胺基酸與肉毒鹼串聯質譜法檢測試劑盒的製作方法
2023-10-18 01:59:14 2
專利名稱：胺基酸與肉毒鹼串聯質譜法檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型屬生物化學技術領域，涉及胺基酸與肉毒鹼定量檢測試劑盒，具體涉 及一種串聯質譜檢測先天代謝性疾病患兒血液樣本中胺基酸與肉毒鹼的試劑盒。
背景技術：
胺基酸和肉毒鹼是參與人體生理代謝的重要物質，這類物質在人體內正常代謝保 持一定的水平。這類物質的濃度改變往往提示人體代謝途徑發生異常。通過檢測這些物質 的濃度，結合臨床表現，幫助臨床疾病的判斷。串聯質譜定量技術的基本原理利用同位素取代的方法，將待分析物(包括氨基 酸和肉毒鹼)中的氫原子、碳原子或氮原子用氘原子或碳13原子置換，形成與待分析物分 子結構一致而分子量相差1-9的標準物質。標準物質與樣品中的待分析物一起被送入到串 聯質譜儀中被檢測到。被分析物的濃度與通過串聯質譜檢測到的離子豐度成正比。而高分 辨的串聯質譜又可以將相差1-9個質子大小的分子區分開。根據已知濃度的內標準品的離 子豐度和被分析物的離子豐度，就可以得到被分析物的濃度。先天代謝性疾病是由於先天代謝的酶缺乏而導致。這些先天代謝異常疾病通常在 出生後會有一段時間的無症狀期，之後會出現急性症狀(如嘔吐、昏迷、肝衰竭)或其它症 狀。先天代謝性疾病種類多，缺乏特異性臨床症狀及早期可靠的實驗室指標，早期診 斷十分困難。目前尚無有效的手段進行早期確診。串聯質譜檢測是近幾年興起的技術，具 有準確性高、重現性好等特點，已廣泛用於蛋白分子結構研究、生物小分子定性定量檢測等 諸多領域，在檢測與應用領域是目前的研究熱點之一。建立快速可靠的篩查和診斷新生兒先天代謝性疾病的新方法已成為可能並被嘗
試o
發明內容本實用新型的目的是提供胺基酸與肉毒鹼串聯質譜法檢測試劑盒，該試劑盒由氨 基酸和肉毒鹼同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液、流動相、96孔反應板、包裝盒 體、襯墊和操作說明書組成，襯墊設有容器孔，分別放置同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶 液、復溶液和流動相，96孔反應板單獨排列放置。其中胺基酸和肉毒鹼同位素標準品含有12種胺基酸和8種肉毒鹼，衍生化溶液含 丁醇，萃取溶液含甲醇和水，復溶液含乙腈和水，流動相含乙腈、水或甲酸。所有溶液必須用 0. 22 iim膜過濾預處理。其中胺基酸內標準品為 肉毒鹼內標準品為 本試劑保存於2-8°C。本實用新型試劑盒使用方法一、幹血片的製作新生兒在出生後餵飽母乳48小時後進行血樣採集。用穿刺針 進行足跟採血，滴在S&S 903濾紙片上，讓血液均勻擴散，並在室溫下風乾4小時以上，及時 送檢，如不能及時送檢，套入有封口的塑膠袋內密封后放2-8°C冰箱保存。二、實驗操作內標標準萃取工作溶液準備依據本次實驗標本量計算內標標準萃取工作溶液的量，按1 200濃度將濃縮的內標標準用萃取溶液稀釋，注意充分混勻。萃取用打孔器從血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相應孔的位置，用多孔移 液器或連續移液器以90 y L/孔，加入預先配製好的含內標萃取溶液。封上粘性膜進行恆溫 振蕩，溫度設定為30°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩30分鐘。每孔取60 y L轉移到V型96 孔微孔板對應的孔內，放96孔氮氣吹乾儀上進行吹乾，條件設定上部45°C，流量50L/min， 下部45°C，流量25L/min ；時間為10-15分鐘。衍生目測V型底微孔板已經吹乾，每孔加50 ii L的衍生化試劑3N-HCl-n-Butan0l。封 上熱封膜恆溫靜置，溫度設定為60°C，放置30分鐘。揭去熱封膜，放96孔氮氣吹乾儀上進 行吹乾，條件設定上部45°C，流量50L/min，下部45°C，流量25L/min ；時間為10-15分鐘。復溶取出完全吹乾的V型底微孔板，每孔加入75 y L的復溶液，用鋁膜包起，恆溫振蕩， 溫度設定為27°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩10分鐘。三、上機測定。四、定量結果報告根據儀器設定程序自動得到各種胺基酸和肉毒鹼的濃度。本實用新型的有益之處是該試劑盒運用串聯質譜方法實現了一次測定能對幾十 種物質的定性和定量分析。有效地解決了以往一次測定只得到一種分析物的問題，對多種 代謝性疾病進行聯合篩查檢測，提高了篩查檢測的效率和檢出率，為代謝性疾病的早期檢 測提供依據。
圖1為本實用新型的結構示意圖。圖2為苯丙氨尿症患者質譜分析圖譜。圖3為正常人的質譜分析圖譜。圖4為丙酸血症患者質譜分析圖譜。[0034]圖5為正常人的質譜分析圖譜。圖6為楓糖尿症患者質譜分析圖譜。圖7為正常人的質譜分析圖譜。
具體實施方式
