香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的應用的製作方法
2023-10-18 17:05:44 1
專利名稱：香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的醫學方面的應用背景技術香鱗毛蕨(Dryopteris fragrans L.)為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，主要生長在黑龍江省五大連池及華北地區。該藥目前還未收入藥典，國內外對其研究較少，只有關於香鱗毛蕨的生藥學和藥效學研究，民間廣泛用其治療多種皮膚病。
本申請人長期深入的致力於香鱗毛蕨的相關研究，並取得了研究成果。在2005年5月第36卷第5期的《中草藥》上發表了《香鱗毛蕨對真菌的抑制作用》，闡述了香鱗毛蕨提取物的抗真菌作用；在2006年4月第22卷第2期的《中草藥》發表了香鱗毛蕨《CO2超臨界萃取物的GC-MS分析》一文，公開了首次從香鱗毛蕨中分離得到的15種成分，並進行了相應的藥效試驗，揭示了其脂溶性成分的抗菌止癢作用；在2006年7月第37卷第7期的《中草藥》中發表了從香鱗毛蕨乙醇提取物中分離鑑定出的3個化合物，並提供了提取和分離方法；特別是在2006年6月第29卷第6期的《中藥材》中發表了《香鱗毛蕨中間苯三酚衍生物的研究》一文，利用多種色譜技術進行分離純化，根據理化性質和現代波譜技術並輔以化學方法進行結構鑑定，分離出4個單體，分別鑑定為Aspidin PB(I)、Dryofragin(II)、Aspidinol(11I)、Aspidin BB(IV)。申請人對其進行了生藥學研究，部分藥效學及藥效物質基礎化學研究，實驗結果顯示香鱗毛蕨具有良好的抗菌作用。
癌症是危害人民生命和健康的重要疾病之一，抗腫瘤活性化合物或先導物的發現是抗癌藥物研究的重要方面，而尋找天然的抗腫瘤活性化合物更是迫在眉睫。
進一步研究香鱗毛蕨的其他重要醫藥學作用，尤其是其抗腫瘤作用，具有非常重要的意義。
發明內容
本發明的目的是提供香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的新應用，尤其是在製備抗腫瘤醫藥學技術領域的應用。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的提供了香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的應用，其特徵是在製備抗腫瘤藥物方面的應用。
尤其是在製備治療S180肉瘤、Lewis肺癌或HepA肝癌藥物方面的應用。
本發明所述香鱗毛蕨間苯三酚類衍生物主要包括Aspidin PB(I)、Dryofragin(II)、Aspidinol(11I)、Aspidin BB(IV)間苯三酚衍生物，利用多種色譜技術進行分離純化，根據理化性質和現代波譜技術並輔以化學方法進行結構鑑定，數據如下化合物I無色柱狀結晶，mp134-136℃(MeOH)，FAB-MSm/z 447(M+H)+，(C24H30O8)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.99(3H，t，J＝7Hz，H-11′)，1.17(3H，t，J＝7Hz，H-10)，1.45，1.53(3H，brs，H-11，12)，1.72(2H，J＝7Hz，H-10′)，2.14(3H，s，H-12′)，3.08(2H，t，7Hz，H-9′)，3.2(2H，q，J＝7Hz，H-9)，3.57(2H，H-7)，3.73(3H，S，H-7′)，10.0(1H，s，6′-OH)，10.7(1H，s，6-OH)，15.6(1H，s，2′-OH)，18.5(1H，s，4-OH)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ8.4(C-10)，9.2(C-12′)，13.9(C-11′)，17.1(C-7)，18.2(C-10′)，24.3(C-11)，25.3(C-12)，34.8(C-9)，42.9(C-9′)，44.2(C-5)，61.5(C-7′)，107.5(C-3′)，108.0(C-3)，109.4(C-5′)，110.9(C-1)，112.4(C-1′)，159.6(C-4′)，160.2(C-6′)，162.8(C-2′)，171.8(C-6)，187.5(C-4)，198.0(C-2)，206.8(C-8)，207.4(C-8′)。以上數據與目前本領域已有文獻資料對照一致，確定該化合物為AspidinPB。
