來源於番茄的抗逆性轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法

2023-10-17 14:08:14

專利名稱：來源於番茄的抗逆性轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物轉錄因子及其編碼基因與應用，特別是來源於陸地番茄的轉錄因子及其編碼基因與應用。
番茄作為一種重要的食用蔬菜植物，弄清其抗病抗逆機理，進而改善其抗病性及耐逆性，具有重要的理論及現實意義。
本發明所提供的抗逆轉錄因子名稱為LeDREB2，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
序列表中序列2胺基酸殘基序列是由299個胺基酸殘基組成的蛋白質。所述序列2中自氮端到碳端第86-143個胺基酸殘基保守結構域是轉錄因子LeDREB2的AP2/EREBP功能保守域。
抗逆轉錄因子LeDREB2的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1238個鹼基組成，該基因的讀碼框為自3』端第218到第1114位鹼基，其表達主要受乾旱、低溫、高鹽以及外來脫落酸、乙烯的誘導。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，如pBIN19以及由其衍生而來的pBI101，pBI121和pBI221系列載體(Bevan，1984核酸研究，128711-8721)，將本發明所提供的編碼轉錄因子LeDREB2的基因導入植物細胞，可獲得對乾旱、低溫和高鹽脅迫耐受力得到增強的轉基因細胞系及轉基因植株。表達載體pBI121-LeDREB2是利用常規分子生物學手段構建的帶有本發明LeDREB2 cDNA的表達載體，它的基因圖譜如

