一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液及製作方法
2023-10-20 14:39:57 2
一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液及製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液，包括下列質量份的原料組成：三羥甲基氨基甲烷20~26，檸檬酸三鈉10~15，果糖7~15，蒸餾水700~800，新鮮卵黃230~260，亞硒酸鈉0.125~0.375，維生素E2~32，甘油90-95，注射用青黴素鉀（規格為160萬單位/g）1~2、注射用硫酸鏈黴素（規格為100萬單位/g）1~2。製備方法包括製備基礎緩衝液、製備基礎稀釋液、製備精液稀釋液，然後將製備好的精液稀釋液移至4℃條件下平衡5-20min，製得抗氧化的牛冷凍精液稀釋液。本發明較現有技術的牛冷凍精液稀釋液的精子活率提高了24.56個百分點，4h精子活率提高了12.39個百分點，精子頂體完整率提高了38.72個百分點，GSH－PX的活性提高了260%，精子畸形率則下降了5.49個百分點。
【專利說明】一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液及製作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於動物冷凍精液生產技術，具體涉及到一種添加微量元素硒和維生素E的冷凍精稀釋液的製作方法。
【背景技術】
[0002]牛的繁殖是養牛生產過程中的一個重要環節，牛群數量的增加、質量的提高都必須通過繁殖這一過程來實現。人工授精與胚胎移植技術是養牛業生產中兩次重大技術革命，能夠充分發揮優秀種公牛和母牛的繁殖潛力，顯示出很好的應用前景。人工授精與胚胎移植技術應用的前提是牛精液的保存技術的應用。精液冷凍保存的成功是人工授精技術上的一項重大革新，它不但解決了精液長期保存的問題，使精液的應用不受時間、地域和種畜生命的限制，而且提高優良公畜的利用率，加快品種的育成和改良的步伐。牛作為畜牧業生產中自然繁殖率最低的主要畜種之一，應用人工授精與胚胎移植技術提高牛繁殖力的意義更加重大。
種公牛精液在冷凍保存時，精清對精子的保護能力是有限的，因此，進行精液的冷凍保存就要配合使用稀釋液，來最大程度的保護精子，因而稀釋液在精液冷凍保存中突顯其重要性，成為保證精液品質的主要因素。人工授精已是一門成熟的技術，但使用冷凍精液進行人工授精時，其受精效果比使用新鮮精液的效果較低，其原因在於新鮮精液在製作冷凍精液時，在其冷凍和解凍時精子的質量變化，是影響人工授精成功的重要因素。
[0003]現有的冷凍精液稀釋液通常是加入稀釋劑、營養劑、抗菌、抗凍、防休克和緩衝保護劑等，而對精液在冷凍和解凍過程中的能抗氧化損傷的物質，則局限在維生素E、維生素C和穀胱甘肽等物質上，由於抗氧化損傷能力不足，降低了解凍後的活率、生存率和頂體完整率等，降低了精液質量。
【發明內容】
[0004]本發明是針對現有冷凍精液稀釋液的抗氧化能力不足的現狀，提供一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液，它是在冷凍精液稀釋液常用的組成成分的基礎上，添加了一定濃度的微量元素硒和維生素E，提高了冷凍精液稀釋液的抗氧化能力，提高了精子活力與頂體完整率，延長了精子生存時間，提高了冷凍精液質量的目的。本發明的另一目的是提供抗氧化的牛冷凍精液稀釋液的製作方法。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的。
[0006]本發明的抗氧化的牛冷凍精液稀釋液，包括下列質量份的原料組成:三羥甲基氨基甲烷20~26，檸檬酸三鈉10~15，果糖7~15，蒸餾水700~800，新鮮卵黃230~260，亞硒酸鈉
0.125~0.375，維生素E2~32，甘油90-95，注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g)1~ 2、注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g) 1~2.
