蛋白質測定方法、蛋白質測定用指示劑及蛋白質測定用試驗片的製作方法

2023-10-20 20:34:07

專利名稱：蛋白質測定方法、蛋白質測定用指示劑及蛋白質測定用試驗片的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於測定含蛋白質試樣(例如血液和尿等體液、含蛋白質飲料、工廠廢水)中存在的蛋白質的技術。

背景技術：
測定生物體試樣中的蛋白質，在病理學的診斷方面是重要的。例如，在肝臟功能低下的情況下，血清白蛋白量下降，而另一方面，在腎炎、腎變病綜合症、結石、腫瘤等的腎-尿路疾病、循環系統及中樞神經系統的疾病等的情況下，尿中的蛋白質的量增加。因而，測定白蛋白等蛋白質，在這些疾病的診斷中可以成為重要的指標。
在蛋白質測定的領域中，已知使用蛋白質誤差指示劑的簡便的測定方法。在該測定方法中，作為蛋白質誤差指示劑，例如使用著四溴酚藍(TBPB)，如果舉一個例子，使用TBPB的尿試紙，作為一次性篩選用被廣泛地使用著。當存在蛋白質時，在pH3附近，TBPB的酚性羥基就會解離，從黃色變為藍色，因此就可以檢測出蛋白質。
但是，將TBPB作為指示劑使用的試紙，因為對於臨床必須的10～20mg/dL的低濃度蛋白質的檢測靈敏度不夠，所以有時不能正確地檢測蛋白質。例如，在與色表比較而進行的目測判斷中，因為陰性蛋白質與痕跡蛋白質的顏色相近，所以難以區別而判斷有困難。另一方面，即使在使用尿試紙的測定裝置時，因為TBPB的靈敏度低，而經常有判斷錯誤的情況。
為此希望有可以以更高靈敏度定量地測定低濃度蛋白質的技術，特別希望開發出TBPB以外的新型指示劑。


發明內容
本發明者對用於以高靈敏度測定低濃度蛋白質的指示劑進行了篩選，結果發現將特定的滷化氧雜蒽類色素作為目的指示劑是合適的，從而完成了本發明。
即，本發明提供一種具有用下述化學式(1)表示的化學結構的蛋白質測定用指示劑、使用該蛋白質測定用指示劑的蛋白質測定方法和蛋白質測定用試驗片。

在化學式(1)中，X1是滷素、硝基或亞硝基，X2是滷素，X3是滷素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。在本發明中，作為蛋白質測定用指示劑，在化學式(1)中，優選為，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫，最優選為，X1與X2是碘或溴，X3是氯。作為X4及X5中的鹽來說，典型的可以列舉Na鹽。
作為本發明的蛋白質測定用指示劑來說，典型的可以列舉下述化學式(1)-1～(1)-5所表示的指示劑。其中，特別優選下述化學式(1)-1及(1)-2所表示的蛋白質測定用指示劑。



這些滷化氧雜蒽類色素，在該色素的pKa以下的pH中，如果沒有蛋白質共存，是無色～淡橙色，而如果有蛋白質共存，就變色為紅～紫色。因此，如果與如TBPB那樣從黃色變為藍色的情況相比，因為原來的顏色是無色～淡色，所以容易檢測顏色的變化。因此，如果使用上述的滷化氧雜蒽類色素，不論是目測判斷、或是使用測定裝置判斷，都變得可以適當地檢測低濃度蛋白質。
本發明的蛋白質定量用試驗片，可以使吸收性載體浸入含有上述滷化氧雜蒽類色素、緩衝劑、增感劑等的含浸液中，通過使其乾燥來製造。試驗片可以直接使用，也可以粘接於非吸收體上來使用。
含浸液中的滷化氧雜蒽類色素的濃度，沒有特別的限制，典型的是0.1～10mM，優選的是0.5～2mM。
含浸液的pH值，例如比本申請的滷化氧雜蒽類色素的pKa值稍稍低的值即取為1.5～4.5，優選的是2.0～3.5。
作為緩衝劑來說，在pH1.5～4.5的範圍中，具有良好的緩衝能力，只要是不阻礙滷化氧雜蒽類色素與蛋白質的反應的物質，什麼物質都可以。作為緩衝劑來說，可以使用例如甘氨酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、琥珀酸緩衝液、蘋果酸緩衝液或酒石酸緩衝液。含浸液中的緩衝劑濃度，沒有特別的限制，典型的是0.1～1.5M、優選0.3～1M。
作為增感劑來說，可以使用例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚碳酸酯或聚乙烯醚，優選使用聚乙二醇或聚丙二醇。含浸液中的增感劑的濃度，沒有特定的限制，典型的是0.05～5wt％、優選為0.1～1wt％。
作為吸收性載體來說，可以使用不含蛋白質成分的多孔性物質，例如可以使用片狀或膜狀形態的材料。作為多孔性物質來說，可以列舉例如紙狀物、泡沫(發泡體)、織布狀物、無紡布狀物與編織狀物。作為用於形成吸收性載體的材料來說，可以列舉例如棉、麻、纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、石棉、玻璃纖維、二氧化矽纖維、碳纖維、硼纖維、聚醯胺、芳族聚醯胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、再生纖維素(人造絲)、聚酯、尼龍、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚烯烴。這些吸收性載體的形狀，沒有特別的限定，通常是矩形、長方形、圓形或橢圓形。
作為非吸收體來說，可以使用例如片狀或膜狀形態的非吸收體。作為用於形成非吸收體的材料來說，可以列舉例如聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯與聚苯乙烯。

