用於人類脂肪幹細胞體外長期培養的聚合物塗層的製備方法及其應用與流程

2023-09-24 12:47:55

本發明涉及一種用於人類脂肪幹細胞體外長期培養的聚合物塗層的製備方法及其應用。

背景技術：

間充質幹細胞(MSCs)由於其多能性以及免疫調節的能力在再生醫學中越來越受到重視，但它們在體外長期培養擴增並保持其性能以用於臨床治療仍是一個挑戰，因此建立確定的安全培養系統來擴增細胞以用於臨床治療至關重要。儘管標準的TCP培養板足以支持MSCs從最初的異質組織分離物中分離和附著，但它不能夠確保這些幹細胞在體外長期培養生長後的多能特性。事實上，已經有研究表明MSCs在TCP上長期培養可能會降低其向成骨和成脂細胞分化的能力。另外，使用動物衍生基質如明膠、膠原蛋白或纖連蛋白作為培養基質也有不足，可能存在很多不確定因素，如存在批次差異，有引起病原體轉移感染的風險。因此，為了保持MSCs完整的臨床應用潛力，開發一種組成確定的合成基材對於MSCs的體外長期培養是迫切需要的。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是：基於上述問題，本發明提供一種用於人類脂肪幹細胞體外長期培養的聚合物塗層的製備方法及其應用。

本發明解決其技術問題所採用的一個技術方案是：一種用於人類脂肪幹細胞體外長期培養的聚合物塗層的製備方法，包括以下步驟：

a、蓋玻片的處理：

用等離子表面清洗機對蓋玻片正反兩面進行處理，然後將處理後的蓋玻片浸泡於的改性溶液中，放置一段時間，取出，溶劑淋洗，自然風乾，備用；

b、聚合物塗層的製備：

將單體、交聯劑、紫外光引發劑和溶劑按比例混合均勻，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將步驟a得到的蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣，紫外聚合，得到聚合物塗層；

步驟b中單體為：甲基丙烯酸羥乙酯A、甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨溶液E、甲基丙烯酸環己酯L、甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯K，聚合物塗層為：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，數字為各單體之間的質量比。

進一步地，步驟a中等離子表面清洗機功率500w，時間120s；蓋玻片的規格為φ30mm；改性溶液包括乙腈、三乙胺和3-(異丁烯醯氧)丙基三甲氧基矽烷，乙腈、三乙胺和3-(異丁烯醯氧)丙基三甲氧基矽烷的體積比為60～61：0.4～0.42：0.85～0.87。

進一步地，步驟a中處理後的蓋玻片浸泡於的改性溶液中，在恆溫振蕩器震蕩24h後，取出蓋玻片，用丙酮清洗2～3次，自然風乾，保存在-25℃冰箱中待用。

進一步地，步驟b中交聯劑為N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺，紫外光引發劑為1-羥環己基苯酮，溶劑為1-甲基-2-吡咯烷酮，單體固含量為50％，交聯劑和紫外光引發劑分別佔單體總質量的10％和5％，步驟b中聚合物溶液為10μL。

進一步地，步驟b中聚合物塗層具體製備方法為：用365nm紫外光照射30min後，將PET薄膜剝離，得到複合有聚合物塗層的載玻片，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，用丙酮和乙醇各衝洗兩次，自然風乾。

用於人類脂肪幹細胞體外長期培養的聚合物塗層的應用，包括：

c、人類脂肪幹細胞在聚合物塗層上的長期培養：

收集人類脂肪幹細胞消化並計數，接種到聚合物塗層表面進行長期體外培養；

d、誘導人類脂肪幹細胞向成脂、成骨、成軟骨細胞的分化：

待c中的人類脂肪幹細胞生長至80％融合時，分別更換成脂、成骨、成軟骨誘導培養液，以加入L-DMEM培養基組作為陰性對照組於培養箱中培養。

e、對誘導後的三種成體細胞分別進行染色定性：

成脂、成骨、成軟骨細胞誘導一段時間後分別進行油紅O染色、茜素紅染色、阿利新藍染色，然後進行拍照觀察。

進一步地，c中聚合物塗層表面進行長期體外培養的具體操作為：收集第2代人類脂肪幹細胞，將細胞濃度調整為1×105/mL，接種於載玻片的聚合物塗層上，載玻片置於6孔板中，每孔加2.5mL細胞懸液，用一個沒有聚合物塗層的TC板作為對照組；每3天換一次培養液，待對照組的細胞長到90％融合時，將所有實驗組及對照組的細胞分別脫壁計數，仍按1×105/mL的濃度分別接種於對應的聚合物塗層表面進行傳代長期培養。

進一步地，d中三種誘導培養液為：成脂誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-異丁基甲基黃嘌呤、10μmol/L胰島素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛；成骨誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸；成軟骨誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、10-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗壞血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸鈉、50mg/mL ITS、100ng/mL TGF-β3。

進一步地，d中人類脂肪幹細胞於37℃、5％CO2的培養箱中培養，每3d換液1次。

進一步地，e中三種誘導後的成體細胞染色具體操作為：成脂誘導3周後進行油紅O染色：細胞進行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min後用PBS衝洗兩次，用0.1μg/mL DAPI染色20min後用PBS衝洗兩次，再用60％的異丙醇溶液浸洗5min，然後再加入油紅O染色液室溫染色30min，最後用60％異丙醇水溶液清洗2-3次後用顯微鏡進行拍照觀察；成骨誘導4周後進行茜素紅染色：吸棄培養液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，後用PBS衝洗兩次，然後用2％的茜素紅水溶液染色20min，最後用PBS緩衝液清洗2-3次後進行拍照觀察；成軟骨誘導4周後進行阿利新藍染色：細胞進行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS衝洗兩次，加Alcian酸化液浸泡3min，然後加Alcian染色液染色15-30min，最後用去離子水衝洗2-3次後進行拍照觀察。

