高F值寡肽粗液分離純化方法與流程

2023-10-20 21:41:52 6

本發明涉及多肽分離純化技術領域，具體是一種高f值寡肽粗液分離純化方法。

背景技術：

帶魚（largeheadhairtail），別稱刀魚、牙帶魚，屬於脊索動物門、鱸形目，體型呈帶狀。主要分布於西太平洋和印度洋，在中國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊並稱為中國的四大海產。

2014年度，舟山市帶魚捕獲量達到108104噸，佔主要漁獲品種的比例達到11.52%。舟山帶魚多以新鮮或加工成各種魚製品出售，然而帶魚的開發利用依然處於粗加工階段，高附加值的利用程度較低。

帶魚的平均蛋白含量達到18.4%以上，這使得它成為豐富的蛋白質原材料來源。蛋白質經過酶解等特殊處理，可以製備具備一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我國對帶魚蛋白的研究雖然取得了一些進展，但是還未能開發出高活性的蛋白，還未能更佳充分地開發利用帶魚資源。因此，對帶魚蛋白的深入研究，開發出具備高附加值的帶魚蛋白產品成為迫在眉睫的問題。

高f值寡肽是一類由2-9個胺基酸以獨特的方式組合成的小肽混合物，其主要特徵是胺基酸混合物中支鏈胺基酸與芳香族胺基酸比值遠高於人體模式。支鏈胺基酸中的纈氨酸（val）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）具有維護神經系統正常、增加食慾、治療貧血、促進傷口痊癒等特殊的生理功能。在臨床上，高f值寡肽常用來用來治療肝性腦病，苯丙酮尿症，改善病人術後的營養狀況等。近年來，國內高f值寡肽開發方面成為功能食品的研究熱點。如以大豆、玉米、花生等植物為原料，以金槍魚、魷魚、牡蠣等水產品為原料製備的高f值寡肽。目前對於帶魚高f值寡肽的開發研究僅處在實驗室水平的探索，市面上的製成品寥寥無幾。

目前，較為流行和科學的製備高f值寡肽方法是採用雙酶分布酶解法。其主要工藝是首先通過酶解使蛋白肽鏈的芳香族胺基酸殘基位點暴露出來，然後用某些特定蛋白酶酶解切掉芳香族胺基酸，使之以游離態存在於溶液中，再用其他方法最大化去除芳香族胺基酸。製備高f寡肽的關鍵是儘可能的保留支鏈胺基酸（val、ile、leu簡稱bcaa），去除芳香族胺基酸（tyr、phe，簡稱aaa），達到bcaa/aaa的摩爾濃度比大於20。

現有技術如授權公告號為cn104004087b的中國發明專利，公開了一種水蛭高f值寡肽及其酶解製備方法與應用，製備方法包括：（1）水蛭幹體初步清洗除雜，高速粉碎；（2）原料鹼預浸泡；（3）鹼性蛋白酶alcalaseaf2.4l結合木瓜蛋白酶雙酶水解；（4）採用活性炭粉靜態吸附脫除芳香族胺基酸；（5）以凝膠過濾層析柱進一步分離純化，收集分離產物，冷凍乾燥，獲得分子量低於2000da，f值（fischerratio，即支鏈胺基酸與芳香族胺基酸摩爾含量的比值）高於20的水蛭寡肽粉。該方法製備過程簡單，選用鹼性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種商業用酶，易於工業生產，產率較高，具有一定的抗凝血效果，並為高f值類產品增加了新來源。該方法游離的芳香族胺基酸清除率不太理想，最後得到的寡肽f不是很高。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種成本低廉，操作簡單，能得到芳香族胺基酸含量低，支鏈胺基酸保留率高，即高f值的寡肽粗液分離純化方法。

本發明針對背景技術中提到的問題，採取的技術方案為：

高f值寡肽粗液分離純化方法，具體步驟為：

預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水衝洗乾淨，剪成小塊，按體積比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素e。浸泡，浸泡時間為4~8h。搗碎，過篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，去除油脂，過濾，在42~48℃環境下烘乾，得到去脂帶魚粉末；

酶解：在帶魚粉末中按體積比1:4.6~5.3加入蒸餾水，調節ph，加入胃蛋白酶和酶激活劑，胃蛋白酶酶激活劑成份及其重量份為：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份維生素b1。胃蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為1.5~2.3，酶解溫度為35-37℃，酶解時間為1.8~2.6h。酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，調節ph，加入風味蛋白酶和酶激活劑，風味酶酶激活劑成份及其重量份為：0.03~0.05份醋酸鎂和0.001~0.003份碳酸二甲酯。風味蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為6.4~7.2，酶解溫度為48~52℃，酶解時間為1.2~1.9h。酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，過濾得到高f值寡肽粗液；

