Rna最佳注射配方的製作方法

2023-10-17 22:22:44

專利名稱：：Rna最佳注射配方的製作方法
技術領域：
：本發明涉及在製備用於增加寄助物內RNA轉移到寄助物和/或RNA翻譯的RNA注射液時，RNA和包含鈉鹽、鈣鹽、可選的鉀鹽和可選的乳酸鹽的水性注射緩衝液的使用。
背景技術：
：在許多疾病的治療和預防中，例如基因治療和遺傳接種等分子醫學方法，起著重要的作用。這些方法的基礎是將核酸引入到病人的細胞或組織中，然後處理引入的核酸所編碼的信息，也就是說，翻譯成所需的多肽或蛋白質。DNA和RNA都可考慮作為被引入的核酸。在20世紀90年代早期，注射入裸露的質粒DNA的遺傳接種方法首先在大鼠上得到證實。然而，臨床I/II期研究顯示，在人類身上，此技術不能達到在對老鼠的研究中所引起的期望、許多基於DNA的遺傳接種和引入DNA到細胞中的方法(包括磷酸鈣轉染法、聚戊二烯轉染法、原生質體融合法、電穿孔法、顯微注射法、脂質體法等，使用DNA病毒作為DNA載體)已經被研究出來。15年前，Wolff等研究顯示了向大鼠中以質粒DNA(pDNA)或mRNA的形式注入裸露的遺傳信息可引起蛋白質表達2。對這些結果的跟蹤研究顯示裸露的pDNA可用於接種3—5。然而，直到20世紀90年代末期，用mRNA來接種才略為引起人們的注意，當時被證實將mRNA轉移到樹突狀細胞(dendriticcells)可觸發免疫反應6。然而，直接注射裸露的mRNA來接種仍然不被重視，並且僅僅在三個不同的研究小組的四篇論文中給予討論7-1Q。這種情況的一個重要原因是mRNA的由於其被核酶迅速降解所導致的不穩定性以及與此有關的mRNA作為體內的遺傳工具的有限效果。然而，同時，現有技術中己經有許多方、法用來穩、定mRNA，例如，EP曙A-1083232、WO99/14346、US5580859禾口US6214804。RNA作為用於遺傳載體的核酸具有比DNA更多的優勢，包括i)引入到細胞中的RNA並不結合到基因組中(而DNA在一定程度上結合到基因組中，並且因此插入到寄主細胞(hostcell)的基因組的完整基因中，因此此基因可能變異並且可導致遺傳信息的全部丟失或誤傳)。ii)RNA的有效轉錄不需要例如啟動子(promoters)等的病毒序列(而引入到細胞中的DNA的表達需要強的啟動子(例如，病毒CMV啟動子))。啟動子結合到寄主細胞的基因組中可導致基因表達調控中不希望的改變。iii)引入的RNA的降解發生在有限的時間內(幾個小時)u'12，因此有可能實現瞬時基因表達，其在需要的治療期過後可停止(而這在引入到基因組中的DNA的情況下是不可能的)。iv)RNA不會在病人身上引起致病的抗-RNA抗體的誘導(而抗-DNA抗體的誘導據知可引起不希望的免疫反應)。v)RNA廣泛可用——任何所需的感興趣的蛋白的RNA可在短時間內製備出來以用於接種，甚至是基於個體病人的。總之，仍然應注意到，mRNA代表了所有有機體中的編碼遺傳信息的過渡副本，作為合成蛋白質的模型，並且，不像DNA，其代表了製備合適的用於體內外源性遺傳信息轉移的遺傳媒介(vector)的所有必要先決條件。所描述的將核酸轉移到寄助物(尤其在哺乳動物中)的獨特的合適程序是注射。為此類注射用的DNA—般在水、NaCl或PBS注射緩衝液中稀釋，而RNA—般只在注射緩衝液中稀釋。作為RNA注射緩衝液使用的標準緩衝液有例如磷酸鹽緩衝液，尤其是PBS和HEPES緩衝鹽溶液(HBS)。在轉移mRNA的情況下，這樣的RNA注射液最好在注射前進行短時間的加熱來去除mRNA的二級結構。使用這樣的標準緩衝液用於RNA注射液的的缺點是皮下RNA的轉移是很低效率的。另一個缺點是轉移的RNA的翻譯率非常低。另一個缺點是，在這樣的標準緩衝液中，RNA常常形成二級結構(例如，所謂的髮夾結構(hairpinstructure)),其可大大降低RNA被吸收到細胞溶質中的效率。
發明內容因此，本發明的目的是提供一種系統，通過該系統，一方麵皮下RNA到寄助物中的轉移得到改善，另一方面轉移的RNA的翻譯率得到提高。此目標在權利要求中加以特徵化的本發明的各實施例中得以實現。本發明的一個實施例提供在製備用於增加RNA轉移到寄助物和/或寄助物內RNA翻譯的RNA注射液時RNA和水性注射緩衝液的用途，所述水性注射緩衝液包含鈉鹽，優選為至少50mM的鈉鹽；鈣鹽，優選為至少0.01mM的牽丐鹽；和可選的鉀鹽，優選為至少3mM的鉀鹽。本發明的另一方面還提供一種如此製備的注射液。所述注射液是由注射緩衝液和溶解在注射緩衝液中的RNA得到的。根據優選實施例，包含在注射緩衝液中的鈉鹽、鈣鹽和可選的鉀鹽是以滷化物的形式存在，例如，氯化物、碘化物或溴化物，或以它們的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽的形式存在。此處提到的例子是對於鈉鹽有NaCl，Nal,NaBr,Na2C03,NaHC03,Na2S04;對於可選的鉀鹽有KC1，KI，KBr,K2C03，KHC03，K2S04;對於轉鹽有CaCl2,Cal2,CaBr2,CaC03，CaS04,Ca(OH)2。上面所提到的陽離子的有機陰離子也可包含在注射緩衝液中。根據本發明RNA和注射緩衝液的的用途的特別優選實施例，根據本發明的注射緩衝液包含氯化鈉(NaCl),氯化鈣(CaCl》和可選的氯化鉀(KC1)，除了氯化物之外還可以出現其他的陰離子。這些鹽在注射緩衝液中的典型濃度是至少50mM的氯化鈉(NaCl),至少3mM的氯化鉀(KC1)和至少O.OlmM的氯化轉(CaCl2)。根據本發明的注射緩衝液可以是高滲的或等滲的或低滲的注射緩衝液。結合本發明，注射緩衝液是高滲的或等滲的或低滲的，與不同的參考媒質有關，就是說，本發明的注射緩衝液相比於各個參考媒質具有較高的、相等的或較低的鹽含量，上述的鹽的優選濃度是不會由於滲透作用或其它濃度效果對細胞造成損害的那些濃度。此處的參考媒質是，例如，在"體內"處理過程中產生的液體，例如，血液、淋巴液、細胞溶質液或其它在體內出現的液體，或現有的在"體外"("眾V7'&0")處理過程中使用的液體或緩衝液。這些液體和緩衝液為所屬領域技術人員所知悉。注射緩衝液可包含有另外的成分，例如，糖類(單糖、二糖、三糖或多糖)，尤其是葡萄糖或甘露醇。然而，在優選實施例中，用於本發明的用途所採用的注射緩衝液中不會出現糖類。本發明的緩衝液中最好也不包含任何不帶電荷的成分，例如，糖類。本發明的緩衝液一般僅包含金屬陽離子，尤其是來自鹼金屬或鹼土金屬的陽離子，以及陰離子，尤其是上面所述的陰離子。本發明的注射緩衝液的優選pH值是1到8.5，優選的是3到5，更優選的是5.5到7.5，尤其最佳的是5.5到6.5。該注射緩衝液還可選地包含有緩衝系統，將注射緩衝液固定到緩衝後的pH值。這樣的系統可以是，例如，磷酸緩衝系統、HEPES或Na2HP04/NaH2P04。然而，很特別的優選是根據本發明使用的注射緩衝液不含有上面所述的任何緩衝系統或者根本就沒有緩衝系統。如前所述，根據本發明使用的注射緩衝液包含鈉鹽、鈣鹽和可選的鉀鹽，在該注射緩衝液中鉀和納一般以一價陽離子(Na+,K+)的形式存在，鈣以二價陽離子(Ca2+)的形式存在。根據本發明的優選實施例，除了根據本發明的包含在或可選地包含在注射緩衝液中的一價和二價陽離子之外還可以有二價陽離子，尤其是鹼土金屬族的陽離子，例如，鎂(Mg2+)，或也包括鐵(Fe2+);和一價陽離子，尤其是鹼金屬離子，例如，鋰(Li+)。這些一價陽離子優選以它們的鹽的形式存在，例如，以滷鹽的形式，例如，氯化物、碘化物或溴化物，或以它們的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫化物的形式存在。例如，在此可列舉的例子有對於鋰鹽有LiCl,Lil,LiBr，Li2C03,LiHC03,Li2S04;對於鎂鹽有MgCl2,Mgl2，MgBr2,MgC03，MgS04和Mg(OH)2;對於鐵鹽有FeCl2,FeBr2:Fel2,FeF2,Fe203,FeC03,FeS04,Fe(OH)2。也包括上述的二價和/或一價陽離子的結合。因此，根據本發明的注射緩衝液可僅包含二價陽離子，或僅有一價陽離子，或同時包含二價和一價陽離子。根據本發明的注射緩衝液還可僅包括一種類型的二價離子或一價離子，尤其優選的是，例如，僅包含C^+或鈣鹽，例如，CaCl2。