具體實施例方式 實施例 (實施例1) 在本實施例中，對能夠檢出低濃度蛋白質的指示劑進行了篩選。篩選是如下這樣進行的，即，在篩選液中添加對象化合物，使其成為0.5mM，通過目測其發色性進行觀察。作為篩選液來說，使用了在0.7M蘋果酸緩衝液(pH2.2)中溶解了白蛋白15mg/dL、聚乙二醇0.5wt％這樣的溶液。作為對象化合物來說，使用了市場銷售的各種色素。其結果是，對於下述化學式(2)-1～(2)-5所示的5種化合物，看到良好的發色。關於這些化合物的銷售廠商，如表1所示。



表1 化學式編號商品名製造廠商(2)-1 フロキシンB 東京化成株式會社(2)-2 ロ一ズベンガル 東京化成株式會社(2)-3 エリスロシンB 東京化成株式會社(2)-4 エオシンY 和光純薬工業株式會社(2)-5 エオシンB 東京化成株式會社 (實施例2) 在本實施例中，評價了篩選過的指示劑的靈敏度。靈敏度是通過分別測定使白蛋白濃度為0.3mg/dL(陰性)或15mg/dL(陽性)的尿含浸於試驗片之後的反射率來進行。試驗片是通過將表2所示的組成的含浸液含浸於濾紙(Whatman社製「3MMChr」)之後再使其乾燥而形成。使用色差計測定了反射率。各樣品的測定結果，示於表3中。在表3中，也同時表示各樣品的測定波長。
表2指示劑緩衝液 增感劑 溶劑 樣品1 フロキシンB (0.5mM)蘋果酸緩衝液0.7M(pH2.2) 聚乙二醇 0.5wt％ 乙醇 (40wt％) 樣品2 フロキシンB (0.5mM)蘋果酸緩衝液0.7M(pH2.2) 無 乙醇 (40wt％) 樣品3 ロ一ズベンガル (0.5mM)蘋果酸緩衝液0.7M(pH2.6) 聚丙二醇 0.5wt％ 乙醇 (40wt％) 樣品4 ロ一ズベンガル (0.5mM)蘋果酸緩衝液0.7M(pH2.6) 無 乙醇 (40wt％) 樣品5 TBPB(0.5mM)蘋果酸緩衝液0.7M(pH3.4) 聚乙二醇 0.5wt％ 乙醇 (30wt％) 樣品6 TBPB(0.5mM)蘋果酸緩衝液0.7M(pH3.4) 無 乙醇 (30wt％) 注TBPB＝四溴酚藍 表3
由表3可知，使用化學式(2)-1所示的フロキシンB作為指示劑的樣品1、2和使用化學式(2)-2所示的ロ一ズベンガル作為指示劑的樣品3、4，與使用TBPB作為指示劑的樣品5、6相比，白蛋白濃度為0.3mg/dL(陰性)時的反射率大，白蛋白濃度為15mg/dL(陽性)時的反射率小。也就是說，フロキシンB或ロ一ズベンガル在這些pH條件下，因為是無色的，所以與TBPB相比，非發色時(陰性)的光吸收量少，其反面，發色時(陽性)的光吸收量變大。因此，フロキシンB或ロ一ズベンガル在陰性的尿與陽性的尿的反射率的差分

