西瓜品種「京美」的特異性鑑定方法與流程
2023-09-24 12:48:35
本發明屬於蔬菜育種與應用技術，涉及一種西瓜品種「京美」的特異性鑑定方法。
背景技術：
西瓜不僅是北京市農民就業增收的高效園藝作物，也是滿足城鄉居民生活需求的重要時令水果。隨著西瓜產業的蓬勃發展，對於優質西瓜品種的需求越來越大。但是，巨大的利益驅使，導致西瓜市場混亂，「同物異名、同名異物」現象普遍存在，這給西瓜品種的智慧財產權保護、種子質量管理和新品種認定帶來了很大的困難。
為了規範市場並保護育種者的權益，需要對西瓜品種進行科學鑑定和評價。但目前缺乏簡單高效的品種特異性檢測手段，迫切需要研製一種簡便、快速、準確的西瓜種質資源鑑定評價技術及標準方法，以作為新品種保護的技術基礎和授權的科學依據。
傳統的品種特異性測試主要以形態特徵為基礎，受環境影響大、穩定性差，測試周期長，嚴重影響特異性測試的有效性和權威性。分子標記因具有多態性高、測試周期短、不受環境影響等顯著優勢，成為品種特異性審查和品種鑑定的發展方向。目前，簡單重複序列ssr(simplesequencerepeats)技術具有共顯性、準確率高、穩定性好等特點，因此，ssr分子標記在西瓜品種特異性評價中具有良好的應用前景。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種西瓜品種「京美」的特異性鑑定方法。
本發明所提供的西瓜品種「京美」的特異性鑑定方法，可包括如下步驟：
(a)建立西瓜品種「京美」的特異性分子身份證，包括如下步驟：
(a1)以西瓜品種「京美」的基因組dna為模板，採用28個核心ssr引物對分別進行pcr擴增，得到擴增產物。
其中，所述28個核心ssr引物對及每個引物對在西瓜種質資源範圍內對應的理論上所有可能擴增片段的大小分別為如下a1)-a28)：
a1)由序列1和序列2所示兩條dna單鏈組成的引物對1；267bp、259bp、246bp；
a2)由序列3和序列4所示兩條dna單鏈組成的引物對2；164bp、162bp、160bp、156bp；
a3)由序列5和序列6所示兩條dna單鏈組成的引物對3；150bp、140bp；
a4)由序列7和序列8所示兩條dna單鏈組成的引物對4；140bp、134bp；
a5)由序列9和序列10所示兩條dna單鏈組成的引物對5；166bp、157bp；
a6)由序列11和序列12所示兩條dna單鏈組成的引物對6；170bp、133bp；
a7)由序列13和序列14所示兩條dna單鏈組成的引物對7；229bp、221bp；
a8)由序列15和序列16所示兩條dna單鏈組成的引物對8；178bp、163bp；
a9)由序列17和序列18所示兩條dna單鏈組成的引物對9；279bp、269bp；
a10)由序列19和序列20所示兩條dna單鏈組成的引物對10；245bp、195bp、187bp；
a11)由序列21和序列22所示兩條dna單鏈組成的引物對11；275bp、268bp、168bp；
a12)由序列23和序列24所示兩條dna單鏈組成的引物對12；240bp、209bp；
a13)由序列25和序列26所示兩條dna單鏈組成的引物對13；210bp、189bp；
a14)由序列27和序列28所示兩條dna單鏈組成的引物對14；180bp、172bp；
a15)由序列29和序列30所示兩條dna單鏈組成的引物對15；225bp、195bp；
a16)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對16；299bp、278bp、245bp；
a17)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對17；130bp、125bp；
a18)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對18；175bp、165bp、145bp；
a19)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對19；210bp、190bp、160bp、129bp；
a20)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對20；210bp、158bp；
a21)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對21；300bp、279bp、252bp；
a22)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對22；190bp、165bp；
a23)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對23；128bp、120bp；
a24)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對24；184bp、170bp；