根據本發明，在製備注射液時，在注射液中使用鹼金屬或鹼土金屬的不同於Ca2，n1^1+的二價或一價陽離子或不同的二價陽離子和陰離子來全部替代或部分替代C,或Na、寸，在注射緩衝液中，也可以考慮上面所提到的Ca2+(作為二價離子)和Na^(作為一價離子)的摩爾濃度(也就是說，一般濃度是至少50mM的Na+,至少0.01mM的Ca2+，可選的至少3mM的K+)。雖然根據本發明，如上提及的在注射緩衝液中的C^+和N^+可完全用不同的二價或一價陽離子來替代，例如，被不同的二價陽離子的組合(替代Ca2+)和/或不同的一價陽離子的組合(替代Na")來替代(特別地，用鹼金屬的不同一價陽離子的組合或鹼土金屬的不同二價陽離子的組合)，優選的是，部分地替代C,或N^+)，也就是說，在具有C,或Na1勺注射緩衝液中加入各自總摩爾濃度的至少20%、較好的是至少40%、更好的是至少60%、最好是至少80%的一價或二價陽離子。然而，根據本發明的特別優選的注射緩衝液只包含C^+作為二價陽離子和N^+作為一價陽離子，也就是說，C,佔了二價陽離子的總摩爾濃度的100%，Na'+佔了一價陽離子的總摩爾濃度的100%。注射緩衝液的製備最好在室溫(25°C)和大氣壓下進行。製備可根據現有技術中的任何想要的處理過程來執行。優選地，其內所包含的離子或鹽在水溶液中稀釋，所依據的濃度比是根據特定條件(RNA注射液將要注射到的寄助物，尤其是哺乳動物，寄助物的健康狀態、年齡等，溶解度和各成分的幹擾、反應溫度、反應時間等)來選擇的。包含在水性注射緩衝液中的鈉、鈣和氯離子和可選的鉀離子和可選的乳酸鹽(參見下面的實施例)各成分的濃度特別依賴於它們在水中的溶解度、各成分彼此之間的幹擾以及在製備該注射液或製備RNA注射液時的反應溫度和反應壓力。根據本發明使用的注射緩衝液是基於水性溶液的，也就是，包含水和根據本發明的注射溶液中使用的鹽、和可選的乳酸鹽。在這樣的水性溶液中，上述鹽的一價或二價陽離子可以可選地是微溶的或甚至不溶的。鹽的溶解度可用溶度積計算得到。精確地確定溶度和溶度積的方法為所述領域的技術人員所熟知。此水性溶液可包含高至30mol。/。的鹽，較好是25mo1。/。，再好是20mo1。/。，更好是15molM，再更好是10mo1。/。，再更好是5mol%，最好是2mol。/。的不溶或微溶的鹽。在本發明的範圍內，溶度積小於14的鹽認為是微溶的。溶度積大於10—4的鹽認為是可溶的。鹽或離子或離子化合物在水中的溶解性是依賴於它的晶格能和水合能，考慮到發生的熵效應的話。術語"溶度積"也可更精確地指當鹽或離子或離子化合物溶解在水裡時建立的平衡。溶度積一般定義為在電解液飽和溶液中離子的濃度之積。例如，鹼金屬(例如，Na+,K+)在水中的溶解度比鹼土金屬(例如，Ca2+)的更大，就是說，鹼金屬有更大的溶度積。也就是說，根據本發明包含在注射緩衝液的水性溶液中的鉀鹽和鈉鹽比鈣鹽更容易溶解。因此，在確定這些離子的濃度時，需要考慮鉀鹽、鈉鹽和鈣鹽之間的幹擾等。根據本發明的應用的一個優選實施例，注射緩衝液中包含50mM到800mM、較優為60mM到500mM、更優為70mM到250mM、尤其較優為60mM到110mM的氯化鈉(NaCl)，O.OlmM到100mM、較優為0.5mM到80mM、更優為1.5mM到40mM的氯化鈣(CaCl2)，以及可選地3mM到500mM、優選為4mM到300mM、更優地為5mMto200mM的氯化鉀(KC1)。除了上述的無機陰離子例如滷素離子、硫酸根或碳酸根外，也可包括有機陰離子。這些陰離子可由琥珀酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、maleonate等形成，也可是這些物質的組合。根據本發明使用的注射緩衝液最好還包括乳酸鹽，尤其最好在含有有機陰離子的注射緩衝液中，只包含有乳酸鹽作為有機陰離子。本發明的範圍內的乳酸鹽可以是任何形式的乳酸鹽，例如L-乳酸鹽和D-乳酸鹽。結合本發明，乳酸鈉和/或乳酸鈣一般是以乳酸鹽的形式存在，尤其是在注射緩衝液中僅有Na+作為一價陽離子和C^+作為二價陽離子時。本發明應用的一種優選形式中，本發明的注射緩衝液優選包含15mM到500mM的乳酸鹽，其中以包含15mM到200mM的乳酸鹽為較佳，最好包含15mM到100mM的乳酸鹽。本發明已發現，具有上述成分且可選地含有或不含有乳酸鹽(下文中，"RL注射緩衝液"指不含乳酸鹽的緩衝液，而"含乳酸的RL注射緩衝液"指含乳酸鹽的緩衝液)的注射緩衝液用於RNA注射液(也就是，包含RNA且適於用來注射RNA的注射液)時，相對於現有技術中使用的注射緩衝液，明顯地增加了RNA到/在寄助物(哺乳類動物)細胞/組織中的轉移和翻譯。含有上述氯化鈉((NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、乳酸鹽(特別是乳酸鈉)和可選的氯化鉀(KC1)成分的溶液又稱為"林格氏液"(Ringer'ssolution)或"林格氏乳酸鹽"(Ringer'slactate)。林格氏乳酸鹽是全結晶電解質溶液，用於容積替代和作為載體溶液，例如，用於兼容藥劑。例如，在體液和電解質丟失(由於嘔吐、腹瀉、腸梗阻或燒傷)的情況下，林格氏乳酸鹽可用作初級容積替代劑，尤其用於嬰兒和兒童，並且也用來維持外周和/或中心靜脈通路的開放。然而，本發明的用林格氏乳酸鹽來作為RNA注射液中的注射緩衝液，在現有技術中未曾有記載。本發明範圍內的RNA是指任何形式的RNA，例如，mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、單鏈或雙鏈RNA、異源雙鏈核酸分子RNA等。所使用的RNA可用來編碼任何感興趣的蛋白質。本發明使用的RNA優選是裸露RNA，其中以mRNA較佳，最好是裸露mRNA。本發明所述的裸露RNA，特別是裸露mRNA，應被理解為不複雜的RNA，例如，帶有聚陽離子分子的RNA。裸露RNA可以單鏈形式存在，但也可以雙鏈形式存在，也就是說，以二級結構存在，例如，所謂的"髮夾結構"。這樣的雙鏈形式尤其在裸露RNA中發生，特別是當分子中出現互補核苷酸時，在裸露mRNA中發生。然而，本發明所述的RNA，尤其是mRNA，也可以複雜形式存在。本發明中，由於RNA尤其是mRNA的複雜化/濃縮，通過將RNA與(多個)陽離子聚合物、多肽或蛋白質聯合或綁定，RNA到有機體的需要治療的細胞中或組織中有效轉移將得到改善。這樣的RNA(mRNA)最好與至少一種陽離子或聚陽離子劑進行複合或濃縮。所述陽離子或據聚陽離子劑優選地為從以下一組中選出的試劑魚精蛋白(protamine)、聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine)、聚左旋精氨酸(poly-L-arginine)、核仁素(nucleolin)、精胺(spermine)、和組蛋白(histone)、或組蛋白或魚精蛋白的衍生物。較佳的選擇是採用魚精蛋白來作為聚陽離子、核酸綁定的蛋白。穩定RNA的程序在EP-A-1083232中有描述，其相關的揭示完整地結合在本發明中。本發明的RNA可進一步修飾。這些改進是為了增加RNA的穩定性。優選地，RNA有一種或多種(自然發生的或非自然發生的)修飾，尤其是化學修飾，例如，利於增加RNA在有機體中的半衰期，使mRNA比沒有經過修飾的mRNA在細胞溶質中的翻譯效率更高。優選地，根據本發明，經過修飾的mRNA與沒有經過修飾的mRNA在細胞溶質中的翻譯效率相比，可提高至少10%，較佳的是提高至少20%，更佳的是提高至少40。Z，再更佳的可提高至少50%，再更佳的可提高至少60%，再更佳的可提高至少75%，再更佳的可提高至少85%，最高可提高至少100%。例如，經修飾後的mRNA的編碼區的G/C含量可比相應的野生型的mRNA的編碼區的G/C含量更多，優選地，經修飾後的mRNA的編碼胺基酸序列相對於野生型的mRNA的編碼胺基酸序列仍未改變。這一修飾基於如下事實mRNA的序列區對於mRNA的有效翻譯來說是重要的。各種核苷的成分和序列是非常重要的。特別是，具有較高的G(鳥苷)/C(胞核嘧啶)含量的序列比具有較高的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更穩定。因此，在保持翻譯的胺基酸序列不變的同時，改變密碼子，使之相對於野生型的mRNA有更多的G/C核苷，是有利的。