大，該差分

就成為TBPB的兩倍。因此可以說，フロキシンB或ロ一ズベンガル，針對フロキシンB的靈敏度高，即使白蛋白的濃度是10～20mg/dL左右的低濃度，也能夠適當地檢出白蛋白。
本發明人還對各樣品是否能目測判定作了進一步的研究。其結果是，使用フロキシンB或ロ一ズベンガル的樣品1～4，在白蛋白濃度為15mg/dL時，從無色發色為紅色，可以容易確認其發色(陽性)。與此相對，使用TBPB作為指示劑的樣品5、6，在白蛋白濃度為15mg/dL時，與陰性時的黃色幾乎沒有差別，以目測檢出有無發色是困難的。這樣，在使用フロキシンB或ロ一ズベンガル作為指示劑時，即使是白蛋白濃度低的情況下，也可以由目測容易地檢出白蛋白。
另外，實施例2中的實驗結果是關於尿樣的，但本發明不限於尿，也可以適用於定量測定含有蛋白質的各種試樣例如血液、含蛋白質飲料、工廠廢水中的蛋白質的情況。
權利要求
1.一種蛋白質測定方法，它是使用蛋白質測定用指示劑來測定蛋白質的方法，其特徵在於
作為蛋白質測定用指示劑，使用具有用下述化學式(1)表示的化學結構的物質，
在化學式(1)中，X1是滷素、硝基或亞硝基，X2是滷素，X3是滷素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
2.如權利要求1所述的蛋白質測定方法，其特徵在於在所述化學式(1)中，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫。
3.如權利要求2所述的蛋白質測定方法，其特徵在於在所述化學式(1)中，X1和X2是碘或溴，X3是氯。
4.如權利要求3所述的蛋白質測定方法，其特徵在於作為所述蛋白質指示劑，使用選自下述化學式(1)-1～(1)-5中的至少一種，
5.如權利要求1所述的蛋白質測定方法，其特徵在於
所述蛋白質指示劑，在該蛋白質指示劑的pKa以下的pH中，在不共存蛋白質時，呈現無色～淡橙色，而在共存蛋白質時，呈現紅～紫色。
6.如權利要求1所述的蛋白質測定方法，其特徵在於所述蛋白質是白蛋白。
7.如權利要求6所述的蛋白質測定方法，其特徵在於在白蛋白濃度處於10～20mg/dL範圍的含白蛋白試樣中，測定白蛋白濃度。
8.一種蛋白質測定用指示劑，它是用於測定蛋白質的指示劑，其特徵在於具有用下述化學式(2)表示的化學結構，
在化學式(2)中，X1是滷素、硝基或亞硝基，X2是滷素，X3是滷素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
9.如權利要求8所述的蛋白質測定用指示劑，其特徵在於在所述化學式(2)中，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫。
10.如權利要求9所述的蛋白質測定用指示劑，其特徵在於在所述化學式(2)中，X1及X2是碘或溴，X3是氯。
11.如權利要求8所述的蛋白質測定用指示劑，其特徵在於具有由下述化學式(2)-1～(2)-5中的任一個表示的化學結構，
12.如權利要求8所述的蛋白質測定用指示劑，其特徵在於在pKa以下的pH中，在共存蛋白質時呈現無色～淡橙色，而在共存蛋白質時呈現紅～紫色。
13.一種蛋白質測定用試驗片，它是用於定量或半定量地測定蛋白質的試驗片，其特徵在於作為蛋白質定量指示劑，使用具有用下述化學式(3)表示的化學結構的物質，
在化學式(3)中，X1是滷素、硝基或亞硝基，X2是滷素，X3是滷素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
14.如權利要求13所述的蛋白質測定用試驗片，其特徵在於在所述化學式(3)中，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫。
15.如權利要求13所述的蛋白質測定用試驗片，其特徵在於在所述化學式(3)中，X1及X2是碘或溴，X3是氯。
16.如權利要求13所述的蛋白質測定用試驗片，其特徵在於作為所述蛋白質指示劑，使用選自下述化學式(3)-1～(3)-5中的至少一種，
17.如權利要求13所述的蛋白質測定用試驗片，其特徵在於所述蛋白質指示劑，在該蛋白質指示劑的pKa以下的pH中，在共存蛋白質時呈現無色～淡橙色，而在不共存蛋白質時呈現紅～紫色。
18.如權利要求13所述的蛋白質測定用試驗片，其特徵在於還含有用於提高針對蛋白質的發色靈敏度的增感劑。
19.如權利要求18所述的蛋白質測定用試驗片，其特徵在於作為所述增感劑，含有聚乙二醇和聚丙二醇之中的至少一個。
全文摘要
本發明涉及測定蛋白質的技術。在本發明中，作為蛋白質測定用指示劑，使用具有用下述化學式(1)表示的化學結構的物質。在化學式(1)中，X1是滷素、硝基或亞硝基，X2是滷素，X3是滷素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
文檔編號G01N33/68GK1675553SQ03819039
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月4日 優先權日2002年8月9日
發明者小坂秀子 申請人:愛科來株式會社