化合物II無色針狀結晶，mp.180-181℃(MeOH)，FAB-MSm/z 459(M+H)+，(C28H42O5+H)。H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.73(s，H-13)，0.88(s，H-14，15)，0.99(t，J＝7Hz，H-11′)，1.34，1.35(s，H-12′，13′)，1.66(J＝7.0Hz，H-10′)，2.51(t，J＝7Hz)，2.13(m，H-9，12，7′)，2.98(dt，J＝7Hz，H-9′)，3.71(dd，J＝11.0，9.0Hz，H-11)，4.08(d，J＝11.0Hz，H-11)，5.64(H-7)，19.12(4′-OH)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ35.3(C-1)，18.8(C-2)，35.8(C-3)，33.0(C-4)，49.6(C-5)，25.2(C-6)，124.8(C-7)，136.6(C-8)，55.0(C-9)，39.6(C-10)，63.0(C-11)，22.3(C-12)，14.3(C-13)，22.0(C-14)，105.5(C-1′)，197.8(C-2′)，106.8(C-3′)，189.0(C-4′)，42.1(C-5′)，175.6(C-6′)，29.7(C-7′)，203.7(C-8′)，41.9(C-9′)，18.5(C-10′)，14.0(C-11′)，23.6(C-12′)，24.5(C-13′)。以上數據與已有相關文獻資料一致，確定該化合物為Dryofragin。
化合物III無色針狀結晶，mp145-146℃，ESI-MSm/z 225(M+H)+，(C12H15O4)。H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.99(3H，t，J＝7Hz，H-11)，1.73(2H，sextet，J＝7Hz，H-10)，2.01(3H，s，H-12)，3.06(2H，t，J＝7Hz，H-9)，3.82(3H，s，H-7)，5.95(1H，s，H-5)，13C NMR(125MHz，CDCl3)δ7.1(C-12)，14.0(C-11)，18.2(C-10)，46.1(C-9)，55.6(C-7)，85.6(C-1)，91.5(C-5)，104.8(C-3)，159.6(C-2)，161.1(C-4)，163.2(C-6)，206.2(C-8)。確定該化合物為Aspidinol。
化合物IV無色針狀結晶，mp124-125℃，ESI-MSm/z 460(M+H)+，(C25H3O8)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.99(3H，t，J＝17Hz，H-11′)，1.01(3H，t，J＝7Hz，H-11)，1.44(3H，s，H-12′)，1.53(3H，s，H-13′)，1.71(2H，m，H-10′)，1.71(2H，m，H-10)，2.14(3H，s，H-12)，3.08(2H，m，H-9)，3.08(2H，m，H-9′)，3.57(2H，s，H-7′)，3.73(3H，s，H-7)，10.0(1H，s，6-OH)，10.7(1H，s，4′-OH)，15.6(1H，s，2-OH)，18.6(1H，s，6′-OH)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ9.2(C-12)，13.9(C-11)，13.9(C-11′)，17.1(C-7′)，18.0(C-10)，18.1(C-10′)，24.2(C-12′)，25.2(C-13)，42.9(C-9′)，44.2(C-5′)，44.2(C-9)，61.5(C-7)，107.4(C-3)，108.2(C-3′)，109.1(C-5)，110.9(C-1′)，112.4(C-1)，159.5(C-4)，160.2(C-6)，162.8(C-2)，171.7(C-6′)，187.4(C-4′)，198.6(C-2′)，206.5(C-8′)，206.8(C-8)。確定該化合物為Aspidin BB。
具體提取分離實驗中使用的儀器與材料及方法皆為已有的常規方法，簡述如下1儀器與材料
X-6型熔點測定儀，溫度計未校正；核磁共振譜用Varian UnityINOVA500型核磁共振儀測定，1H-NMR譜500MHz，13C-NMR譜125MHz，TMS為內標；質譜用VG Autospec-500質譜儀測定；製備HPLC為Agilent 1100series型。薄層色譜和柱色譜矽膠均為青島海洋化工廠產品，Sephadex LH-20為Pharmacia公司產品。香鱗毛蕨於2003年9月採自黑龍江省五大連池，經哈爾濱師範大學劉鳴遠教授鑑定。
2提取和分離取香鱗毛蕨粗粉2.5kg，10倍量正己烷即25L室溫冷浸2天，採用紗布過濾後，抽濾，旋轉蒸發儀濃縮，浸膏經反覆矽膠、SephadexLH-20柱層析及製備HPLC分離，得化合物I-IV。
本發明具有以下有益效果1、本發明提供的新型天然抗腫瘤活性化合物抗腫瘤活性強，可來源於天然植物資源，安全性高。
2、對所述提取物的進一步研究有望發現選擇性高、活性強、毒副作用小、抗瘤譜廣、抗多藥耐藥性好的新型抗癌藥物，具有重要的潛在產業化開發價值以及對人類研究抗癌藥物的重大貢獻。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，實施例中選用了提取物中的化合物I-IV，但並不因此將本發明局限於化合物I-IV。