由於幾個密碼子編碼同一胺基酸(所謂的"遺傳密碼的兼併")的事實，確定對穩定性有利的密碼子是可能的，尤其具有最大G/C含量時。結果，注射緩衝液中的RNA的G/C含量優選根據G/C含量的最大含量而提高至少30%，較佳是提高至少50%，更佳是提高至少70%，最好是提高至少80%(即，為了最大化G/C含量，在編碼區修飾了所有的可能的三聯密碼而不改變編碼的胺基酸序列之後的G/C含量)，並且，最好就是最大G/C含量，該最大G/C含量由G/C含量得到最大化而不未改變編碼的胺基酸序列的序列給出。根據將由修飾後的mRNA編碼的胺基酸序列，相比較於野生型序列，有各種修飾mRNA的可能。對於由僅含有G或C核苷的密碼子編碼胺基酸的情況，不需要修飾密碼子。這樣的例子是Pro(脯氨酸)(CCC或CCG)、Arg(精氨酸)(CGC或CGG)、Ala(丙氨酸)(GCC或GCG)和Gly(甘氨酸)(GGC或GGG)的密碼子。另一方面，包含A和/或U核苷的密碼子可用編碼同樣的胺基酸但不含A和/或U的密碼子來代替。下面是一些例子編碼Pro的密碼子可從CCU或CCA變成CCC或CCG;編碼Arg的密碼子可從CGU或CGA或AGA或AGG變成CGC或CGG;編碼Ala的密碼子可從GCU或GCA變成GCC或GCG;編碼Gly的密碼子可從GGU或GGA變成GGC或GGG。在某些情況下，雖然不可能從密碼子中去除A和U核苷，但可用具有較少的A和/或U核苷的密碼子來減少A和U的含量。下面是一些例子-編碼Phe(苯丙氨酸)的密碼子可從UUU變成UUC;-編碼Leu(亮氨酸)的密碼子可從UUA、UUG、CUU或CUA變成CUC或CUG;-編碼Ser(絲氨酸)的密碼子可從UCU或UCA或AGU變成UCC、UCG或AGC;-編碼Tyr(絡氨酸)的密碼子可從UAU變成UAC;-編碼Cys(胱氨酸)的密碼子可從UGU變成UGC;-編碼His(組氨酸)的密碼子可從CAU變成CAC;-編碼Gln(穀氨酸)的密碼子可從CAA變成CAG;-編碼Ile(異亮氨酸)的密碼子可從AUU或AUA變成AUC;-編碼Thr(蘇氨酸)的密碼子可從ACU或ACA變成ACC或ACG;-編碼Asn(酪氨酸)的密碼子可從AAU變成AAC;-編碼Lys(賴氨酸)的密碼子可從AAA變成AAG;-編碼Val(纈氨酸)的密碼子可從GUU或GUA變成GUC或GUG;-編碼Asp(門冬氨酸)的密碼子可從GAU變成GAC;-編碼Glu(穀氨酸)的密碼子可從GAA變成GAG，-終止密碼子UAA可變成UAG或UGA。上面所列出的替代可單獨使用或以所有可能的組合來使用，以使修飾後的mRNA的G/C含量比野生型的mRNA(原始序列)的G/C含量更高。上述的替代可能的各種組合，例如，可優選使用如下用ACC(或ACG)替代原始序列(野生型的mRNA)中編碼Thr的所有密碼子，並且用UCC(或UCG或AGC)替代原始序列(野生型的mRNA)中編碼Ser的所有密碼子；用AUC替代原始序列中編碼lie的所有密碼子，並且用AAG替代原始序列中編碼Lys的所有密碼子，並且用UAC替代原始序列中編碼Tyr的所有密碼子。用GUC(或GUG)替代原始序列中編碼Val的所有密碼子，並且用GAG替代原始序列中編碼Glu的所有密碼子，並且用GCC(或GCG)替代原始序列中編碼Ak的所有密碼子，並且用CGC(或CGG)替代原始序列中編碼Arg的所有密碼子；用GUC(或GUG)替代原始序列中編碼Val的所有密碼子，並且用GAG替代原始序列中編碼Glu的所有密碼子，並且用GCC(或GCG)替代原始序列中編碼Ala的所有密碼子，並且用GGC(或GGG)替代原始序列中編碼Gly的所有密碼子,並且用AAC替代原始序列中編碼Asri的所有密碼子；用GUC(或GUG)替代原始序列中編碼Val的所有密碼子,並且用UUC替代原始序列中編碼Phe的所有密碼子，並且用UGC替代原始序列中編碼Cys的所有密碼子,並且用CUG(或CUC)替代原始序列中編碼Leu的所有密碼子,並且用CAG替代原始序列中編碼Gin的所有密碼子，並且用CCC(或CCG)替代原始序列中編碼Pro的所有密碼子；等等。編碼蛋白質的修飾後的mRNA的編碼區G/C含量改變的情況下，該改變與編碼蛋白質的野生型mRNA的編碼區G/C含量相比，為增加至少7。％，較佳是增加至少15。％，更佳是增加至少20%，最佳是增加30%。在此關係中尤其優選的是相對於野生型的序列，將修飾後的mRNA尤其編碼蛋白質的區域內的G/C含量增加到最大的範圍。進一步優選是增加修飾後的mRNA的核糖體結合點的編碼區內的A/U含量，使之比相應的野生型mRNA的核糖體結合點的編碼區內的A/U含量更高。這一修飾增加了核糖體結合到mRNA的效率。核糖體有效地結合到核糖體結合點(Kozak序列GCCGCCACCAUGG，啟動子的AUG形式)將影響mRNA的有效翻譯。這一增加在於在結合點的編碼區引入了至少一個額外的A/U單位，一般至少3個，也就是說，從AUG啟動子的A開始的-20到+20。優選的修飾與mRNA有關，其中mRNA的編碼區和/或修飾後的mRNA的5'-和/或3'-未翻譯區己經相對於不含任何擾動序列元素的野生型mRNA而改變，修飾後的mRNA的編碼胺基酸序列相對於野生型的mRNA最好沒變。人們知道，擾動序列元素(DSE)在真核mRNA的序列中出現，擾動序列元素信號蛋白與其結合併調節體內mRNA的酶降解。因此，本發明為了進一步穩定修飾後的mRNA，與野生型mRNA的對應區域相比，可選地可在編碼蛋白質的區域內進行一種或多種這樣的改變，從而就沒有或幾乎沒有擾動序列元素出現在其中。根據本發明，通過這樣的改變，可消除mRNA中出現在未翻譯區域(3'-和/或5'-UTR)的DSE。例如，這樣的擾動序列是含豐富的AU的序列("AURES")，其可在許多不穩定的mRNA的3'-UTR部分出現(Caputetat.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1986,83:1670to1674)，也可以是被核酸內切酶識別的序列模體(motif)(例如，Binderetal.,EMBOJ.1994,13:1969to1980)。同樣優選地，經修飾的mRNA具有5'-帽(5'-cap)的穩定結構，本發明使用的帽結構的例子是m7G(5')ppp，5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G同樣優選地，經修飾的mRNA具有聚(A)尾部(ploy(A)tail)，較佳的是具有至少25個核苷，再較佳的是具有至少50個核苷，更較佳的是具有至少70個核苷，再較佳的是具有至少100個核苷，最好具有至少200個核苷。同樣優選地，修飾了的mRNA具有至少一個IRES和/或至少一個5'-和/或3'-穩定序列。根據本發明，一個或多個所謂的IRES("內部核糖體進入位""internalribosomeentryside")可引入到修飾了的mRNA當中。因此，IRES可作為唯一的核糖體結合點，但它也可用來提供mRNA，通過核糖體("multicistronicmRNA"，多順反子mRNA)來編碼將彼此單獨翻譯的多個蛋白質、肽或多肽。根據本發明的IRES序列的例子來自於小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、瘟疫病毒(CFFV)、脊髓灰質炎病毒(PV)、腦心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、C肝病毒(HCV)、豬瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、蟋蟀麻痺病毒(CrPV)。優選地，修飾後的mRNA具有至少一個5'-和/或3'-穩定序列。這些在5'-和/或3'未翻譯區的穩定序列可使細胞溶質中的mRNA的半衰期增長。這些穩定序列與病毒、細菌、真核生物中自然存在的序列具有100%的同源性，但也可具有部分或完全的合成性質。作為本發明的穩定序列的一個例子是人類(/fo/7K碼D/'e/2^或非洲爪蟾(le/20/ws"ew;s)的球蛋白基因的未翻譯序列(UTR)。