超濾：將步驟2得到的酶解液超濾，超濾膜規格為4.5~5.5kda，得到濾過液。高f值寡肽通常有2-9個胺基酸殘基，平均分子量低於1.5kda，超濾可去除大分子蛋白質雜質，高f值寡肽得到純化；

活性炭脫芳：在濾過液中加入活性炭，活性炭是以優質椰子殼為原料製成的粉狀活性炭，活性炭摻雜0.2~0.45%納米氧化鋁和0.1~0.3%納米氧化鐵。攪拌，活性炭和濾過液固液比為1:18~23，ph為5.5~6.5，溫度為22~26℃，吸附時間為2.5~3.2h。離心，將上清液冷凍乾燥得到寡肽粉末。活性炭成本相對較低，在生產過程中也不會產生汙染，容易回收。由於顆粒活性炭的外表成不規則形，孔隙結構較複雜，對游離的芳香族胺基酸吸附效率較好，脫芳率較高，同時也可以起到很好的脫腥作用，有效地提高了高f值寡肽的品質；活性炭中摻雜納米氧化鋁和納米氧化鐵可增加其對游離的芳香族胺基酸的吸附率，提高寡肽f值；

凝膠層析：將sephadexg-25凝膠置於蒸餾水中浸泡，浸泡溫度為50~65℃，浸泡時間為5~6.5h。充分溶脹後倒入抽濾瓶，抽真空，期間，不斷地換水並去掉漂浮在表面的雜質、吸掉凝膠顆粒中的氣泡，直至凝膠沉澱後上清液清澈透明、未見任何懸浮物。裝柱，平衡，將寡肽粉末溶於蒸餾水，寡肽粉末：蒸餾水質量體積比為18mg：1ml~22mg：1ml，充分溶解後過0.42~0.48μm針筒式濾膜，採取壓力吸附方法上樣，待樣品剛好完全流入柱內，切換至洗脫模式，以超純水為流動相開始洗脫，流速為0.54~0.65ml/min，每1.8~2.2min收集1管。檢測每管樣品在220nm和280nm處的紫外吸收值，將樣品按峰合併收集，冷凍乾燥。sephadexg-25凝膠顆粒，對於小肽和其他小分子具有很好的分離效果，出峰峰型穩定。而且，sephade凝膠顆粒在弱酸、鹼溶液以及有機溶液中具有較好的耐熱性、穩定性，經過活化後可以重複使用，還具有一定脫鹽功能；

hplc純化：採用液相色譜儀，乙腈和超純水為洗脫液進行梯度洗脫，洗脫時間、洗脫液成份及其百分比和流速依次為：0~5min，乙腈15%，超純水85%，流速為0.45~0.52ml/min；5~15min，乙腈40%，超純水60%，流速為0.45~0.52ml/min；15~25min，乙腈80%，超純水20%，流速為0.45~0.52ml/min；25~30min，乙腈100%，流速為0.55~0.62ml/min；30~40min，乙腈40%，超純水60%，流速為0.55~0.62ml/min；40~50min，乙腈20%，超純水80%，流速為0.55~0.62ml/min。收集洗脫液，冷凍乾燥。最後得到的寡肽的f值能高達40以上。高f值寡肽粗液中含有胺基酸序列為scasvcka的高f值寡肽。

與現有技術相比，本發明的優點在於：高f值寡肽通常有2-9個胺基酸殘基，平均分子量低於1.5kda，超濾可去除大分子蛋白質雜質，高f值寡肽得到純化；活性炭成本相對較低，在生產過程中也不會產生汙染，容易回收。由於顆粒活性炭的外表成不規則形，孔隙結構較複雜，對游離的芳香族胺基酸吸附效率較好，脫芳率較高，同時也可以起到很好的脫腥作用，有效地提高了高f值寡肽的品質；活性炭中摻雜納米氧化鋁和納米氧化鐵可增加其對游離的芳香族胺基酸的吸附率，提高寡肽f值；sephadexg-25凝膠顆粒，對於小肽和其他小分子具有很好的分離效果，出峰峰型穩定。而且，sephade凝膠顆粒在弱酸、鹼溶液以及有機溶液中具有較好的耐熱性、穩定性，經過活化後可以重複使用，還具有一定脫鹽功能；hplc純化後得到的寡肽的f值能高達40以上；本發明的分離純化方法，成本低廉，操作簡單，綠色安全，適合大規模生產。