a25)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對25；258bp、249bp；
a26)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對26；174bp、168bp；
a27)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對27；249bp、237bp；
a28)由序列31和序列32所示兩條dna單鏈組成的引物對28；152bp、143bp。
(a2)將所述擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，根據電泳圖譜構建「0，1」矩陣；所述根據電泳圖譜構建「0，1」矩陣的方法為：觀察所述電泳圖譜在每個參考條帶位置有無條帶出現，根據觀察結果對所述電泳圖譜中所有參考條帶的出現與否按照特定順序依次進行標記，有條帶的記為「1」，無條帶的記為「0」；
所述所有參考條帶為步驟(a1)中出現的所述28個核心ssr引物對在西瓜種質資源範圍內對應的理論上所有可能擴增片段的條帶，共66個；
所述特定順序為：所述28個核心ssr引物對按照步驟(a1)中a1)-a28)的順序排列，每個引物對在西瓜種質資源範圍內對應的理論上所有可能擴增片段按照由大到小的順序排列。
即：最終所構建的「0，1」矩陣由數字「0」和「1」排列組成，「0」和「1」的個數之和為66。在構成所述「0，1」矩陣的66個數字(「0」或「1」)中，前3個出現的數字(「0」或「1」)分別表示採用所述引物對1進行擴增，267bp、259bp和246bp對應的參考條帶的有無(有則記「1」，無則記「0」)；第4-7個出現的數字(「0」或「1」)分別表示採用所述引物對2進行擴增，164bp、162bp、160bp、156bp對應的參考條帶的有無(有則記「1」，無則記「0」)；以此類推(按照以上步驟a1)-a28)中出現的順序)，第65-66個出現的數字(「0」或「1」)分別表示採用所述引物對28進行擴增，152bp、143bp對應的參考條帶的有無(有則記「1」，無則記「0」)。
所述「0，1」矩陣或由所述「0，1」矩陣轉換而成的二維碼即為西瓜品種「京美」的特異性分子身份證。
(b)以待測西瓜的基因組dna替代步驟(a1)和(a2)中的西瓜品種「京美」的基因組dna，執行步驟(a1)和(a2)，得到所述待測西瓜的指紋圖譜。
所述待測西瓜的指紋圖譜為所述待測西瓜的「0，1」矩陣或由所述「0，1」矩陣轉換而成的二維碼。
(c)將所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜品種「京美」的特異性分子身份證進行比對，從而確定所述待測西瓜是否為「京美」。
在本發明中，步驟(a2)中，所述聚丙烯醯胺凝膠電泳可為非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，具體如8％非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。220v穩壓電泳直至溴酚藍指示劑遷移至可以使擴增dna片段能夠被清楚識別的距離時，停止電泳；銀染法染色，拍照記錄電泳結果。
在所述方法的步驟(a2)中，具體可採用qr精靈軟體(具體如仙居朝歌軟體有限公司出品的qrcode轉化工具qr精靈2.12)將所述「0，1」矩陣轉換成相應的二維碼。
在所述方法的步驟(c)中，將所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜品種「京美」的特異性分子身份證進行比對，具體可按照如下確定所述待測西瓜是否為「京美」：如果所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜品種「京美」的特異性分子身份證相符，則所述待測西瓜為或候選為「京美」；反之，則所述待測西瓜不為或候選不為「京美」。
本發明還保護建立西瓜品種「京美」的特異性分子身份證的方法。
本發明所提供的建立西瓜品種「京美」的特異性分子身份證的方法，具體可包括上述的步驟(a)。
利用所述方法獲得的西瓜品種「京美」的特異性分子身份證也屬於本發明的保護範圍。
所述西瓜品種「京美」的特異性分子身份證在鑑定待測西瓜是否為「京美」中的應用也屬於本發明的保護範圍。
本發明還提供一種鑑定西瓜種質資源特異性的方法。
本發明所提供的鑑定西瓜種質資源特異性的方法，具體可包括如下步驟：
(a)建立西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫，包括如下步驟：
(a1)選取若干已知西瓜品種構成西瓜種質資源庫；
(a2)分別以所述西瓜種質資源庫中的各西瓜品種的基因組dna為模板，採用所述28個核心ssr引物對分別進行pcr擴增，得到擴增產物；
(a3)針對每個西瓜品種，將所述擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，然後按照上述步驟(a2)的方法根據電泳圖譜構建「0，1」矩陣；