穩定序列的另一個例子具有如下通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC，其包含在用於編碼a-球蛋白(a-globin)、(I)-膠原((I)-collagen)、15-脂氧酶(15-lipoxygenase)或酪氨酸羥化酶(tyrosine-hydroxylase)的很穩定的mRNA的3'-UTR中(參見Holciketal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997，94:2410to2414)。當然，對於本領域技術人員來說，這樣的穩定序列可單獨使用或彼此結合使用，以及與其他的穩定序列組合起來使用。在本發明的優選實施例中，修飾了的mRNA包含自然存在的核苷的至少一個相似物。這個/這些相似物可進一步穩定修飾後的mRNA，這是基於如下事實細胞中存在的RNA降解酶優先識別出自然存在的核苷來作為底物。通過引入核苷類似物到RNA中，從而RNA的降解變得更困難了，然而，這些類似物的引入，特別是引入到mRNA的編碼區內，對翻譯效率有或正或負的影響。在此舉出本發明可用的核苷類似物的例子(但不限於這些)有氮基磷酸酉旨(phosphoramidates)、；^/(戈石粦酸酉旨類(phosphorothioates)、月太牛亥昔(peptidenucleotides)、甲基石粦酸酉旨(methylphosphonates)、7畫deazaguanosine、5國甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)和肌苷(inosine)。例如，根據專利號為US4，373，071、US4,401,796、US4,415,732、US4,458,066、US4，500，707、US4,668,777、US4,973,679、US5,047,524、US5,132,418、US5,153,319、US5,262,530禾BUS5,700,642的美國專利的相關介紹，所屬領域的技術人員熟悉這些類似物的製備。這些類似物可存在於修飾後的mRNA的未翻譯區和翻譯區。在本發明的較佳實施例中，修飾後的mRNA還包含編碼信號肽的序列。編碼信號肽的序列優選地長度是30到300個鹼基，編碼10到100個胺基酸。較佳的，編碼信號肽的序列的長度是45到180個鹼基，編碼15到60個胺基酸序列。通過示例的方式，下表1中的序列可用來修飾本發明使用的RNA。表1中也包括有優選1到20個、較佳1到10個、最好是1到5個鹼基的序列替代A、T、G、C，與表1中列出的一個序列相比較。tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18表l:信號肽序列的示例由第一類MHC或第二類MHC基因的第一外顯子編碼的胺基酸序列和髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白所屬領域的技術人員熟知實現上述的修飾的各種處理方法。例如，對於根據本發明修飾了的mRNA中密碼子的替換，在相對短的編碼區的情況下，可以使用標準技術用化學地方法合成整個mRNA。然而，在藉助現有的面向目標的誘變的技術製備經修飾的mRNA時，鹼基的替代、增加或消除最好利用DNA豐莫豐反(matrix)來引入(參見例如Maniatisetal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,3rded.,ColdSpringHarbor,NY，2001)。在此過程中，相應的DNA分子在體外被轉錄以便製備mRNA。此DNA模板有合適的啟動子，例如，用於體外轉錄的T7或SP6啟動子，接著是要製備的mRNA所需的核苷酸序列和體外轉錄的終止信號。形成要製備的RNA模板的DNA分子可通過發酵繁殖和隨後分離為細菌中的質粒複製品的一部分來製備。所以，根據所屬領域的技術人員己知的分子生物學的方法，使用在分裂點具有短的單鏈過渡的短合成DNA寡核苷酸，或者使用通過化學合成製備的基因，可將所需的核苷序列克隆到合適的質粒內(參見前面提到的Maniatis等所著的文獻)。然後，用限制性內切酶消化的方法將在質粒中的以一個副本形式存在的或多個副本形式存在的DNA分子從質粒中切除。上述的RNA的修飾，尤其是mRNA的修飾，可在本發明的範圍內單獨或相互組合起來進行。類似地，一個或多個修飾可與上述的RNA的複雜化相結合，尤其是mRNA。本發明的目標是增加寄助物中的RNA轉移和/或RNA翻譯。本發明範圍內所指的寄助物可以理解為RNA可轉移入其細胞或組織並隨後在其中進行翻譯的任何生物體。本發明範圍內所指的寄助物特別是哺乳動物例如小鼠、大鼠、豬、牛、馬、狗、貓、猿，尤其是人。根據本發明，螢光素酶編碼的RNA，尤其是mRNA，稀釋在本發明的RL注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)中，比稀釋在標準的傳統的用來稀釋RNA的緩衝液例如HBS或PBS中具有明顯更好的翻譯率(參見圖1)。更進一步，注射的mRNA的轉移和翻譯效率很大程度上取決於鈣離子的存在與否。在相應的RL注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)中含有/不含有鈣離子的對比測試中，不含鈣會大大地降低RNA的轉移率至與標準緩衝液PBS和HBS的轉移率相當的水平(參見圖2)。因此發現，首先，本發明的RL注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)顯著地增加RNA轉移；其次，用含高達100mM的鈣濃度的RL注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)是改進RNA的轉移率的另一個因素。本發明的注射緩衝液最好與RNA注射液中的RNA相結合使用。因此本發明進一歩提供了一種包含RNA的RNA注射液和一種包含至少50mM氯化鈉(NaCl)、至少O.OlmM氯化鈣(CaCl2)和可選的至少3mM氯化鉀(KC1)的注射緩衝液，用於增加細胞中的RNA轉移和/或RNA翻譯。本發明優選的RNA注射液中，注射緩衝液包含有至少50mM到800mM的氯化鈉，較佳地含氯化鈉60mM到500mM，更佳地含氯化鈉70mM到250mM，尤其更佳的是含氯化鈉60mM到110mM;包含有至少O.OlmM到100nM的氯化l丐(CaCl2)，較佳地至少含氯化鈣0.5mM到80mM，更佳地含氯化鈣至少1.5mM到40mM;和可選的至少3mM到500mM的氯化鉀(KC1)，較佳地含氯化鉀至少4mM到300mM，更佳地含氯化鉀至少5mM到200mM。本發明的RNA注射液的注射緩衝液優選地進一步包含乳酸鹽。本發明的RNA注射液的注射緩衝液優選地包含至少15mM的乳酸鹽。本發明的一種優選RNA注射液中，注射緩衝液較佳地包含15mM到500mM的乳酸鹽，更佳地包含15mM到200mM的乳酸鹽，最好含15mM到100mM的乳酸鹽。RNA注射液可根據現有技術中的任何方法來製備。優選地，RNA稀釋在RL注射緩衝液或含乳酸鹽的RNA注射緩衝液中。類似地，RNA可以幹RNA的形式(例如，冷幹的)使用，並且可加入RNA注射緩衝液或含乳酸鹽的RL注射液，可選地通過提高溫度、攪拌、超聲等來加速溶解。濃度比可根據特定條件來選擇(RNA注射液要注射入的寄助物，尤其是哺乳動物以及寄助物的健康狀態、年齡等)。本發明的RNA注射液中的RNA優選是裸露RNA，較佳是mRNA，最好是如上所定義的裸露mRNA。如上所述，本發明的RNA注射液尤其可用來增加到/在寄助物內的RNA轉移和RNA翻譯。因此，本發明還提供上述的RNA注射液用於增加到/在寄助物內的RNA轉移和RNA翻譯的用途。RL注射緩衝液(含或不含乳酸)內RNA的劑量(尤其是指臨床應用的量和持續時間)也已經進行了研究。研究表明，隨著mRNA的量在小鼠中增加到0.1iig(100|Lil的注射體積中)，在人體中增加到3mg(150pl注射體積中)，瑩光素酶的表達也增加。mRNA的翻譯瞬時發生並且隨後被調節，因此，為了使外來分子(蛋白質)能夠持續、一致的表達，依據各種因素例如要表達的外來分子和傾向的活動、接受注射的有機體和其(健康)狀態，大約每3天要重複注射一次，甚至兩天重複注射一次或每天重複注射。RNA的量(同樣取決於上述的各種因素)可以是100)al的注射體積中包含0.01|ag到1000pg，較佳地包含1嗎到800嗎，更佳地包含2)ig到200嗎，再更佳地包含5|Lig到100嗎，再更佳地包含10昭到90fig，最好包含20嗎到80嗎。