多肽有機化合物及其在異種移植中的應用的製作方法

2023-09-23 23:25:20

專利名稱：多肽有機化合物及其在異種移植中的應用的製作方法
多肽有機化合物及其在異種移植中的應用技術領域本案為申請號2006100501640的分案申請，本發明屬有機化合物，主要涉 及多肽類有機化合物，尤其是關於人工合成的多肽有機化合物及其在異種移植 中的應用。 技術背景醫學技術的進步使人類同種器官移植成為了可能。由於人體器官的來源不 足，大量的病人得不到急需的器官，利用豬的器官代替人體器官是目前研究的 熱點。但由於豬的細胞表面存在異種抗原表位Gal-oc-l, 3-Gal能與人體內預存 的天然抗體結合產生超急性排斥反應，從而導致異種器官移植的失敗。人們在 努力尋找一種方法可以封閉或清除人天然抗a -Gal抗體，為異種器官移植開闢 途徑。噬菌體展示技術是一種能夠篩選與靶分子結合的特異性多肽的有力工 具，已成功運用於抗原表位，特異性受體激動劑或抑制劑和疫苗的研究。在本 實驗中我們利用噬菌體展示技術，對兩種肽庫，線性7肽庫和C7C文庫，進行 了親和篩選。線性7肽庫中展示的多肽沒有結構限制，具有相對柔性的結構。 C7C肽庫展示的多肽由於有一對二硫鍵的限制而形成環狀，構象相對穩定。同 時採用兩種肽庫進行篩選，目的在於比較由於結構不同而造成的篩選出的多肽 在胺基酸序列上的差異。由於抗B型血單克隆抗體有結合a -Gal抗原表位的特 性，因此我們以抗B型血單克隆抗體為靶分子，篩選出能夠模擬a-Gal抗原表 位的多肽，可以特異地阻斷天然抗a-Gal抗體，可以用於異種器官移植超急性 排斥反應。目前臨床常用的免疫抑制劑有環孢素A、糖皮質激素、硫唑嘌呤、環磷醯 胺等，可以降低整體的免疫反應，但對異種器官移植超急性排斥反應無效，並 且有多種副作用，如常見的就有骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血、脫髮等 等。我們篩選到的多肽化合物可以特異地阻斷異種器官移植超急性排斥反應， 但不影響人體的整體免疫反應，可避免常用免疫抑制劑引起的副作用。 發明內容本發明的目的是克服目前臨床上異種器官移植術中出現的排斥反應，設計 並提供一種多肽有機化合物。本發明提供的多肽有機化合物，選自a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h八種中的一種，能與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶於水，各胺基酸之間通過肽鍵相連。本發明提供的多肽有機化合物a的胺基酸序列為-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量為915. 96 ;多肽有機化合物b的氨基 酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963. 06;多肽有機化合 物c的胺基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763. 86;多 肽有機化合物d的胺基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys， (其中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為963. 15;多 肽有機化合物e的胺基酸序列為Cys-His-11 e-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其 中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為902.07;多肽有 機化合物f的胺基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中 第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1031. 18;多肽有機 化合物g的胺基酸序列為Cys-His-Gin-Thr-Pro_Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第 l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為987. 13;多肽有機化 合物h的胺基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1 位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為951. 14。本發明的第二個目的是提供多肽有機化合物a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h在制 備治療器官移植術中控制異種移植中超急性排斥反應的藥物中的應用。 本發明的優點有① 本發明的多肽有機化合物，由於分子組成只有7 9個胺基酸，故可以 用人工化學合成方法大量合成，可以得到大量較純的小肽。② 能與人體內預存的抗豬抗原的抗體特異性結合，從而封閉它的作用， 可以抑制豬器官移植至人體時發生的超急性排斥反應。③ 本發明的多肽有機化合物與人體內預存的天然抗a -Gal抗體的結合位 點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而避免了由於作用位點特異性不強 而帶來的副作用。④ 由於本發明的多肽有機化合物的組成胺基酸數量較少，開發成藥物後容 易被機體利用而起效。


圖1為三種線性多肽與水蘇糖競爭性與抗B單克隆抗體結合的ELISA抑制 率曲線圖。圖2為五種C7C環肽與水蘇糖競爭性與抗B單克隆抗體結合的ELISA抑制 率曲線圖。圖3為多肽化合物抑制人天然抗體引起的豬紅細胞的凝集反應結果圖。
具體實施方式