具體實施例

下面通過實施例對本發明方案作進一步說明：

實施例1：

高f值寡肽粗液分離純化方法，具體步驟為：

1）預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水衝洗乾淨，剪成小塊，按體積比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素e。浸泡，浸泡時間為4~8h。搗碎，過篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，去除油脂，過濾，在42~48℃環境下烘乾，得到去脂帶魚粉末；

2）酶解：在帶魚粉末中按體積比1:4.6~5.3加入蒸餾水，調節ph，加入胃蛋白酶和酶激活劑，胃蛋白酶酶激活劑成份及其重量份為：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份維生素b1。胃蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為1.5~2.3，酶解溫度為35-37℃，酶解時間為1.8~2.6h。酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，調節ph，加入風味蛋白酶和酶激活劑，風味酶酶激活劑成份及其重量份為：0.03~0.05份醋酸鎂和0.001~0.003份碳酸二甲酯。風味蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為6.4~7.2，酶解溫度為48~52℃，酶解時間為1.2~1.9h。酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，過濾得到高f值寡肽粗液；

3）超濾：將步驟2得到的酶解液超濾，超濾膜規格為4.5~5.5kda，得到濾過液。高f值寡肽通常有2-9個胺基酸殘基，平均分子量低於1.5kda，超濾可去除大分子蛋白質雜質，高f值寡肽得到純化；

4）活性炭脫芳：在濾過液中加入活性炭，活性炭是以優質椰子殼為原料製成的粉狀活性炭，活性炭摻雜0.2~0.45%納米氧化鋁和0.1~0.3%納米氧化鐵。攪拌，活性炭和濾過液固液比為1:18~23，ph為5.5~6.5，溫度為22~26℃，吸附時間為2.5~3.2h。離心，將上清液冷凍乾燥得到寡肽粉末。活性炭成本相對較低，在生產過程中也不會產生汙染，容易回收。由於顆粒活性炭的外表成不規則形，孔隙結構較複雜，對游離的芳香族胺基酸吸附效率較好，脫芳率較高，同時也可以起到很好的脫腥作用，有效地提高了高f值寡肽的品質；活性炭中摻雜納米氧化鋁和納米氧化鐵可增加其對游離的芳香族胺基酸的吸附率，提高寡肽f值；

5）凝膠層析：將sephadexg-25凝膠置於蒸餾水中浸泡，浸泡溫度為50~65℃，浸泡時間為5~6.5h。充分溶脹後倒入抽濾瓶，抽真空，期間，不斷地換水並去掉漂浮在表面的雜質、吸掉凝膠顆粒中的氣泡，直至凝膠沉澱後上清液清澈透明、未見任何懸浮物。裝柱，平衡，將寡肽粉末溶於蒸餾水，寡肽粉末：蒸餾水質量體積比為18mg：1ml~22mg：1ml，充分溶解後過0.42~0.48μm針筒式濾膜，採取壓力吸附方法上樣，待樣品剛好完全流入柱內，切換至洗脫模式，以超純水為流動相開始洗脫，流速為0.54~0.65ml/min，每1.8~2.2min收集1管。檢測每管樣品在220nm和280nm處的紫外吸收值，將樣品按峰合併收集，冷凍乾燥。sephadexg-25凝膠顆粒，對於小肽和其他小分子具有很好的分離效果，出峰峰型穩定。而且，sephade凝膠顆粒在弱酸、鹼溶液以及有機溶液中具有較好的耐熱性、穩定性，經過活化後可以重複使用，還具有一定脫鹽功能；

6）hplc純化：採用液相色譜儀，乙腈和超純水為洗脫液進行梯度洗脫，洗脫時間、洗脫液成份及其百分比和流速依次為：0~5min，乙腈15%，超純水85%，流速為0.45~0.52ml/min；5~15min，乙腈40%，超純水60%，流速為0.45~0.52ml/min；15~25min，乙腈80%，超純水20%，流速為0.45~0.52ml/min；25~30min，乙腈100%，流速為0.55~0.62ml/min；30~40min，乙腈40%，超純水60%，流速為0.55~0.62ml/min；40~50min，乙腈20%，超純水80%，流速為0.55~0.62ml/min。收集洗脫液，冷凍乾燥。最後得到的寡肽的f值能高達40以上。