在100pl注射體積中，RNA的量特別優選的是60(ig。因此，本發明提出的RNA和RL注射緩衝液或含乳酸鹽的RL注射緩衝液以及RNA注射液的用途，可用於例如癌症或腫瘤疾病的治療和/或預防，或用於治療和/或預防癌症或腫瘤疾病的藥劑的製備，該癌症或腫瘤疾病指的是例如黑素瘤，比如，惡性黑素瘤、皮膚黑素瘤，癌，比如大腸癌、肺癌，比如小細胞肺癌、腺癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、腎癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病，特別是AML(急性髓細胞白血病，acutemyeloidleukaemia)、神經膠質瘤、淋巴瘤和胚細胞瘤、敏感症、自體免疫疾病，例如，多發性硬化症、病毒和/或細菌感染。例如，本發明包括RNA和RL注射緩衝液或含乳酸鹽的RL注射緩衝鹽的用途，還包括RNA注射液的用途，用於基因治療和接種疫苗，例如，用於抗病毒或腫瘤接種，用於預防上述的疾病。本發明所述的"基因治療"是指引入功能基因到患病的細胞中恢復機體或細胞的失去了的功能，或通過相應的遺傳信息抑制受損的功能。例如，對於腫瘤抑制基因，例如，丟失p53基因或其只有少量表達時，可以以其mRNA的形式引入細胞內並插入到DNA中，並且最初表達不足的蛋白就能夠重新生成到生理上需要的量。本發明所述的腫瘤抑制基因的例子是p53TP53,RBl，APC,WT1,NF1,NF2，VHL,BRCA1，BRCA2,DCC，MEN1,MEN2，PTCH,p57/KIP2,MSH2,MLHl,FMSl,FMS2,MET,pl6/INK4a/CDKN2,CDK4，RET,EXTl,EXT2,EXT3，PTEN/MMAC1，ATM,BLM,XPB，XPD,XPA,XPG,FACC,FACA,SMAD4/DPC4,pl4Art(pl9Art),DPC4,E-CAD,LKB1/STK1,TSC2,PMS1,PMS2,MSH6,TGF-PtypeIIR,BAX，a-CAT,MADR2/SMAD2，CDX2，MKK4,PP2R1B,MCC,等等。本發明所述的接種是指以RNA的形式，尤其是以mRNA的形式，將遺傳信息引入到有機體中，特別是引入到有機體的一個/幾個細胞或組織中。如此給藥的mRNA在有機體中翻譯成目標分子(例如，肽、多肽、蛋白質)，也就是說，由mRNA編碼的目標分子被表達並觸發免疫反應。人們知道，抗原遞呈細胞(APC)在觸發免疫反應時起到專門的關鍵作用，因為它們是如此的唯一的細胞類型當激活後，所有的啟動抗原特異性免疫細胞的增殖所需的所有信號被觸發。本發明所述的接種可使用編碼抗原的RNA，特別是mRNA來進行，所述的抗原在腫瘤免疫接種時是腫瘤抗原，在接種對抗外來病原體時是外來抗原。本發明所述的腫瘤抗原是T-細胞定義的腫瘤抗原，例如，"癌/睪丸"("c朋cer/te勸y'朋^^e/^)抗原，例如，MAGE、RAGE、NY-ESO陽l，分化抗原(d!/^re/^/W/b"朋^rezi9)，例如，MART-1/Melan-A、酪氨酸酶(tyrosinase)、gp100、PSA、CD20，變異基因的抗原決定基(a/^gCT/ce/w'topeso/zm^^/ge/es)，例如，CDK4,caspase畫8，或癌胚抗原(0/coi^a/a/^扭e")，例如，CEA、AF。其它的腫瘤抗原有，例如，存在於T-細胞和B-細胞淋巴瘤中的腫瘤抗原CD5和CAMPATH-l(CDw52)，存在於非霍奇金B-細胞淋巴瘤(non-Hodgkin，sB-celllymphomas)中的CD20，月中瘤抗原CEA(carcinoembryogenicantigen)，茅佔液素，存在於實心腫瘤特別是上皮性腫瘤(乳腺、腸和肺)中的CA-125和FAP-a，TN蛋白(tenascin)，和還存在於成膠質細胞瘤(glioblastoma)中的金屬蛋白酶(metalloprotdnases)。進一步的腫瘤抗原是，例如，腫瘤抗原EGF(表皮生長因子)，存在於肺、乳腺、頭部和頸部以及T-細胞和B-細胞腫瘤中的pl85HER2和IL-2受體，腫瘤抗原SV40等。RNA，特別是mRNA，也可編碼多個這樣的抗原。因此，黑素瘤、癌、AML或神經膠質瘤可有效地得到控制，因為特定腫瘤的不同抗原的組合^r有極其廣泛的活動範圍。本發明的RNA特別是mRNA可進一步編碼免疫原f生蛋白。這樣的免疫原性蛋白可調節免疫反應的再激活。這樣的再^[活基於以下的發現幾乎每個有機體都有對某些外來分子(如蛋白質，尤其是病毒蛋白、抗原)的所謂的"記'["乙免疫反應"(memoryimmuneresponses)。這意卩未著，有機體在較早時已經被這樣的外來分子感染過，並且，對此外來分子(例女口，病毒蛋白)的免疫反應已經通過此次感染被觸發，此免疫反應就保存在""i己憶"中，也就是說被存儲起來。當有機體再次被同樣的外來分子感染時，免疫反應就被再次激活。根據本發明，這樣的免疫反應的再激活可通過接種包含有至少一個免疫原性蛋白的編碼區的RNA特別是mRNA來實現。優選的是編石馬一個或多個抗原並編碼一個或多個免疫原性蛋白的RNA，尤其是mRNA。本發明所述的免疫原性蛋白優選地是病毒的結構蛋白，特別是基質蛋白、殼蛋白和脂膜的表面蛋白。這樣的病毒蛋白的其它例子是腺病毒蛋白、鼻病毒(rhinoviruses)蛋白、冠病毒(coronaviruses)蛋白、逆轉錄酉每病毒(retroviruses)蛋白，特別優選的是B肝表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen)(下面以"HBS抗原"代表)和流感基質蛋白，特別是流感基質Ml蛋白。本發明進一步涉及RNA和上述的RL注射緩衝液或含乳酸鹽的RL注身寸緩衝液、或上述的RNA注射液在"體外"處理時增加RNA轉移和/或RNA翻i牽的用途，例如，用於基因表達分析或用於體外篩選，例如，通過HTS(高吞B土量篩選)。本發明進一步提供一種方法，用於增加寄助物中的RNA轉移和/或RNA翻譯，例如，用於治療和/預防癌或腫瘤疾病，例如，黑素瘤，如良性黑素瘤、皮膚黑素瘤，癌如大腸癌、肺癌如小細胞肺癌、腺癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、腎癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病，特別是AML(急性髓細胞白血病，acutemyeloidleukaemia)、神經膠質瘤、淋巴瘤和胚細胞瘤、敏感症、自體免疫疾病，例如，多發性硬化症、病毒和/或細菌感染，以及用於基因治療和/或接種，可選的用於抗病毒疫苗接種，用於上述疾病的預防，所述方法包括下述步驟a.)製備本發明的RNA注射液；b.)將步驟a得到的RNA注射液給藥到寄助物中。步驟a中RNA注射液的製備可按前述進行，也就是說，根據現有技術的l壬何方法進行，優選地，通過將RNA稀釋在RL注射緩衝液或含乳酸鹽的RL注射緩衝鹽中來實現。這裡所述的濃度比率也依賴上述的條件來選擇(例如，RNA注射液要注射到的寄助物，特別是哺乳動物，以及寄助物的健康狀態、年齡等)。RNA注射液可用例如注身寸器(例如，Sub-Q,BectonDickinson,Heidelberg,Germany)以任何合適的方式給藥，例如，皮內給藥、上皮內給藥、皮下給藥、靜脈內給藥、動脈內給藥、腹腔給藥、腹膜內給藥、結點內給藥(例如，給藥到淋巴結中)等。本發明所述的寄助物最好是從下列選出的哺乳動物小鼠、大鼠、豬、牛、馬、狗、貓、猿，特別是人。根據本發明製備的注射液還可用於使用RNA特別是mRNA進行的細胞的體外轉染。此體外轉染可適用於實驗室使用或作為生物體外基因治療的一部分，也就是說，將細胞從病人身上移除，包含在本發明的注射液中的RNA的生物體外轉染，然後重新移植到病人身上。轉染可藉助電穿孔的方法進行，可選地還可藉助電壓脈衝來實現，其場強不超過2到10kVcm—、並且脈衝持續時間是IO到200^is，電流密度至少有2Acm—2。然而，如果不是用來進行轉染的話，也可用1到100ms的脈衝。如果本發明的注射溶液是用於實驗室目的，所有的實驗室細胞系都能採用此方法用RNA轉染。