本實用新型結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用於 說明目的，而不用於限制本實用新型範圍。實施例1參見圖1，試劑盒由胺基酸和肉毒鹼同位素標準品1、衍生化溶液2、萃取溶液3、復 溶液4、流動相5、96孔反應板6、包裝盒體7、襯墊8和操作說明書9組成，襯墊8設有容器 孔，分別放置同位素標準品1、衍生化溶液2、萃取溶液3、復溶液4和流動相5，96孔反應板 6單獨排列放置。本試劑盒保存於2-8°C。其中胺基酸和肉毒鹼同位素標準品含有12種胺基酸和8種肉毒鹼，衍生化溶液含 丁醇，萃取溶液含甲醇和水，復溶液含乙腈和水，流動相含乙腈、水或甲酸。所有溶液必須用 0. 22 iim膜過濾預處理。胺基酸內標準品為 肉毒鹼內標準品為 實施例2應用實施例1試劑盒對5000餘例新生兒血樣標本進行檢測。累計檢測出苯丙酮 尿症患兒4例，丙酸血症患兒2例，楓糖尿症患兒2例。苯丙酮尿症患兒及正常人的質譜分 析圖譜結果分別參見圖2、3，丙酸血症患兒及正常人的質譜分析圖譜結果分別參見圖4、5， 楓糖尿症患兒及正常人的質譜分析圖譜結果分別參見圖6、7。試劑材料實施例1所描述試劑盒(960T)；標本全省收集的新生兒血斑；檢測方法1.按1 :200濃度將濃縮的內標標準用萃取溶液稀釋；2.用打孔器從血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相應孔的位置，用多孔 移液器或連續移液器以90 u L/孔，加入預先配製好的含內標萃取溶液。封上粘性膜進行恆 溫振蕩，溫度設定為30°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩30分鐘。每孔取60 y L轉移到V型 96孔微孔板對應的孔內，放96孔氮氣吹乾儀上進行吹乾，條件設定上部45°C，流量50L/ min，下部45°C，流量25L/min ；時間為10-15分鐘；3.目測V型底微孔板已經吹乾，每孔加50 ii L的衍生化試劑3N-HCl-n-Butan0l。 封上熱封膜恆溫靜置，溫度設定為60°C，放置30分鐘。揭去熱封膜，放96孔氮氣吹乾儀上 進行吹乾，條件設定上部45°C，流量50L/min，下部45°C，流量25L/min ；時間為10-15分 鍾；4.取出完全吹乾的V型底微孔板，每孔加入75 y L的復溶液，用鋁膜包起，恆溫振 蕩，溫度設定為27°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩10分鐘；5.上機測定，根據儀器設定程序自動得到各種胺基酸和肉毒鹼的濃度。[0055]圖2和圖3中，代表苯丙氨酸的峰與代表苯丙氨酸內標準品的峰分別表示的是樣 本中的苯丙氨酸和苯丙氨酸內標準品的離子豐度，與他們的濃度成正比。在正常人圖譜中， 樣本的苯丙氨酸與內標準品相比其濃度低，在正常範圍內；在本丙酮尿症患者的圖譜中，樣 本的苯丙氨酸與內標準品相比其濃度高出很多，超出正常範圍。本實用新型是結合試劑盒進行描述的，然而在閱讀了本實用新型的上述內容後， 本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附 權利要求書所限定的範圍。
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權利要求一種胺基酸與肉毒鹼串聯質譜法檢測試劑盒，其特徵是由胺基酸和肉毒鹼同位素標準品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、復溶液(4)、流動相(5)、96孔反應板(6)、包裝盒體(7)、襯墊(8)和操作說明書(9)組成，襯墊(8)設有容器孔，分別放置同位素標準品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、復溶液(4)、流動相(5)，96孔反應板(6)單獨排列放置。
專利摘要本實用新型一種提供胺基酸與肉毒鹼串聯質譜法檢測試劑盒，由胺基酸和肉毒鹼同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液、流動相、96孔反應板、包裝盒體、襯墊和操作說明書組成，襯墊設有容器孔，分別放置同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液、流動相，96孔反應板單獨排列放置。本實用新型的試劑盒運用串聯質譜方法實現一次測定能對幾十種物質的定性和定量分析。有效地解決了以往一次測定只得到一種分析物的問題，對多種代謝性疾病進行聯合篩查檢測，提高了篩查檢測的效率和檢出率，為代謝性疾病的早期檢測提供依據。
文檔編號G01N33/68GK201607442SQ20092029469
公開日2010年10月13日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者尚世強, 趙正言, 黃成剛 申請人:浙江大學