所述西瓜種質資源庫中的所有西瓜品種的所述「0，1」矩陣或由所述「0，1」矩陣轉換而成的二維碼即構成所述西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫；
(b)以待測西瓜的基因組dna替代步驟(a2)和(a3)中所述西瓜種質資源庫中的西瓜品種的基因組dna，執行步驟(a2)和(a3)，得到所述待測西瓜的指紋圖譜；
(c)將所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫中的各指紋圖譜進行比對，從而確定所述待測西瓜是否為所述西瓜種質資源庫中的品種和/或確定所述待測西瓜為所述西瓜種質資源庫中的哪一品種。
在步驟(a3)中，所述聚丙烯醯胺凝膠電泳可為非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，具體如8％非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。
在步驟(c)中，將所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫中的各指紋圖譜分別進行比對，按照如下確定所述待測西瓜是否為所述西瓜種質資源庫中的品種，以及為所述西瓜種質資源庫中的哪一品種：如果所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫中的某一指紋圖譜a相符，則所述待測西瓜為或候選為所述西瓜種質資源庫中的品種，且為或候選為所述西瓜種質資源庫中具有所述指紋圖譜a的品種；如果所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫中全部指紋圖譜均不相符，則所述待測西瓜不為或候選不為所述西瓜種質資源庫中的品種。
在步驟(c)中，將所述待測西瓜的指紋圖譜與所述西瓜種質資源特異性指紋圖譜庫中的各指紋圖譜分別進行比對的方法具體可採用powermarkerv3.0軟體進行聚類分析。
在本發明中，所述西瓜種質資源庫中的已知西瓜品種有：京美、京美母本、京美父本，以及表1中所示的來自於33個育種公司的100份西瓜品種。
在本發明中，用於pcr擴增模板的西瓜基因組dna來自於西瓜幼芽樣本。所述基因組dna是採用鹼提取dna法製備的，具體步驟如下：將待測西瓜樣品的種子37℃發芽3-4天，取1cm幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min，加入ph8.0的tris-hcl緩衝液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存備用。
在本發明中，進行pcr擴增採用的反應體系如下：基因組dna20ng、含mg2+的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l-11μl，上下遊引物0.25mmol·l-1各1μl，taq酶5u·μl-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。
在本發明中，進行pcr擴增採用的擴增程序如下：94℃下預變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環反應；72℃延伸5min；16℃永久保存。
在本發明中，所述8％非變性聚丙烯醯胺溶液由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％(質量百分比)acr-bis、40μltemed、400μl10％(質量百分比)ap配製而成。
實驗證明，本發明與常規的田間種植鑑定方法對比，其優點表現在：
1)精準：本明是以ssr技術為基礎，構建了每個品種的唯一分子身份證，獲得的「京美」父本、母本和f1的特異性分子身份證，能靈敏、高分辨地將其與其他品種區分，可有效用於「京美」的真偽鑑定，為「京美」的智慧財產權保護提供了有效的科學依據。同時，在對不同類型西瓜品種鑑定評價時，只需將待測品種與已有特異性分子身份證比較分析，即可確定其真實性與特異性。
2)高效：常規的田間種植鑑定法要在結瓜後才能判斷品種特異性，周期長達1-2個月，本發明只需把待測品種種子發芽3-4天後，一步法快速提取基因組dna，用上述ssr引物進行分子標記檢測，5h之內即可完成品種特異性的鑑定工作。
3)簡單：與常規田間種植鑑定法相比，其操作簡單，程序化操作，不需特殊理論基礎。
附圖說明
圖1為利用表2中28對核心引物構建的京美母本特異性分子身份證。
圖2為利用表2中28對核心引物構建的京美父本分子身份證。
圖3為利用表2中28對核心引物構建的京美特異性分子身份證。
圖4為用powermarkerv3.0軟體對102份供試材料進行特異性分析。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、西瓜品種「京美」的特異性分子身份證的獲得