對於生物體外基因治療來說，許多細胞類型可以用來轉染，尤其是初級人類血液細胞、多向潛能祖細胞和成纖維細胞、神經細胞、上皮細胞或肌細胞，以上給出的是示例，而不是為了限制。本申請中引用的所有參考文獻均完整地包括在本申請中。下列的圖和例子是為了進一步解釋本發明，而不是對本發明進行限制。圖1至圖5所示的試驗中，每種情況所示的包含有編碼螢火蟲(Pi^^2M/jra/Zs)螢光素酶的mRNA(圖4中100filPBS中的pDNA)的100|il緩衝液(緩衝液的成分在下面的材料1.注射緩衝液中給出)，被皮內注射到BALB/c小鼠13的耳翼。分析整個小鼠的耳的螢光素酶的活動。這以百萬螢光素酶分子表示。檢測範圍在圖中用標有數字的粗線表示。圖上的每個點展示了單只耳朵上的螢光素酶表達。圖上的短橫槓表示各組的平均值。針對各組給出了p^:，明顯不同於其平均值(根據Mann-Whitney檢驗)。在圖1、2和5所示的實驗中，注射後15小時，耳朵被切除。數據顯示每組有至少3個獨立的實驗。圖1比較了mRNA的不同注射緩衝液磷酸緩衝鹽(PBS)和HEPES-緩衝鹽(HBS)和含乳酸的RL注射緩衝液(RL)。lacZmRNA用作負控制。本發明顯示，稀釋在含乳酸的RL注射緩衝液中的mRNA具有比稀釋在HBS或PBS中的mRNA明顯更高的螢光素酶表達(pO.OOl)(圖1A)。圖2展示了RL注射緩衝液(含乳酸鹽和不含乳酸鹽，以及含轉或鉀和不含鈣或鉀)中不含鈣(-CaCl)、鉀(-KCl)、乳酸鈉(-NaLa)時對mRNA的吸收效率的影響。PBS和HBS與RL注射緩衝液或含乳酸鹽的注射緩衝液(含或不含鈣)之間的主要區別是不含乳酸鹽和鈣(在HBS或PBS中)。因此，研究一方面使用完全RL注射緩衝液(含乳酸鹽的RL注射緩衝液)，另一方面使用不含鈣或不含鉀或不含乳酸鹽的RL注射緩衝液配方，來比較編碼螢光素酶的mRNA的轉移和翻譯。這些研究顯示，不含乳酸鹽使螢光素酶的表達可與使用完全RL注射緩衝液(含乳酸鹽的RL注射緩衝液)時的表達相當。但是，RL注射緩衝液或含乳酸鹽的RL注射緩衝液中不含鈣時，顯著地降低RNA的轉移效率(p=0.004)至與PBS和HBS相當的水平。圖3和圖4展示了直接體內mRNA翻譯的動力學。進行了RNA在本發明的含乳酸鹽的RL中和DNA在PBS標準緩衝液中的平行動力學實驗並進行比較。mRNA(在含乳酸鹽的RL注射緩衝液中)(圖3)或pDNA(在PBS中)(圖4)在注射10天之後的翻譯被記錄下來並展示在圖中。在兩個測試(RNA和DNA)過程中，在活的小鼠上的螢光素酶活性被記錄下來。具有代表性的耳朵的結果在圖中示出。在注射(編碼螢光素酶)溶在含乳酸鹽的RL注射緩衝液中的mRNA之後檢測到的螢光素酶的表達很早就達到了其最大值(17個小時)，並且9天之後就再也檢測不到(圖3)。比較起來，在PBS中注射(編碼螢光素酶)pDNA可導致較晚的蛋白質表達，注射3天後才達到其最大值並且持續到超過9天(圖4)。這些結果再次確認了本發明的RL注射緩衝液的效率，而且確認了RNA遠比DNA更適合用作寄助物特別是哺乳動物中瞬時基因表達的載體。RNA—方面很快地表達，另一方面瞬時表達，這意味著目標基因表達可被較早地觸發並持續有限的時間，相應地以更有目標和分化的方式。這些研究證實了成功的RNA轉移的增加以及隨後的有效翻譯。圖5展示了不同量的mRNA對螢光素酶表達的影響。這些實驗是為了更精確的確定特別是在臨床應用中使用的RNA在含乳酸鹽的RL注射緩衝液中的劑量，結合考慮量和持續時間。為此目的，增加的RNA量被注射到多個小鼠體內。隨著mRNA的量增加到5昭(100pl注射體積)，檢測到螢光素酶表達的增加。超過5pg的劑量不能進一步增加表達。在相應的人體的實驗中(圖中沒有示出)，使用了120嗎的mRNA的劑量，當增加到200嗎時，導致表達增加。人體使用的200昭的mRNA，與小鼠的5昭劑量相比，可由注射部位的大小來獲得，即人體大約有小鼠的40倍大小。在解釋了背景和研究可能導致的後果和獲得同意之後，人體實驗是在健康的志願者身上進行的。關於不同時間的劑量，應該注意到，mRNA的翻譯是瞬時發生的(如圖3所示，在12小時後達到最大值並且在9天之後便檢測不到)並且因此被調節。因此，為了持續、均一地翻譯外來分子(蛋白質)，要大約每天、每兩天或每3天重複注射(取決於一些因素，如外來分子或mRNA要注射入的有機體)是合適的。圖6再次顯示了CaCl2對螢光素酶活性的影響。為此目的，製備了一系列的CaCl2螢光素酶溶解緩衝液(最終濃度在圖中示出)，並且相同量的重組螢光素酶蛋白被加到所有的樣本中(最終濃度大約是4.7pM)。混合物的光發射用光度計測量(加入ATP和螢光素後)。CaCl2濃度對螢光素酶活性的影響根據下式計算出%相對螢光素酶活性(RLA)=(具有確定的CaCl2濃度的樣本的RLA—純溶解緩衝液的RLA)/(不含CaCl2的樣本的RLA—純溶解緩衝液的RLA)X100%較高濃度的C,離子(大約2mM以上)的出現不能增加螢光素酶的活性。圖7再次展示了CaCl2濃度對mRNA在體內轉移的影響。使用了各種濃度的含乳酸鹽的RL注射緩衝液，以製備具有相同量的用於編碼螢火蟲螢光素酶的mRNA(20(ig)的RNA注射液(IOO|il)，但具有不同的同滲容摩(osmol.)。這些RNA注射液被注射到BALB/c小鼠的耳緣。15小時後，處死小鼠，製備耳的溶解產物。計算出的每隻耳產生的螢光素酶分子總量、各組的平均值(帶數字的橫槓)、每組的大小(n)和測試的檢測範圍(帶數字的粗線)在圖中示出。結果發現，體內的mRNA的有效轉移和接著的有效翻譯需要的最小濃度是170mOsm。圖8A-E展示了表達體內補充的mRNA的細胞的特徵。20ng用於編碼^&c力e/v'c力/aco//(大腸桿菌)(3-半乳糖苷酶((3-galactosidase)的mRNA，稀釋到包含100^1RL含有乳酸鹽的注射緩衝液的RNA注射液總量中，被注射到小鼠體內，14小時後，處死小鼠，切除耳朵，製備冷凍切片。圖8A和8C至犯用顏色示出其特徵。更進一步，研究了注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)中的RNA的直接表達。為此目的，定義了吸收並翻譯RL注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)中轉移的外源性RNA的細胞類型(也參見例5，圖8A-E和類似的，圖11、12、16和17)。之後，在本發明的基於mRNA的免疫接種的範圍內，分析了如何用轉移到免疫系統的確定的目標細胞中的RL注射緩衝液(含或不含乳酸鹽)內的外源性RNA來觸發免疫反應。圖8A展示的實驗中，每個第五樣本切片用含X-gal溶液染色。在連續的20)am厚的冰凍切片中檢測到多達10個P-半乳糖苷酶陽性細胞。表達區域，也就是說，P-半乳糖苷酶陽性細胞(箭頭所示)，覆蓋了耳的縱向和徑向的方向l至2毫米，並且位於耳肌肉的表皮層和軟骨層之間的較窄的層上。本發明也研究了APC是否用直接吸收和自體翻譯轉移的mRNA或吸收另外的細胞轉移的RNA的翻譯產物(所謂的"交叉遞呈(crosspresentation)")來檢測外來抗原。由於細胞的局部化、它們的形狀和它們的MHC第二類基因型，可能得出結論在注射部位吸收和表達外來的裸露的mRNA的主要是肌肉細胞和/或成纖維細胞(圖8A)。結果對應於上述的被其他細胞翻譯的抗原的"交叉遞呈"。此程序可同樣用來解釋抗核酸疫苗編碼蛋白的抗體的形成。根據本發明，首次可能確定相應的免疫反應的觸發通過所謂的"交叉觸發"產生，在其中，肌肉細胞或真皮細胞(成纖維細胞)吸收並表達轉移的RNA,並且APC是被這些細胞激活的。圖8B的柱狀圖展示了連續的切片中P-半乳糖苷酶陽性細胞的數目。每個柱代表一個切片。圖8C到8E的實驗中，每個第五樣本切片被染色，即用於MHC第二類表達(用Alexa546免疫螢光染色檢測出，綠色的)和P-半乳糖苷酶表達(用洋紅-gal(magenta-gal)染色檢測出，藍紫色的)。左邊一列的圖顯示了洋紅-gal染色單獨與藍紫色的P-半乳糖苷酶陽性細胞二(深)暗區。中間和右邊的圖中，洋紅-gal染色(在中間和右邊圖中所示的感興趣的區域)和單獨的MHC第二類染色(桔色=中間圖中的亮區)(綠色=右邊圖中的亮區)的重疊。如圖所示的，絕大多數的(3-半乳糖苷酶陽性細胞清楚地表現出是MHC第二類陰性的。