實施例2：

高f值寡肽粗液分離純化方法，最優選步驟為：

1）預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水衝洗乾淨，剪成4cm長小塊，按體積比1:6加入去腥液，去腥液成份及其最優選重量份為：8份檸檬酸、17份紫蘇提取物、0.1份氯化鈉、0.5份碳酸氫鈉、0.001份烏索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份維生素e。浸泡，浸泡時間為7h。浸泡，浸泡時間為7h。搗碎，過40目篩，按體積比1:5加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為24h。過濾，濾渣中按體積比1:3加入去離子水，去除油脂，過濾，在45℃環境下烘乾，得到去脂帶魚粉末；

2）酶解：在帶魚粉末中按體積比1:5加入蒸餾水，調節ph，加入胃蛋白酶和酶激活劑，胃蛋白酶酶激活劑成份及其重量份為：0.003份乙酸丙酯和0.04份維生素b1。胃蛋白酶的加酶量為3%，ph為2.0，酶解溫度為36℃，酶解時間為2.2h。酶解結束後沸水浴滅酶8min，調節ph，加入風味蛋白酶和酶激活劑，風味酶酶激活劑成份及其重量份為：0.05份醋酸鎂和0.001份碳酸二甲酯。風味蛋白酶的加酶量為3%，ph為7.0，酶解溫度為50℃，酶解時間為1.7h。酶解結束後沸水浴滅酶8min，過濾得到高f值寡肽粗液；

3）超濾：將步驟2得到的酶解液超濾，超濾膜規格為5kda，得到濾過液。高f值寡肽通常有2-9個胺基酸殘基，平均分子量低於1.5kda，超濾可去除大分子蛋白質雜質，高f值寡肽得到純化；

4）活性炭脫芳：在濾過液中加入活性炭，活性炭是以優質椰子殼為原料製成的粉狀活性炭，活性炭摻雜0.32%納米氧化鋁和0.2%納米氧化鐵。攪拌，活性炭和濾過液固液比為1:20，ph為6.0，溫度為25℃，吸附時間為3h。離心，將上清液冷凍乾燥得到寡肽粉末。活性炭成本相對較低，在生產過程中也不會產生汙染，容易回收。由於顆粒活性炭的外表成不規則形，孔隙結構較複雜，對游離的芳香族胺基酸吸附效率較好，脫芳率較高，同時也可以起到很好的脫腥作用，有效地提高了高f值寡肽的品質；活性炭中摻雜納米氧化鋁和納米氧化鐵可增加其對游離的芳香族胺基酸的吸附率，提高寡肽f值；

5）凝膠層析：將sephadexg-25凝膠置於蒸餾水中浸泡，浸泡溫度為60℃，浸泡時間為6h。充分溶脹後倒入抽濾瓶，抽真空，期間，不斷地換水並去掉漂浮在表面的雜質、吸掉凝膠顆粒中的氣泡，直至凝膠沉澱後上清液清澈透明、未見任何懸浮物。裝柱，平衡，將寡肽粉末溶於蒸餾水，寡肽粉末：蒸餾水質量體積比為20mg：1ml，充分溶解後過0.45μm針筒式濾膜，採取壓力吸附方法上樣，待樣品剛好完全流入柱內，切換至洗脫模式，以超純水為流動相開始洗脫，流速為0.6ml/min，每2min收集1管。檢測每管樣品在220nm和280nm處的紫外吸收值，將樣品按峰合併收集，冷凍乾燥。sephadexg-25凝膠顆粒，對於小肽和其他小分子具有很好的分離效果，出峰峰型穩定。而且，sephade凝膠顆粒在弱酸、鹼溶液以及有機溶液中具有較好的耐熱性、穩定性，經過活化後可以重複使用，還具有一定脫鹽功能；

6）hplc純化：採用液相色譜儀，乙腈和超純水為洗脫液進行梯度洗脫，洗脫時間、洗脫液成份及其百分比和流速依次為：0~5min，乙腈15%，超純水85%，流速為0.5ml/min；5~15min，乙腈40%，超純水60%，流速為0.5ml/min；15~25min，乙腈80%，超純水20%，流速為0.5ml/min；25~30min，乙腈100%，流速為0.6ml/min；30~40min，乙腈40%，超純水60%，流速為0.6ml/min；40~50min，乙腈20%，超純水80%，流速為0.6ml/min。收集洗脫液，冷凍乾燥。最後得到的寡肽的f值能高達40以上。

本發明的操作步驟中的常規操作為本領域技術人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發明的技術方案進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發明的具體實施例，並不用於限制本發明，凡在本發明的原則範圍內所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

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浙江海洋大學

高f值寡肽粗液分離純化方法

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人工合成

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