實驗材料為來自33個育種公司的100份西瓜品種，以及京美母本、京美父本，來源見表1。
表1各西瓜種質資源的名稱及來源
1、樣品dna的快速提取
將待測樣品種子37℃發芽3-4天，取1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩衝液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存備用。
2、pcr擴增
①反應體系
12.5μl反應體系如下：基因組dna20ng、含mg2+的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l-11μl，上下遊引物0.25mmol·l-1各1μl，taq酶5u·μl-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。
②反應條件
94℃下預變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環反應；72℃延伸5min；16℃永久保存。
③引物信息
所採用的引物對為28個核心ssr引物對及每個引物對在西瓜種質資源範圍內對應的理論上所有可能擴增片段的大小詳見表2。進行pcr擴增時，28個核心ssr引物對分別進行擴增。
表228個核心ssr引物對及可能擴增片段相關信息
3、聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳
針對每個樣本的28分擴增產物分別在8％聚丙烯醯胺非變性凝膠(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配製而成。％均表示質量百分比)電泳分離，120v穩壓1.5小時後，0.1％agno3銀染6min；然後用2％naoh、0.4％甲醛顯色。
4、拍照記錄樣品dna的特徵譜帶。
5、對電泳結果，進行人工比對、校正，在凝膠相同遷移率位置上，有條帶的記為「1」，無條帶的記為「0」，構建「0，1」矩陣，具體方法為：以所述28個核心ssr引物對在西瓜種質資源範圍內對應的理論上所有可能擴增片段的條帶(即表2中的「所有可能擴增條帶」，共66個)為參考條帶，觀察電泳圖譜在每個參考條帶位置有無條帶出現，根據觀察結果對所述電泳圖譜中所有參考條帶的出現與否按照特定順序依次進行標記，有條帶的記為「1」，無條帶的記為「0」；所述特定順序為：所述28個核心ssr引物對按照編號1-28的順序排列，每個引物對在西瓜種質資源範圍內對應的理論上所有可能擴增片段按照由大到小的順序排列。
即：最終所構建的「0，1」矩陣由數字「0」和「1」排列組成，「0」和「1」的個數之和為66。在構成所述「0，1」矩陣的66個數字(「0」或「1」)中，前3個出現的數字(「0」或「1」)分別表示採用表2中編號為1的引物對進行擴增，267bp、259bp和246bp對應的參考條帶的有無(有則記「1」，無則記「0」)；第4-7個出現的數字(「0」或「1」)分別表示採用表2中編號為2的引物對進行擴增，164bp、162bp、160bp、156bp對應的參考條帶的有無(有則記「1」，無則記「0」)；以此類推(按照以上表2中編號1-28的順序)，第65-66個出現的數字(「0」或「1」)分別表示採用表2中編號為28的引物對進行擴增，152bp、143bp對應的參考條帶的有無(有則記「1」，無則記「0」)。
6、採用仙居朝歌軟體有限公司出品的qrcode轉化工具qr精靈2.12，按照操作指南，將步驟5所得「0，1」矩陣，轉換為對應待測品種的特異性分子身份證，即待測品種的二維碼。
圖1是利用表2中28對核心引物構建的京美母本特異性分子身份證；圖2是利用表2中28對核心引物構建的京美父本分子身份證；圖3是利用表2中28對核心引物構建的京美特異性分子身份證。
7、通過powermarkerv3.0軟體進行聚類分析(按照操作手冊進行操作)。聚類結果顯示，京美母本、京美父本和京美，與其他商業品種完全區分，說明其分子身份證是特異的。
圖4是用powermarkerv3.0軟體對102份供試材料進行特異性分析。
本實施例結果顯示：本發明所提供的方法可有效用於「京美」的真偽鑑定，本發明為「京美」的智慧財產權保護提供了有效的科學依據。
北京市農林科學院
西瓜品種「京美」的特異性鑑定方法
gncln171416
56
patentinversion3.5
1
20
dna
人工序列
1
tcaaaccgactgccatatca20
2
20
dna
人工序列
2
agcttgtcttcctggccttt20
3
24
dna
人工序列
3
tggatcatttgacagatttagcga24
4
24
dna
人工序列
4
catcacagttaacgatcacaaggc24
5
24
dna
人工序列
5
acaactttgattgattgcacgatg24
6
24
dna
人工序列
6
aagtgaaagacccttttcccaaac24
7
24
dna