圖9A-B展示了在小鼠和人體身上裸露mRNA的體內轉移。製備編碼螢光素酶的mRNA並將其溶解在含有RL注射緩衝液的RL注射液中。檢測範圍在圖中用帶數字的粗線表示。圖9A所示的實驗中，總量100fi1、含有20|igmRNA的注射液注射到小鼠的耳部肌肉中。注射後14小時，處死小鼠，耳部細胞被溶解，並且研究溶解物的螢光素酶的表達。計算每隻耳朵的螢光素酶分子數量(重組的螢光素酶用作標準)。每組的數據來自至少3個獨立的實驗。圖9B所示的實驗中，總量200^1、含相同mRNA(120|ig)的注射液注射到人的皮膚中(到志願者的腿部)。16小時後，在局部麻醉下，取下直徑為2mm的活組織進行檢查，也就是，從注射部位的中間("mRNA")和離注射點一定距離("假的(mock)")。螢光素酶的活性只能在注射點的中間檢測到。圖中示出了兩個獨立實驗中的一個。這些結果顯示，裸露的mRNA直接轉移到人的皮膚中。因此，本發明允許在人體進行有效定向的基於mRNA的疫苗接種。圖10A-D展示了注射的含乳酸鹽的RL注射緩衝鹽中的mRNA的完整性和翻譯能力。其完整性用甲醛-瓊脂糖凝膠電泳來檢測(1.2%w/v)。為此目的，l嗎的編碼螢火蟲螢光素蛋白酶(luc,1.9kB,圖10A)或編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶(lacZ，3.5kB，圖10C)的mRNA被分離出來。沒有檢測到在各自的注射緩衝液(原料溶液)中稀釋之前(注射之前)和在各自的注射緩衝液稀釋之後的mRNA的完整性有何不同。相比而言，當從注射器中收集RNA注射液的殘液進行檢測時，可以檢測到mRNA的看得見的、完全的降解(在注射之後)。由於注射器與小鼠或人體組織的接觸，這些殘液顯然被核糖核酸酶所汙染。注射的mRNA的翻譯能力用含10嗎的mRNA的BHK21細胞的電穿孔來檢測。用來控制lO嗎不相關的mRNA或非mRNA(假的)。這些細胞隨後被溶解且用光度計研究它們的螢光素酶活性(圖IOB)，或用X-gal染色並且用光學顯微鏡研究它們的螢光素酶活性(圖IOD)。圖ll展示了在細胞水平的mRNA轉移的識別。該圖展示了小鼠的圖片。圖中，外側(背側)對觀察者可見。含乳酸的RL注射緩衝液中的mRNA被注射到小鼠的耳部肌肉。製備出耳朵的連續橫切面(1、2、3、4)。這些切面收集在各種裝置中(1、2、3、4)，在空氣中乾燥並存儲在-20。C直到進行各種染色操作。圖12A-C展示了在細胞水平的mRNA轉移。含乳酸鹽的RL注射緩衝液中的5pg編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶的mRNA被注射到小鼠耳朵部位。注射後15小時，耳朵被植入到TissueTekO.C.T介質中，並製備60|im厚的冰凍切片。切片用X-gal染色一整夜。圖12A展示了mRNA轉移陰性耳朵的冰凍切片。沒有lacZ陽性細胞是可檢測出的。圖12B展示了概貌。圖12C展示了mRNA轉移陽性耳朵的細節視圖。lacZ陽性細胞呈深藍色，用箭頭標示出。圖13展示了AlexaFluor546信號與洋紅-gal陽性細胞的顏色的相容性。為了確定是否可能在洋紅-gal陽性細胞中檢測到AlexaFluor546，用eGFPmRNA(eGFP=enhancedgreenfluorescenceprotein,增強型綠色螢光蛋白)或lacZmRNA的組合來轉染BHK細胞。下列的被轉染細胞的組合被分析-僅用eGFPmRNA或lacZmRNA進行單獨的轉染-如上的被單獨轉染的細胞(eGFP/lacZ)的混合物-被雙重轉染的細胞(eGFP+lacZ)該細胞先用帶AlexaFluor546檢測的抗-eGFP的抗體染色，然後用洋紅-gal染色。經洋紅-gal軟色的陽性細胞(表達lacZ)通過廣角光學顯微鏡檢測到(頂行)，經AlexaFluor546染色的陽性細胞(表達eGFP)通過螢光顯微鏡檢測出(中間行)。為了得到細胞之間的相對位置的準確結果，將以上兩種檢測的結果重疊(底行)，儘管此圖中的AlexaFluor546信號覆蓋了光學顯微鏡的圖象。不能排除提供給APC的mRNA的直接吸收和自體翻譯有發生並足夠引起免疫反應。在某些APC中，輕微的或不完全的不能檢測到的翻譯可能己經發生，並且(在不完全翻譯的情況下)可能影響外來抗原的處理和遞呈。圖14A-B展示了冰凍切片的第二類MHC染色的特徵。總量為10(^1的含乳酸鹽RL注射液中的20(ig編碼大腸桿菌p-半乳糖苷酶的mRNA被注射到體內。注射後14小時，處死小鼠，切除耳朵，製備冰凍切片。該冰凍切片首先用抗第二類MHC的抗體染色(圖14A)，或用對應的同型對照抗體(isotypecontrolantibody)軟色(圖14B)，並通過用Alexa546進行的免疫螢光染色檢驗法進行檢測。然後，該冰凍切片用洋紅-gal染色(用於(3-半乳糖苷酶表達)。圖中顯示出了洋紅-gal染色(左列)，第二類MHC染色(中間列，lacZ陽性細胞的位置用輪廓線表示出來)，和兩種染色的重疊(右列，lacZ陽性細胞用輪廓線表示出來，第二類MHC陽性細胞在圖中用亮區表示)。圖15展示了X-gal染色和AEC染色陽性細胞的相容性。為了確定X-gal沉積是否與AEC陽性細胞相容，BHK細胞與eGFPmRNA和lacZmRNA共同轉染。細胞用AEC(紅色陽性細胞，表達eGFP)和X-gal溶液(藍綠色陽性細胞，表達lacZ)或用AEC和X-gal的組合來進行抗-eGFP免疫染色。染色後的細胞用廣角顯微鏡來分析。雙陽性細胞呈黑色(黑色箭頭)。當各次染色足夠強時，很難單獨地區分染色後的陽性細胞(綠色和紅色箭頭)，因而傾向於呈黑色。圖16A-B展示了第二類MHC陽性細胞和mRNA轉移陽性細胞的協同定位(co-localisation)。含20嗎編碼(3-半乳糖苷酶的mRNA的lOO)il含乳酸鹽RL注射液被注射到體內。注射後14小時，處死小鼠，切除耳朵，製備冰凍切片。該冰凍切片首先用抗第二類MHC的抗體(圖16A+B)或用對應的同型對照抗體(圖16C)(用Alexa546染色法檢測)進行染色，然後用X-gal進行染色(用於(3-半乳糖苷酶表達)。對mRNA轉移為陽性的細胞呈現出藍綠色，對第二類MHC為陽性的細胞呈紅色，雙重陽性的細胞呈現出黑色。mRNA轉移陽性細胞用箭頭標示出來，與第二類MHC表達無關。圖17展示了mRNA轉移和耳部肌肉的形態。含20pg編碼(3-半乳糖苷酶的mRNA的100^1含乳酸鹽RL注射液被注射到體內。注射後14小時，處死小鼠，切除耳朵，製備冰凍切片。該冰凍切片首先用X-gal(用於p-半乳糖苷酶表達)染色，然後用蘇木精和伊紅(四溴螢光素)染色。對於mRNA轉移為陽性的細胞用箭頭標示出來，並靠近軟組織層。具體實施方式材料1、注射緩衝液使用了下述的緩衝液-2x磷酸緩衝鹽(PBS)(PBS:274mM氯化鈉，5.4mM氯化鉀，20mM磷酸一氫鈉，4mM磷酸二氫鉀，溫度20.8。C，pH7.3)-2xHEPES緩衝鹽(HBS)(HBS:300mM氯化鈉，20mMHepes,溫度20.8。C，pH7.4)-lxRL注射緩衝液(不含乳酸鹽)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含82.2mM氯化鈉，4.3mM氯化鉀，1.44mM氯化鈣)-lxRL注射緩衝液(含乳酸鹽)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含102.7mM氯化鈉，5.4mM氯化鉀，1.8mM氯化鈣，20mM乳酸鈉)-lxRL注射緩衝液(含乳酸鹽、不含氯化鈉)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含4.3mM氯化鉀，1.44mM氯化鈣，22.4mM乳酸鈉)-lxRL注射緩衝液(含乳酸鹽不含氯化鉀)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含82.2mM氯化鈉，1.44mM氯化鈣，22.4mM乳酸鈉)-lxRL注射緩衝液(含乳酸鹽不含氯化鈣)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含82.2mM氯化鈉，43mM氯化鉀，22.4mM乳酸鈉)當使用2xPBS和2xHBS時，所有的成分溶解在水中，調節pH。