[0007] 本發明的抗氧化的牛冷凍精液稀釋液製備方法，包括如下步驟:
(I)製備基礎緩衝液稱取20-26份三羥甲基氨基甲烷、10-15份檸檬酸三鈉、7~15份果糖混合均勻後，加入700^800份蒸餾水中攪拌均勻，備用:
(2)製備基礎稀釋液稱取230-260份新鮮卵黃與(I)製備的基礎緩衝液均勻混合，再加入1-2份的注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g)和2份注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g)，攪拌均勻，備用；
(3)製備精液稀釋液稱取0.125、.375份的亞硒酸鈉、2~32份的維生素E加入(2)製備好的基礎稀釋液中，攪拌均勻後再稱取90-95份甘油加入基礎稀釋液，混合均勻，備用；
(4)將(3)製備好的精液稀釋液移至4°C條件下平衡5-20min，製得抗氧化的牛冷凍精液稀釋液。
[0008]本發明的抗氧化的牛冷凍精液稀釋液，優選下列質量份的原料組成:三羥甲基氨基甲烷22-24份，檸檬酸三鈉12-13份，果糖10-12份，蒸餾水750-780份，新鮮卵黃240-250份，亞硒酸鈉0.25-0.3份，維生素E20-25份，甘油92-94份，注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g) 1.5-2份、注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g) 1-1.5份。
[0009]本發明的抗氧化的牛冷凍精液稀釋液製備方法，包括如下步驟:
(1)製備基礎緩衝液取22~24份三羥甲基氨基甲烷、12~13份檸檬酸三鈉、10-12份果糖混合均勻後，加入750^780份蒸餾水中攪拌均勻，備用:
(2)製備基礎稀釋液取240-250份新鮮卵黃與(I)製備的基礎緩衝液均勻混合，再加入1.5^2份的注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g)和f 1.5份注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g)，攪拌均勻，備用；
(3)製備精液稀釋液取0.25、.3份的亞硒酸鈉、20-25份的維生素E加入(2)製備好的基礎稀釋液中，攪拌均勻後再取92-94份甘油加入基礎稀釋液，混合均勻，備用；
(4)將(3)製備好的精液稀釋液移至4°C條件下平衡5-20min，製得抗氧化的牛冷凍精液稀釋液。
[0010]牛的精子是一個高度分化、具有活動性並含有遺傳物質的細胞，精子質膜表面有脂蛋白性質的薄膜。頭部主要由細胞核組成，其中主要含核蛋白與DNA、RNA等組成。核的前面被頂體覆蓋。頂體是一個雙層的薄膜囊，內含有精子中性蛋白酶、透明質酸酶等，這些酶都與受精有關。頂體相當不穩定，容易變性和從頭部脫落，會使精子的受精能力降低或完全散失。在製取冷凍精液時必須要對精液進行冷凍，而在使用冷凍精液時則必須要解凍冷凍精液。精子在冷凍和解凍過程中產生大量活性氧(R0S)，活性氧可以氧化不飽和脂肪酸。精子膜和精子中的線粒體膜上富含不飽和脂肪酸，對脂質過氧化非常敏感，過量的活性氧和膜磷脂過氧化可導致凍存精子活力降低。具體表現為精子尾部中段和主段胞膜破裂，軸絲外露，線粒體異常。線粒體為能源物質氧化代謝釋放三磷酸腺苷(ATP)的場所，其結構出現異常勢必導致功能異常，從而引起稀釋液中的能源物質的代謝受阻，ATP產生不足，這樣精子的運動受到影響，最終精子遊向卵子衝破卵膜的能力降低，無法完成正常的受精過程。所以冷凍精液品質下降，用凍精配種，受胎率不高且很不穩定。
[0011]活性氧屬於自由基，自由基是在體內代謝過程中產生的。精子內適宜數量的自由基對精子是無害的，它們參與著信號傳遞等過程。一旦自由基超出本身的清除能力，會造成機體氧化損傷。自由基對精子的損害主要使脂質過氧化而破壞細胞膜和內膜系統，精子質膜遭受自由基的攻擊就會失去彈性，對蛋白質巰基、甲硫基或色氨酸殘基反應，導致蛋白質分子聚合或交聯，導致蛋白質功能或酶活性的喪失；破壞核酸結構，攻擊嘌呤與嘧啶鹼基，導致鹼基的改變和丟失，使基因表達異常，出現突變，從而引起精子發生系統性紊亂，出現衰老。精子本生具有平衡自由基和清除多餘自由基的能力，精子內自由基清除系統包括酶類組成的第一道防線:如超氧化物歧化酶(SOD)，穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px),第二道防線由低分子清除劑組成:如輔酶Qltl、穀胱甘肽、維生素E、胡蘿蔔素、半胱氨酸，第三道防線是利用DNA和蛋白質的修復、蛋白質疏基的還原、粘I旲ATP的恢復及細胞內鈣尚子的減少來拮抗自由基。
[0012]本發明在牛冷凍精液稀釋液，除常規應用的組分外，添加了一定濃度的微量元素硒。
[0013]硒是穀胱甘肽過氧化物酶等若干抗氧化酶的必需成分，它通過消除精子質膜和線粒體膜上已經產生的脂質過氧化物，阻斷活性氧和自由基的致病作用。
[0014]本發明在牛冷凍精液稀釋液中還添加了維生素E。維生素E是體內重要的脂溶性阻斷型抗氧化劑，精子質膜中脂類的過氧化反應是自由基的連鎖反應，其後果是使自由基不斷增多，過氧化反應不斷加快，最終使脂肪酸鏈斷裂而破壞精子質膜、內膜結構。維生素E能捕捉自由基使其苯並吡喃環上酚基失去一個氫原子而形成生育酚自由基，然後與另一自由基進一步反應形成非自由基產物生育鯤，而防止了脂類鏈反應的連續進行，保護了精子質膜與內膜。維生素E與自由基反應後，自己本身被氧化成生育酚羥自由基，即氧化型維生素E。