人工序列
7
gaggagaatcggttcttggacata24
8
24
dna
人工序列
8
ttgagcatccttgggactatcatt24
9
24
dna
人工序列
9
tcaaaaggtttgccctaaatgaaa24
10
24
dna
人工序列
10
tgctgatctcccattcttaacctc24
11
24
dna
人工序列
11
gcaaagattgtctatgaagcagca24
12
24
dna
人工序列
12
gctcattggcttcttgaatctgtt24
13
22
dna
人工序列
13
aaaattacatcttaaatgcgcc22
14
22
dna
人工序列
14
ggaacattgacttcaatcagca22
15
24
dna
人工序列
15
tggttgaaatcaataaaaagtgaa24
16
20
dna
人工序列
16
tggatgtttttggcatttga20
17
21
dna
人工序列
17
ttagcctaagcaagggttttt21
18
27
dna
人工序列
18
aagtacacattttaaacaatcaatcca27
19
24
dna
人工序列
19
tggcctagaagattattgagctgc24
20
26
dna
人工序列
20
cattatcacatggcagataatggaaa26
21
22
dna
人工序列
21
tggatagaatggaaagctctga22
22
20
dna
人工序列
22
tcccacacatcattccaaaa20
23
22
dna
人工序列
23
ttcttgaaactcaaccctcaaa22
24
20
dna
人工序列
24
aaagcgtgtcgagtgtgaga20
25
20
dna
人工序列
25
atttctggccccagtgtaag20
26
20
dna
人工序列
26
gaacaacgcaaccacgtatg20
27
20
dna
人工序列
27
caaccggtcttcgtgaattt20
28
20
dna
人工序列
28
cggccaccacttctcatatt20
29
22
dna
人工序列
29
ccctattgcctatttttctcaa22
30
20
dna
人工序列
30
aaatttgtgctcttcgtggg20
31
23
dna
人工序列
31
tcttttaagttttgagggagagc23
32
20
dna
人工序列
32
ttcccaagctagccttttca20
33
20
dna
人工序列
33
aacgcacgatagttagaagg20
34
25
dna
人工序列
34
tgactaattaaactacactcagact25
35
24
dna
人工序列
35
catttccgtttccattttcttcac24
36
24
dna
人工序列
36
aagtaacatcaagcagttcgccat24
37
24
dna
人工序列
37
tgagaaaatggaagatgcaaatga24
38
28
dna
人工序列
38
ttcttctcactctctcctaagattttgc28
39
20
dna
人工序列
39
atggttcattttcacgttcg20
40
23
dna
人工序列
40
aaaaatcaagcaaagaacaacat23
41
26
dna
人工序列
41
tgcttcaaaatctattcacaatttgc26
42
24
dna
人工序列
42
ttcttggtttcgggtttctttaca24
43
18
dna
人工序列
43
cccccgccaaaattaaaa18
44
21
dna
人工序列
44
cacccgtgtaaaggtggtaaa21
45
26
dna
人工序列
45
tgttgagattctttgatttcaactgt26
46
24
dna
人工序列
46
tgggtcaaagtatttttgcttttt24
47
25
dna
人工序列
47
ttcaaccaagcagttcttaacacaa25
48
24
dna
人工序列
48
gatgcattaagattttcgtttcgc24
49
20
dna
人工序列
49
tctgtgtggatgcaaatggt20
50
20
dna
人工序列
50
gctaatcgagcccagttacg20
51
24
dna
人工序列
51
cttgagcatttggcttcctagtgt24
52
24
dna
人工序列
52
gtcaaaatgtcctttgattcccaa24
53
20
dna
人工序列
53
ttccacaccaaggaggtagg20
54
23
dna
人工序列
54
catgtcattcgataaagcagaaa23
55
28
dna
人工序列
55
ggaagagtgaggtgataaatcaatatgt28
56
24
dna
人工序列
56
aattggcccaaatatccatatgac24