孵育10min;用PBS衝洗3次，每次5min。IV.滴加稀釋好的一抗，溼盒中37'C孵育60min;用PBS衝洗3次，每次5min。陽性對照為Bax抗原陽性表達的淋巴瘤標本(美國Neomarkers公司提供，貨號為MS-7U-PCS)或Bcl-2陽性表達的組織(福州邁興公司)，陰性對照採用PBS緩衝液取代一抗的替代對照。V.滴加二抗，室溫孵育20min;用PBS衝洗3次，每次5min。VI.滴加辣根過氧化物酶標記的SP液，室溫孵育10min;用PBS衝洗3次，每次5min。W.DAB顯色將切片置於DAB顯色液中，室溫孵育1015min;自來水終止反應，並充分衝洗。Vffl.蘇木素復染蘇木素復染液蘇木素l克，碘酸鈉0.2克，鉀礬50克，水1000ml。向切片中滴加l-2滴蘇木素復染液，染15sec;自來水衝洗，洗去蘇木素。。IX.分色反藍向切片滴加分色液(75%酒精配製1%稀鹽酸液或0.02M檸檬酸液)，分色lmin;向切片滴加反藍液(0.1%氨水溶液)，反藍lmin。X.脫水透明80X乙醇2min——90X乙醇2rain—95X乙醇2min—無水乙醇I2min—無水乙醇II2min二甲苯I2min—二甲苯II2min。XI.封片中性樹膠封片，顯微鏡觀察。結果判定方法如實施例l中(8)所述一致。方法二結合本發明進行免疫組化操作方法本方法省略了過氧化氫稀釋液封閉內源性過氧化物酶的步驟，通過微波處理同時實現了內源性過氧化物酶的封閉和抗原修復。具體方法如下I.脫蠟再水化與上述方法一中所述一致。II.微波處理使用O.OlM檸檬酸緩衝液(pH6.0)，具體步驟如實施例l中(2)所示，其具體條件為微波功率為2.45GHz，調至720w(中、高火)，連續加熱15min，空氣中自然冷卻至室溫。III.其餘的滴加一抗和二抗、辣根過氧化物酶標記的SP液、DAB顯色、蘇木素復染、分色反藍、脫水透明、封片及結果判定方法均與上述方法一中所述一致。圖18和圖20是通過本發明方法進行的免疫組化檢測結果，表明Bax抗原在人胃癌組織中表達情況；圖21是通過本發明方法進行的免疫組化檢測結果，表明Bcl-2抗原在人結腸組織中的陽性表達結果；圖22是通過本發明方法進行的免疫組化檢測結果，表明Bax抗原在人小腸組織中的陽性表達。結果表明①與內源性過氧化物酶在人胃癌組織中、人小腸組織和人結腸組織中正常分布情況相比，本發明的省略過氧化氫稀釋液封閉液處理的免疫組化染色方法未見內源性過氧化物酶的假陽性染色，照片清晰，未見非特異性背景染色，特異性及敏感性較高；②與方法一中用傳統方法免疫組化檢測結果相比，結果未見差異。③以上結果證明本發明方法有效，微波高溫熱處理可以起到抗原修復和內源性過氧化物酶封閉的雙重功效，在免疫組化操作中，如果採用微波高溫熱處理作為抗原修複方法，並且採用O.OlM檸檬酸緩衝液(pH6.0)作為抗原修復液，可以省略稀釋過氧化氫封閉液的處理過程。本發明方法在理論上也是可以解釋的，微波加熱不但能起到抗原修復的作用，而且還能同時滅活內源性過氧化物酶活性，原因應該在於高溫直接導致了內源性過氧化物酶的變性。因為高溫能導致幾乎所有的蛋白質發生變性，因此有理由認為高溫同樣在一定程度上可以使內源性過氧化物酶發生變性。當然變性過程會受到石蠟引起的蛋白間交聯的影響，但是打斷蛋白之間形成的交聯本身就是抗原修復所需達到的目標，因此微波高溫最終導致內源性過氧化物酶變性並且消除由此帶來的背景染色也就不足為怪了。權利要求1、免疫組化中的滅活內源性過氧化物酶的方法，是用微波處理組織切片，滅活內源性過氧化物酶；所述微波的頻率為2.45GHz、功率為650～800w，所述處理的時間為10～15分鐘。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述微波的功率為720w;所述處理的時間為15分鐘。3、免疫組化中的滅活內源性過氧化物酶及抗原修復的方法，是將組織切片置於裝有抗原修復液的容器l中，再將所述容器1置於裝有水的容器2中，然後進行如下微波處理所述微波的頻率為2.45GHz、功率為650800w，所述處理的時間為1015分鐘。4、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述抗原修復液為0.OIM、pH為0.6的檸檬酸緩衝液。5、根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述微波的功率為720w;所述處理的時間為15分鐘。6、權利要求1-5中任一所述方法在免疫組化中的應用。7、一種免疫組化方法，包括用權利要求3-5中任一所述方法進行抗原修復和滅活內源性過氧化物酶的步驟。全文摘要本發明公開了免疫組化中一種滅活內源性過氧化物酶的方法。本發明所公開的免疫組化中一種滅活內源性過氧化物酶的方法，是用微波處理組織切片，滅活內源性過氧化物酶；2.45GHz、功率為650～800W，所述處理的時間為10～15分鐘。通過對各種組織的實驗證明，本發明的滅活內源性過氧化物酶的方法，既可以滅活內源性過氧化物酶，又可以起到抗原修復的作用，而且操作簡單、省時省力。因此，在免疫組化中應用本發明的滅活內源性過氧化物酶的方法，可以將抗原修復和內源性過氧化物酶的封閉合併為一步，進而省略了用稀釋的過氧化氫封閉液來滅活內源性過氧化物酶的步驟，使得免疫組化的操作步驟更為精簡，影響因素進一步減少。文檔編號C12N9/99GK101597602SQ20081011428公開日2009年12月9日申請日期2008年6月2日優先權日2008年6月2日發明者王愛英,韓亞京,春高申請人:北京大學第三醫院