本發明結合以下實施例及附圖作進一步說明。實施例l:用抗B型血單克隆抗體作為靶蛋白，用噬菌體展示技術篩選得 到陽性噬菌體克隆。噬菌體展示技術是利用分子生物學技術將合成的一組一定長度的隨機序列 寡核苷酸片段克隆到特定表達載體中，使其表達產物以融合蛋白的形式呈現在 噬菌體表面。由於肽庫中包含了該長度小肽的所有可能的胺基酸排列順序，每 一個噬菌體表面蛋白呈現其中的一種肽段，便於篩選；篩選到的噬菌體，可以 通過細菌擴增。用噬菌體肽庫感染大腸桿菌，使重組入噬菌體的隨機的寡核苷 酸片段在大腸桿菌內複製，並在噬菌體的外殼蛋白中表達出來。然後，把靶蛋 白包被在酶標板上。用此噬菌體肽庫與靶蛋白混合後，洗板。如果噬菌體上的 外殼蛋白能與靶蛋白結合，就不會被洗掉。最後用酸或親和洗脫液把噬菌體洗 脫下來。連續這樣篩3-4輪，就能篩出與耙蛋白結合力較強的噬菌體。測此噬 菌體的DNA序列得到重組寡核苷酸的序列，亦知道了相應的多肽的序列。然後 可通過人工化學合成的方法得到多肽。本發明提供的多肽有機化合物，包括a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h八種，能 與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶於水，各胺基酸之間通過肽鍵相連。本發明提供的多肽有機化合物a的胺基酸序列為 Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser,分子量為915. 96 ;多肽有機化合物b的氨基 酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963. 06;多肽有機化合 物c的胺基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763. 86;多 肽有機化合物d的胺基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys， (其中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為963. 15;多 肽有機化合物e的胺基酸序列為Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其 中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為902.07;多肽有 機化合物f的胺基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中 第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1031. 18;多肽有機 化合物g的胺基酸序列為Cys-His-Gin-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第 l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為987. 13;多肽有機化合物h的胺基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1 位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為951. 14。實施例2:水蘇糖競爭性ELISA實驗試驗方法在96孔酶標板中包被100 W抗B型血單克隆抗體4 0C過夜， 用5% BSA 37 0C封閉2小時，然後用TBS洗板3次，加入100 m陽性噬菌體 和終濃度分別為100、 20、 4、 0. 8、 0. 16、 0. 032 mM的水蘇糖混合液反應1小 時,另設不加水蘇糖的陽性噬菌體液作為空白對照。用含0. 1% Tweeri 20的TBS 洗板6次，加入辣根過氧化物酶標記抗M13抗體，結合1小時，用含0. 1% Tween 20的TBS洗板6次，TMB進行顯色，用酶標儀測定吸光度。計算抑制率 按照公式[A柳(-s)-A45。(+s)]/A45。(-s) X100%， A45。(-s)為未加水蘇糖的吸光度， A45。(+s)為加入水蘇糖的吸光度。試驗結果水蘇糖能有效的抑制多肽與抗體的結合，說明水蘇糖與多肽結 合於抗體的同一位置，即a-Gal抗原表位結合位點。這說明了陽性克隆很可能 就結合在水蘇糖與抗B型血單克隆抗體結合的位點。結果參見圖l， 2，。實驗 發現，總體來說，水蘇糖對環肽比線性多肽抑制率要高，說明篩選的線性多肽 比環狀多肽對抗體的親和力強。以上實例說明了多肽有機化合物與抗B單克隆抗體的結合位點(a-Gal結 合位點)是特異性的，正好起到封閉抗B單克隆抗體作用，從而避免了由於作 用位點特異性不強而帶來的副作用。實施例3:多肽抑制人血清與豬紅細胞的凝集反應試驗方法先把製備好的新鮮線豬紅細胞懸浮在pH 7. 4的磷酸鹽緩衝液 中備用。在U型血凝板的孔裡，40W多肽用磷酸緩衝液依次逐孔倍比稀釋後， 每孔分別加入40W適當稀釋的A型人血清和1%的豬紅細胞。然後把此 的混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時後觀察凝集結果。如 果紅細胞沉澱到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點，則此為沒有凝集。如果紅細 胞形成一網絡，並不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點，此為出現凝集。試驗設 空白、陽性和陰性對照。試驗結果此多肽預先能與A型人血清中的抗a-Gal抗體結合，使其失活。 這樣此抗體就不能再與豬紅細胞上的Gal-a-l， 3-Gal抗原結合，從而阻斷人 抗ot-Gal抗體引起的豬紅細胞凝集反應。結果參見圖3。在圖3中，A1 A2，H1 H2， 01 02均是空白對照，用40W 1%的豬紅細胞和80W磷酸鹽緩衝液 混勻後靜置l小時，紅細胞沉於凝集板底部，出現光滑圓點，此結果表明沒有 出現凝集。A3 A4， H3 H4， 03 04為陽性對照，用鄉l 1%的豬紅細胞， 1%人血清，和磷酸鹽緩衝液混勻後靜置1小時，紅細胞沒有下沉呈現光 滑圓點，而是呈現網絡狀結構，出現凝集。B， B'兩條均為水蘇糖抑制豬紅細 胞凝集實驗的結果，在1 4孔中依次加入了 用磷酸鹽緩衝液稀釋的不同 濃度的水蘇糖(濃度依次為200 mM, 40函，8 mM， 1. 6 mM)，然後加入4014 1% 的豬紅細胞和40W 1%人血清，混勻後靜置l小時。B1 B2、 B， 1 B， 2沒有 出現凝集，B3、 B' 3開始有網絡狀結構出現，有明顯凝集的現象，說明水蘇糖 能抑制由人夭然抗a-Gal抗體誘發的豬紅細胞凝集。