[0015]硒與維生素E同是抗氧化劑，但其存在部位和作用方式不同，維生素E存在於細胞膜內，通過與游離脂肪根結合，制止脂肪酸代謝中產生過氧化物，防止其對脂質膜的損害。硒存在於細胞液中，當維生素E不能完全阻止過多的不飽和脂肪酸所形成的過氧化物時，硒能通過增強GSH-PX 的活性，發揮破壞過氧化物的作用，兩者不能代替。有資料證明硒和維生素E協同在提高機體抗體水平及防治自由基對機體侵害方面所發揮的作用大於兩者分別作用之和。當硒和維生素E添加量不適宜時，尤其是硒的抗氧化需要量與中毒極限量之間差異不大，易造成硒過量中毒，因此，本發明的亞硒酸鈉的用量是經過多年的研究得到的參數。
[0016]本發明抗氧化的牛冷凍精液稀釋液與現有技術比較試驗 1.試驗方法
1.1設4個處理以牛冷凍精液稀釋液的常規應用組分(即三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸三鈉、果糖、蒸餾水、新鮮卵黃、甘油、注射用青黴素鉀和注射用硫酸鏈黴素)為對照1，在對照組分基礎上添加維生素E為對照2，添加亞硒酸鈉為對照3，添加維生素E和亞硒酸鈉為本發明組。上述組分的質量份分別是:三羥甲基氨基甲烷24，檸檬酸三鈉12，果糖10，蒸餾水750，新鮮卵黃250，甘油90，注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g) 1，注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g) 1，維生素E20,亞硒酸鈉0.25。
[0017]1.2每組隨機抽取4頭種公牛組成，採精後的原精液按照常規方法稀釋、平衡、分裝等製成冷凍精液。
[0018]1.3 4個處理的牛冷凍精液稀釋液製備方法同
【發明內容】
已經描述的步驟，只是各個處理的原料組分不同。
[0019]1.4精液品質的測定
1.4.1精子活率和存活時間的檢查:解凍後精液立即檢查活率，然後37°C恆溫箱保存4h後檢查活率(存活時間)。
[0020]1.4.2精子頂體完整率檢查:採用國標法測定。
[0021]1.4.3精子畸形率的檢查:採用國標法測定。
[0022]1.4.4對精子質膜的完整性檢查:低滲膨脹法(HOST)。
[0023]2.統計分析
試驗數據應用SAS9.0統計分析軟體的方差分析和Duncan氏法進行比較。
[0024]3.試驗結果 試驗結果見表1。
[0025]表1本發明組與對照組冷凍精液稀釋液對精液品質的影響
【權利要求】
1.一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液，其特徵在於，抗氧化的牛冷凍精液稀釋液包括下列質量份的原料組成:三羥甲基氨基甲烷20~26，檸檬酸三鈉10-15，果糖疒15，蒸餾水700~800，新鮮卵黃230~260，亞硒酸鈉0.125~0.375，維生素Ε2~32，甘油90-95，注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g) f 2、注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g) 1-2 ； 抗氧化的牛冷凍精液稀釋液製備方法，包括如下步驟: (1)製備基礎緩衝液取20-26份三羥甲基氨基甲烷、10-15份檸檬酸三鈉、7~15份果糖混合均勻後，加入700^800份蒸餾水中攪拌均勻，備用: (2)製備基礎稀釋液取230-260份新鮮卵黃與(I)製備的基礎緩衝液均勻混合，再加入1-2份的注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g)和2份注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g)，攪拌均勻，備用； (3)製備精液稀釋液取0.125、.375份的亞硒酸鈉、2~32份的維生素E加入(2)製備好的基礎稀釋液中，攪拌均勻後再取90-95份甘油加入基礎稀釋液，混合均勻，備用； (4)將(3)製備好的精液稀釋液移至4°C條件下平衡5-20min，製得抗氧化的牛冷凍精液稀釋液。
2.一種抗氧化的牛冷凍精液稀釋液，其特徵在於，抗氧化的牛冷凍精液稀釋液包括下列質量份的原料組成:三羥甲基氨基甲烷22-24份，檸檬酸三鈉12-13份，果糖10-12份，蒸餾水750-780份，新鮮卵黃240-250份，亞硒酸鈉0.25-0.3份，維生素E20-25份，甘油92-94份，注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g) 1.5-2份、注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位 /g) 1-1.5 份； 抗氧化的牛冷凍精液稀釋液製備方法，包括如下步驟: (1)製備基礎緩衝液取22~24份三羥甲基氨基甲烷、12~13份檸檬酸三鈉、10-12份果糖混合均勻後，加入750^780份蒸餾水中攪拌均勻，備用: (2)製備基礎稀釋液取240-250份新鮮卵黃與(I)製備的基礎緩衝液均勻混合，再加入1.5^2份的注射用青黴素鉀(規格為160萬單位/g)和f 1.5份注射用硫酸鏈黴素(規格為100萬單位/g)，攪拌均勻，備用； (3)製備精液稀釋液取0.25、.3份的亞硒酸鈉、20-25份的維生素E加入(2)製備好的基礎稀釋液中，攪拌均勻後再取92-94份甘油加入基礎稀釋液，混合均勻，備用； (4)將(3)製備好的精液稀釋液移至4°C條件下平衡5-20min，製得抗氧化的牛冷凍精液稀釋液。
【文檔編號】A01N1/02GK104012520SQ201410218772
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】白元生, 張拴林, 楊子森, 劉曉妮, 師周戈, 趙宇瓊 申請人:山西省生態畜牧產業管理站