本發明的有益效果是：基於丙烯酸酯類/丙烯醯胺類的聚合物塗層具有良好的光學透明度以及生物相容性，有利於細胞培養與觀察，聚合物塗層不僅可以促進人類脂肪幹細胞的生長保持其增殖能力，而且還能保持其幹細胞特性，這些新的聚合物為人類脂肪幹細胞用於研究、工業化擴增和臨床應用的長期培養提供了一種高效、安全的、化學組成可控的合成基材。

附圖說明

下面結合附圖對本發明進一步說明。

圖1為實施例2的聚合物塗層E3K1L2的紅外譜圖；

圖2為3個實施例的聚合物塗層的熱失重曲線；

圖3為3個實施例的聚合物塗層培養的人類脂肪幹細胞分化成成脂細胞的分化率對比圖。

具體實施方式

現在結合具體實施例對本發明作進一步說明，以下實施例旨在說明本發明而不是對本發明的進一步限定。

實施例1

稱取0.1g甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.1g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸環己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環己基苯酮和0.03g N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min後，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最後用丙酮和乙醇各衝洗兩次，自然風乾，得到聚合物塗層E1K1L1。

將人類脂肪幹細胞按密度為1×105/mL接種於聚合物塗層上進行長期培養。收集第2代人類脂肪幹細胞，將細胞濃度調整為1×105/mL，接種於聚合物塗層上，聚合物塗層置於6孔板中(0.5％的瓊脂糖溶液處理過)，每孔加2.5mL細胞懸液，用一個沒有聚合物塗層的TC板作為對照組。每3天換一次培養液，待對照組的細胞長到90％融合時，將所有實驗組及對照組的細胞分別脫壁計數，仍按1×105/mL的濃度分別接種於對應的聚合物塗層表面進行傳代長期培養。

待細胞生長至80％融合時，分別更換成脂、成骨、成軟骨誘導培養液，並分別用油紅O、茜素紅、阿利新藍染色定性。

三種誘導培養液為：成脂誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、10μmol/L胰島素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛。成骨誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸。成軟骨誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、10-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗壞血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸鈉、50mg/mL ITS、100ng/mL TGF-β3。

成脂誘導3周後進行油紅O染色：細胞進行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min後用PBS衝洗兩次，用DAPI(0.1μg/mL)染色20min後用PBS衝洗兩次，再用60％的異丙醇溶液浸洗5min，然後再加入油紅O染色液(0.5％油紅O異丙醇溶液/水＝3/2)室溫染色30min，最後用60％異丙醇水溶液清洗2-3次後用顯微鏡進行拍照觀察。成骨誘導4周後進行茜素紅染色：吸棄培養液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，後用PBS衝洗兩次，然後用2％的茜素紅水溶液(PH4.2)染色20min，最後用PBS緩衝液清洗2-3次後進行拍照觀察。成軟骨誘導4周後進行阿利新藍染色：細胞進行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS衝洗兩次，加Alcian酸化液浸泡3min，然後加Alcian染色液染色15-30min，最後用去離子水衝洗2-3次後進行拍照觀察。

實施例2

稱取0.15g甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.05g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸環己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環己基苯酮和0.03g N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min後，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最後用丙酮和乙醇各衝洗兩次，自然風乾，得到聚合物塗層E3K1L2。

按實施例1步驟培養人類脂肪幹細胞並誘導、染色定性。

實施例3

稱取0.15g甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.05g甲基丙烯酸羥乙酯(A)、0.1g甲基丙烯酸環己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環己基苯酮和0.03g N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min後，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最後用丙酮和乙醇各衝洗兩次，自然風乾，得到聚合物塗層E3A1L2。

按實施例1步驟培養人類脂肪幹細胞並誘導、染色定性。

圖1為實施例2的聚合物圖層E3K1L2的紅外譜圖，光聚合反應前混合單體C＝C雙鍵在1630cm-1及650～730cm-1處的強吸收峰沒有在聚合物紅外譜圖中出現，說明三種單體發生了共聚反應。其他實施例的聚合物與此類似。

圖2為3種聚合物的熱失重曲線，從圖中可以看出，3種聚合物的熱失重過程相近，聚合物的初始熱分解溫度均在200℃左右，熱穩定性比較好，作為生物材料可以用於高溫滅菌處理。

圖3為3種聚合物塗層培養的人類脂肪幹細胞分化成成脂細胞的分化率。

實施例1～3中不同聚合物塗層培養的人類脂肪幹細胞其誘導分化率有差異，由圖3可知，聚合物塗層配比E1K1L1、E3A1L2和E3K1L2培養的人類脂肪幹細胞誘導分化為成脂細胞的分化率明顯高於對照組(TCP)，尤其是E3K1L2分化率為65％左右，高於在TCP表面培養的細胞的分化率55％。具有作為一種新型的醫用生物材料的應用前景。

以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的範圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性範圍並不局限於說明書上的內容，必須要根據權利要求範圍來確定其技術性範圍。