實施例1本發明的抗腫瘤作用一、香鱗毛蕨間苯三酚類提取物對腫瘤細胞的抑制作用1.實驗材料(1)動物KM種清潔級雄性小鼠(2)細胞株小鼠肝癌細胞(H22)，小鼠肉瘤細胞(S180)(3)SulforhodamineB(SRB)染色試劑，SIGMA公司購買。
1.2實驗儀器酶標儀BlO-RAD model 4501.3實驗方法(1)腫瘤細胞培養置於37℃，5％CO2溫箱中，以含10％胎牛血清和青黴素和鏈黴素的RPMI1640培養基培養。
(2)SRB法取對數生長期的癌細胞，接種於96-孔板中，細胞密度為每孔5000細胞/200μl。24小時後，加入等系列稀釋的藥物。細胞在藥物作用下，繼續培養72小時。之後，除去所有的培養液，細胞以10％三氯醋酸固定1小時後，置空氣中自然乾燥24小時，加入50μl SRB(sulforhodamineB)染色20-30分鐘，以1％冰醋酸洗滌5次，置空氣中自然乾燥後，加入200μl的10mmolTris-HCI(PH＝10.0)溶液溶解紫紅色蛋白-SRB複合物，於600nm波長處測定光吸收值。求得各組試驗數據的平均值，以實驗組對對照組計算得細胞生成抑制率。以Sigma PlOT繪圖軟體繪得細胞生長率一藥物濃度半對數曲線，並求得藥物的半數抑制有效濃度(IC50)。
(3)建立小鼠移植性腫瘤模型取H22傳代腹水小鼠在無菌條件下製備5×109/L細胞懸液，分別接種於小鼠右前肢腋下，每隻0.2ml。接種S180方法同上。
於接種次日以0.01ml/g體重腹腔注射(ip)給藥，每日1次，連續給藥10-15d，停藥次日稱體重後，處死小鼠，取瘤稱重，計算各組腫瘤抑制率。各給藥組與對照組間以t檢驗進行統計學分析。
對化合物I-IV的抗癌活性進行研究。表1列出的是藥物對各種癌細胞的半數有效抑制濃度。由表1可以看出，不管是S180肉瘤、H22肝癌細胞，對化合物有一定的敏感性，其半數有效抑制濃度IC50在4-14μM之間，與臨床常見的化療藥物相似，例如維甲酸。這說明化合物I-IV具有良好的抗癌活性。
表1 化合物I-IV對腫瘤細胞的半數抑制有效濃度及與其它化療藥物的比較(IC50μM)
化合物I、II、III、IV對肝癌H22小鼠移植瘤的抑制率為42.7％、35.7％、18.3％、24.3％，對肉瘤S180小鼠移植瘤的抑制率為52.3％、42.1％、22.4％、34.6％，且呈現出一定的量效關係。
二、香鱗毛蕨間苯三酚類提取物誘導腫瘤細胞的凋亡的情況1.實驗材料(1)C57BL/6小鼠50隻，雌雄各半，體重為18-22g。
(2)Lewis肺癌可移植性瘤株。
(3)化合物。
2.實驗儀器SE型Facsvantage流式細胞儀美國BeetOn Dickinson公司產品，FACS-420型。圖像分析儀同濟太陽電子公司產品，TJTY-300型。
3.實驗方法3.1實驗分組將50隻C57TBL/6小鼠每隻於右腋下接種Lewis肺癌細胞，含活細胞1.25×106個/只，接種後將動物隨機分為5組，每組10隻，雌雄各半並編號，第5天開始給藥，對照組的小鼠，每隻每日腹腔注射生理鹽水0.2ml，連用10天。其它給藥組每隻每日分別注射化合物I-IV10mg/kg，連用10天，接種腫瘤第18天，處死動物。
3.2組織處理完整分離皮下腫瘤結節，一部分新鮮組織用於流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
統計方法使用SPSS 11.5統計軟體，採用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著意義。
結果與對照組比較，化合物I、II、III、IV組細胞凋亡率差異有高度顯著性(P＜0.01)，說明化合物I、II、III、IV可明顯誘導Lewis肺癌細胞凋亡。詳見表2。
表2化合物I II、III、IV時腫瘤細胞凋亡的作用
與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.0權利要求
1.香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的應用，其特徵是在製備抗腫瘤藥物方面的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵是在製備治療S180肉瘤、Lewis肺癌或HepA肝癌藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了香鱗毛蕨間苯三酚類提取物的應用，具體是在製備抗腫瘤藥物方面的應用，尤其是在製備治療S180肉瘤、Lewis肺癌或HepA肝癌藥物方面的應用。香鱗毛蕨間苯三酚類提取物抗腫瘤活性強，可來源於天然植物資源，安全性高。對所述提取物的進一步研究有望發現選擇性高、活性強、毒副作用小、抗瘤譜廣、抗多藥耐藥性好的新型抗癌藥物，具有重要的潛在產業化開發價值以及對人類研究抗癌藥物的重大貢獻。
文檔編號A61P35/00GK101066261SQ20071002839
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月1日 優先權日2007年6月1日
發明者沈志濱, 金哲雄 申請人:廣東藥學院