圖1所示。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)以及Ubiquitin啟動子等。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。攜帶有本發明LeDREB2基因的表達載體可通過使用Ti(Tumor-induced-癌誘導)質粒、Ri(Root-induced-根誘導)質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導等常規生物技術方法導入植物細胞，被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因對培育抗逆植物品種，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農作物產量具有重要意義。
圖2為LeDREB2基因在大腸桿菌中的體外表達。
圖3為Southern雜交分析結果。
圖4為不同脅迫條件下Northern雜交檢測的LeDREB2基因表達特徵。
實施例2、用於轉化的融合表達載體的構建。
LeDREB2 cDNA表達載體的構建按常規分子生物學手段進行。將LeDREB2編碼區域插入在一個35S啟動子後面，包裝於含有TMV翻譯增強子的pBI121雙元表達載體上，得到一個融合表達載體pBI121-LeDREB2(其圖譜如圖1所示)，經酶切鑑定插入片段無誤後，轉化於農桿菌，再提取質粒經酶切確認成功轉化於農桿菌中，該複合體可直接通過轉基因技術用於植物，特別是番茄的轉化。
實施例3、番茄LeDREB2基因在大場桿菌中的體外表達鑑定利用一對特異性引物LeDREB2F-317 5』-AAAAGAATTCCTTCTTCAGCCACTT-3』331，LeDREB2R-945 5』-AAAACTCGAGCGTAACTCGATCCCA-3』931通過PCR擴增得到一個包含AP2/EREBP結構域的cDNA片段(Size-624bp)，並將該cDNA片段插入到蛋白表達載體pGEX-4T-1中相對應的EcoRI和XhoI位點上，然後轉化於大腸桿菌中，經IPTG在大腸桿菌中誘導，SDS-PAGE檢測表明該基因能夠在大腸桿菌中進行體外翻譯表達。而未經誘導的菌株卻沒有蛋白表達帶出現。聚丙烯凝膠電泳譜帶如圖2所示，圖中，M是Marker；1、3是經誘導的菌株；2是未經誘導的菌株。從圖中可以看出，經誘導的菌株有蛋白條帶出現，未經誘導的菌株沒有蛋白條帶出現。
實施例4、LeDREB2基因在番茄基因組中的分析。
利用LeDREB2 cDNA作為探針，與經不同限制性內切酶(E-EcoRI，V-EcorV，P-PstI以及X-XhoI)消化後的番茄基因組DNA在65℃條件下進行雜交，並在高嚴謹度下洗膜，(高嚴謹度的條件是0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，結果如圖3所示，除EcoRI消化基因組DNA呈現微弱兩條雜交帶外，其它均有多條雜交帶出現，表明LeDREB2基因在番茄基因組中是一個多拷貝基因，或者在其基因組中存在著低拷貝的LeDREB2同源體。
實施例5、番茄LeDREB2基因在逆境脅迫條件下的表達特徵。
將生長2個星期的番茄幼苗分別置於4℃水，250mM NaCl水溶液以及100μM脫落酸(ABA)溶液中進行光照培養，乾旱處理是將生長2個星期的番茄幼苗經水洗淨後置於足以吸乾水分的濾紙上在室溫下脫水，並分別在1小時、3小時、5小時、7小時、9小時、12小時以及24小時取樣，提取總RNA並利用實施例3中所示的引物進行定量(1μgRNA)RT-PCR擴增目的片段，然後轉移到尼龍膜與LeDREB2 cDNA探針進行Northern雜交分析，並在高嚴謹度下洗膜。完全相同的步驟用於LeUbi3(LeUbi3一種番茄中存在的泛蛋白基因)分析。所用引物為LeUbi.3Fd-1463 5』-GTGAAAGCCAAGATCCAGGAC-3』1484；LeUbi.3Re-1857 5』-CAATCGCCAGCCTCCTTGTTG-3』1878(394bp)(Hoffman et al，1991，Ubi3accession number-X58253)，LeUbi3用做外部對照。結果如圖4所示，其中A是乾旱處理的結果，B是4℃低溫處理的結果，C是250mM NaCl處理的結果，D是脫落酸處理的結果，從圖中可以看出，LeDREB2的轉錄主要受低溫，鹽以及乾旱誘導表達，而且外來的脫落酸以及乙稀也可誘導該基因的表達。
序列表160221012111238212DNA213番茄屬陸地番茄(Lycopersicon esculentum L.)4001tctctctcat caaccctcct ctcctctccc ctctctctct atattctatt ttcacacact60aaaacagagc agctcgtcat ttcttcaaca tctctgtgta tacactgcgt tcagtttatt 120gagagtttcg caaatttaca gacatagttt tttcgcgaaa aaagagagag aagaaaacag 180agcaaacgta acaaaaacag agcaacacaa ttcatacatg ataataatgt ctacagagca 240accaaattgt tcagaaagta ctgaatctag ctgcaactct tcttcttctt cgtcgccctc 300atcgccatct tccgttcttc ttcagccact tccacaaatc aattcaaaaa atcgactcaa 360aagatgcaga ggtgaagagg aagtagaaga agaagaagac gtggtcgtta ataatccaaa 420tccgaagaag atgaataaaa acaacaacaa tggcagcagt actagtgttg tttcttatgt 480aggtgtacga atgagagcat ggggaaaatg ggtatccgaa atccgtgaac ctaaaaaaaa 540atcacggatt tggttaggta cctttgctac cccggaaatg gcggcgcgtg ctcacgacgt 600cgccgccatg tccattaaag gtacctcagc tatactcaat tttccccaat tttcacattt 660actgccccga cccgtcacgt gctccccacg tgacatccaa aacgccgccg taaaagccgc 720tcacatggat cacctaaatc caaaattctc aatattaccc gaaacctctg cggcgacgat 780gacctcatcg tcatcgtcgc tgtcgttagt ttcgggcgtt acatcctcct cgtcgtcgtt 840tcaagacgac gaggagtcaa gaccgtcgcc tccggagctg attccggagg cgacggggca 900gttgagtgag atagtggagc tgccaaaatt gggatcgagt tacgaattgg ttgaatcaac 960tcagagttta tttgaatcag atgaatggtg ggataataat tatggaaatt gtgaatattt 1020ttttggacaa gataattata ttagtagtaa tatggaattt acaggattag aaaatgtggt 1080ttcaaccagt tttgagagtt ttttatggca acattagaat aaaaaaaata atgttttttc 1140ttttgataat taattttaca ctttattttt ttttatgtaa tttaggtgga aattattgat 1200gaactttata cgtttcttgc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 12382102211299212PRT213番茄屬陸地番茄(Lycopersicon esculentum L.)4002Met Ile Ile Met Ser Thr Glu Gln Pro Asn Cvs Ser Glu Ser Thr5 10 15Glu Ser Ser Cys Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Pro20 25 30Ser Ser Val Leu Leu Gln Pro Leu Pro Gln Ile Asn Ser Lvs Asn35 40 45Arg Leu Lys Arg Cys Arg Gly Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Glu50 55 60Asp Val Val Val Asn Asn Pro Asn Pro Lys Lys Met Asn Lys Asn65 70 75Asn Asn Asn Gly Ser Ser Thr Ser Val Val Ser Tyr Val Gly Val80 85 90Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro95100 105Lys Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ala Thr Pro Glul10 115 120Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Met Ser Ile Lys Gly125 130 135Thr Ser Ala Ile Leu Asn Phe Pro Gln Phe Ser His Leu Leu Pro140 145 150Arg Pro Val Thr Cys Ser Pro Arg Asp Ile Gln Asn Ala Ala Val155 160 165Lys Ala Ala His Met Asp His Leu Asn Pro Lys Phe Ser Ile Leu170 175 180Pro Glu Thr Ser Ala Ala Thr Met Thr Ser Ser Ser Ser Ser Leu185 190 195Ser Leu Val Ser Gly Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Phe Gln Asp200 205 210Asp Glu Glu Ser Arg Pro Ser Pro Pro Glu Leu Ile Pro Glu Ala215 220 225Thr Gly Gln Leu Ser Glu Ile Val Glu Leu Pro Lys Leu Gly Ser
230 235 240Ser Tyr Glu Leu Val Glu Ser Thr Gln Ser Leu Phe Glu Ser Asp245 250 255Glu Trp Trp Asp Asn Asn Tyr Gly Asn Cys Glu Tyr Phe Phe Gly260 265 270Gln Asp Asn Tyr Ile Ser Ser Asn Met Glu Phe Thr Gly Leu Glu275 280 285Asn Val Val Ser Thr Ser Phe Glu Ser Phe Leu Trp Gln His290 295 299
權利要求
1.抗逆轉錄因子LeDREB2，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的轉錄因子，其特徵在於它是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質。
3.根據權利要求2所述的轉錄因子，其特徵在於所述序列2中自氮端到碳端第86-143個胺基酸殘基保守結構域是轉錄因子LeDREB2的AP2/EREBP功能保守域。
4.抗逆轉錄因子LeDREB2的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於所述抗逆轉錄因子LeDREB2的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據權利要求5所述的基因，其特徵在於該基因的讀碼框為自3』端第218到第1114位鹼基。
7.含有權利要求4所述基因的表達載體。
8.根據權利要求7所述的載體，其特徵在於所述表達載體為pBI121-LeDREB2。
9.含有權利要求4所述基因的細胞系。
10.權利要求4所述基因在培育抗旱、抗寒、抗鹽植物品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了來源於番茄的抗逆性轉錄因子及其編碼基因與應用，目的是提供具有較強抗逆特性的來源於番茄的轉錄因子及其編碼基因。本發明所提供的抗逆轉錄因子名稱為LeDREB2，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。抗逆轉錄因子LeDREB2的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的基因對培育抗逆植物品種，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農作物產量具有重要意義。
文檔編號C12N15/29GK1477110SQ02128889
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月19日 優先權日2002年8月19日
發明者程憲國, 劉強, 侯玉霞 申請人:清華大學