Cl-4和C'卜4為噬菌體 展示肽a抑制豬紅細胞凝集實驗的結果，在1 4孔中依次加入了用磷酸鹽緩 衝液稀釋的不同濃度的噬菌體(濃度依次為0. 1 mM， 0. 02 mM， 0. 004 mM， 0. 0008 raM) 40 W，再加入40 W淺的豬紅細胞和40 W 1%人血清，混勻後靜置1 小時。Cl， C， 1沒有出現凝集，C2， C' 2開始有網絡狀結構出現，有明顯凝 集的現象。E1-4和E， 1-4，11-4和I， 1-4，J1-4和J， 1-4， K1-4和K， 1-4， L1—4和L， 1一4, M1-4禾卩M， 1-4， Pl-4禾B P， 1—4， Q1—4和Q， 1—4，分別是噬 菌體展示肽b， h， e， k， d， g， c， f的實驗結果，實驗方法和噬菌體濃度如 前。除了噬菌體展示肽k(其胺基酸序列為Ser-Ser-Thr-lie-Ala-Asn-Thr)， 各噬菌體克隆均能在0. 1 mM濃度下有效地抑制凝血，噬菌體展示肽k可能對 抗體結合能力不足，未能明顯抑制凝血。G1-4和N1-4為未經過篩選的野生型 噬菌體(陰性對照)，分別來自線性7肽庫和C7C肽庫，均出現凝集。D1-4和 D' 1-4, F1-4和F' 1-4， R1-4和R' 1-4分別是化學合成的多肽a， b, f的實 驗結果，實驗方法如前，多肽濃度均依次為20 mM， 4 mM， 0. 8mM, 0. 16mM，可 見多肽a和b在濃度為4mM時可抑制凝血，而多肽f需要的濃度是20mM。 Sl-4 為陰性對照，加入的多肽序列為Cys-Val-Gin-Pro-Ser-His-Ser-Ser-Cys，均 出現凝集；上述結果重複3次，呈現良好的一致性。以上實例用形象而直接的方式說明了多肽有機化合物除了能與抗B單克隆 抗體結合外，還能與人體內預存的抗豬抗原的抗體(抗(x-Gal抗體)特異性結 合，從而封閉它的作用，可以抑制人天然抗體(抗a-Gal抗體)觸發的異種移 植超急性排斥反應的發生。無需進一步詳細闡述，相信採用前面所公開的內容，本領域技術人員可最 大限度地應用本發明。因此，前面的優選具體實施方案應理解為僅是舉例說明， 而非以任何方式限制本發明的範圍。本發明涉及的序列 1 7 PRT 人工序歹Li 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 1Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser 1 52 7 PRT 人工序列 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 2Phe-His隱Glu國Phe-Trp-Pro-Thr 1 53 7 PRT 人工序列 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 3Ser-Met-Leu-Asp-Thr陽Pro-Thr 1 5 4 9 PRT 人工序列根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 4Cys陽Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵) 5 9 PRT 人工序列 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 5Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr陽Ala-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)6 9 <212〉 PRT 人工序列 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 6Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser陽Leu-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)7 9 PRT 人工序列 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備7Cys陽His-Gln-Thr-Pro陽Leu-Ser陽Thr-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵) 8 9 PRT 人工序列 根據胺基酸序列設計，用於異種移植過程中超急性排斥反應抑制劑的製備 8Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr隱Leu-Thr-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)
權利要求
1.一種多肽有機化合物，其特徵是提供的多肽有機化合物選自胺基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為1031.18的多肽有機化合物f。
2. 根據權利要求1所述的多肽有機化合物在製備治療器官移植術中控制 異種移植中超急性排斥反應的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種多肽有機化合物，選自胺基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為1031.18的多肽有機化合物f，能與抗B型血單克隆抗體特異性結合，溶於水，各胺基酸之間通過肽鍵相連。本發明的多肽有機化合物能與人體內預存的抗豬抗原的抗體特異性結合，從而封閉它的作用；可以特異地阻斷異種器官移植超急性排斥反應，與人體內預存的天然抗α-Gal抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，但不影響人體的整體免疫反應，可避免常用免疫抑制劑引起的副作用。
文檔編號A61P37/06GK101230093SQ20081000131
公開日2008年7月30日 申請日期2006年3月31日 優先權日2006年3月31日
發明者嚴志焜, 詹金彪, 許林海, 郎建社 申請人:浙江大學