焦碳酸二乙月旨(DEPC,Sigma,Schnelldorf,Germany)加至濃度為0.1%(v/v)。緩衝液在37"下放置1小時以上。然後將緩衝液高壓滅菌。含乳酸鹽的lxRL注射緩衝液用四種不同鹽(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉)的20x儲備溶液來製備。類似地，lxRL注射緩衝液用三種不同鹽(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣)的20x儲備溶液來製備。在進一步的實施例中，略去氯化鈉或氯化鉀或氯化鈣而不補償被降低的同滲容摩。這些含乳酸鹽不含氯化鈉、氯化鉀或氯化鈣的的RL注射緩衝液，也用20x儲備溶液來製備。除了乳酸鈉的外消旋酸鹽(Fluka，Schnelldoif,Germany)外，每種成分都經DEPC和高壓滅菌處理，如對2xPBS和2xHBS所描述的那樣。所有的緩衝液和緩衝成分都通過將lx緩衝液中的lpgmRNA在37T:下培養2小時，來檢測核糖核酸酶的活性。用甲醛-瓊脂糖凝膠電泳的方法來分析mRNA時，使用沒有觀察到降解的緩衝液。2、小鼠所有的動物實驗都根據實驗室和國家指導方針來進行。使用的年齡為8周到15周的雌性BALB/c小鼠來自於德國Sulzfeld州的査爾斯河(CharlesRiver,Sulzfeld,Germany)。在皮內注射之前，小鼠被麻醉並且耳部肌肉用異丙醇進行了處理。為了分析mRNA的吸收和翻譯，在特定的時間後處死小鼠，切除耳朵，用刀片剃去麻煩的毛髮。3、人人體實驗在健康的男性志願者身上進行，向他們介紹了研究的背景和可能的結果，並徵得他們的同意。例l:製備核酸mRNA"加帽"的mRNA通過利用T7RNA聚合酶(T7-OptimRNAkits,CureVac,Ttibingen,Germany)進《亍體夕卜"徑流轉錄(run-offtranscription)"來帝J備。此mRNA的編碼序列(從Acc.U02445克隆出的大腸桿菌P-半^^糖苷酶[lacZ]或從Acc.U47295克隆出的螢火蟲螢光蛋白酶[luc])在其3'端用a球蛋白未翻譯區和人工的聚A尾部(n=70)側面相接。小鼠實驗中，mRNA用苯酚/氯仿/異戊基醇提取並用氯化鋰沉澱。然後將mRNA重新懸浮在水中，用分光光度計在260nm測量產量。最終，mRNA用醋酸銨沉澱並以無菌的方式重新懸浮在水中。pDNA不含內毒素的pCMV-螢光素酶DNA用去內毒索的質粒提取試劑盒(EndoFreePlasmidMaxiKit)(Qiagen，Hilden，Germany)來製備。pDNA用醋酸銨沉積並最後以無菌方式重新懸浮在水中。pCMV-螢光素酶質粒通過將來自pGL3(Acc.U47295)的XbaI-(用Klenow片段鈍化)HindIII片段插入到pCMV-HB-S(Acc.A44171)的NsiI-(用Klenow片段鈍化)HindIH-消4fc質粒的方式來修飾。pDNA的報導基因受控於CMV啟動子。儲備溶液儲備溶液通過將mRNA或DNA稀釋在無菌水中來製得並用分光光度計(以260、280和320nm)來確定濃度和純度。質量控制對於所有的核酸樣本，其濃度用分光光度計確定，並且其完整t生用甲醛-瓊脂凝膠電泳(mRNA)或限制性消化和TBE-瓊脂凝膠電泳(DNA)的方法來檢驗(圖10)。除了完整性之外，所有核酸樣本的翻譯能力用電穿^^BHK21細胞來分析。為此目的，200fil的含10)Lig核酸的PBS中的1至3百萬個細胞在0.4cm試管中以300V和150pF進行電穿孔。電穿孔後8到24小時後，用適當的方法(X-gal染色或螢光檢測)分析經轉染的細胞的蛋白質表達(圖10)。對於體內實驗，只有在BHK21細胞中呈現了蛋白質表達並在凝膠電泳中有合適的完整性的核酸樣本才被注射。例2:RNA注射溶液的製備對於HBS和PBS來說，mRNA在lx濃度的緩衝液中稀釋。對於含或不含乳酸鹽的RL注射緩衝液和其各種變化(不含Ca2+,K+,Na+中的一個)(成分和濃度參考材料l.注射緩衝液)，mRNA稀釋在0.8x濃度的緩衝液中。除非特別提到，否則含20)agmRNA的100注射緩衝液用於每隻鼠耳。為了去除mRNA中的二級結構，RNA注射緩衝液在8(TC加熱5分鐘。然後，將該溶液放在冰上5分鐘。最後，將RNA注射液吸到Sub-Q(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)注射器中。每次注射用不同的注射器。質粒DNA(pDNA)稀釋在lx濃度的PBS中。例3:體外檢測螢光素酶的活性為了體外檢測螢光素酶的活性，製備了組織溶解產物。為此目的，該組織用杵和研缽在液氮下粉碎，殘留的小塊用800nl溶解緩衝液(25mMTrisHC1,2mMEDTA,10%(w/v)甘油，1%(w/v)氚核X-100加上新加的2mMDTT和lmMPMSF)均勻化。在掌上離心機上離心(IO分鐘，13000轉/分,4。C)後得到勻漿上清液。llOpl此溶解產物的等分試樣在-80。C儲存。為了測量螢光素酶的活性，等分試樣在冰上解凍，50^1溶解產物的光發射用光度計(LB9507,Berthold，BadWildbad,Germany)測量15秒。測量之前，光度計自動加入300)al緩衝液A(25mM氨基乙醯氨基乙酸，15mM硫酸鎂，5mM新加入的ATP，pH7.8)和緩衝液B(250)iM水中的螢光素)到溶解產物中。為了標準化，在所有的測量中使用了一系列的重組螢光蛋白稀釋液(QuantiLum,Promega，Madison,USA)。用此標準方法，計算出每次單獨測量的螢光素酶分子的量。對於每份溶解產物，螢光素酶的活性在不同的曰期兩次測量，計算出螢光素酶的平均活性。在所有具有高於檢測極限的螢光素酶活性的溶解產物，螢光素酶分子的量的變化係數(n=4)低於10。％。此檢測極限(在圖中用帶數字的粗線表示)用溶解緩衝液的測量值加上這些值的3倍標準偏差的平均值來計算(n=80)。例4:體內生物發光檢測為了檢測活的動物體上注射的螢光素酶，在注射入核酸後一段特定時間後，麻醉小鼠。小鼠被分成3個不同的組在第I組小鼠中，100plRL注射緩衝液被注射到左耳，並且含在100)LilRL注射緩衝液中的20)ig編碼螢光素酶的mRNA被注射到左耳。在第II組小鼠中，含20iag編碼螢光素酶的mRNA的100plRL注射緩衝液被注射到左耳和右耳。在第III組中，lOOplRL注射緩衝液被注射到右耳，含在lOOjalRL注射緩衝液中的20pg編碼螢光素酶的mRNA被注射到左耳。然後小鼠被i.p.注射含20mg/ml螢光素(Synchem,Kassel,Germany)的200WPBS(過濾除菌的)。螢光素注射後5分鐘，收集20分鐘內小鼠的光發射。為此目的，小鼠被放到預先加熱至37X:的黑盒子中(第I組在左側，第II組在中間，第III組在右側)。盒子裝有Aequoria全景成像照相機(Hamamatsu，Japan)。光發射以假彩色圖象顯示，與小鼠在正常光線下的灰度圖象相重疊。類似地，還用含20嗎編碼螢光素酶的mRNA的含乳酸鹽RL注射緩衝液、不含氯化鈉而含乳酸鹽的RL注射緩衝液和不含氯化鈣而含乳酸鹽的RL注射緩衝液進行相同的實驗。例5:卩-半乳糖苷酶活性和組織結構刮乾淨了的鼠耳被切除，植入在含Tissue-TekO.C.T化合物(Sakura,Zoeterwuode，Netherlands)的介質中並儲存在-80。C。從這些小塊中切下的20個連續的20|am厚的橫向冰凍切片被分成五組放置在SuperFrost⑧+標本固定器(Langenbrinck，Emmendingen,Germany)上(圖11)，一組內兩個切片之間的垂直距離大約是100pm。然後切片在空氣中乾燥並儲存在-2(TC，直到它們被染色。為了對轉移了的mRNA(編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶)已被吸收並已被翻譯的區域進行第一次篩選，第一組切片用X-gal染色。為此目的，標本固定器暴露在室溫中，用ImmEdge筆(Vektor,Burlingame，USA)勾出輪廓。然後，切片用含2%甲醛的PBS來固定15分鐘。然後用PBS將標本固定器洗3次，2分鐘，接著在含X-gal染色溶液(1mg/ml剛加入的X-gal，5mM氰鐵酸鉀，5mM氰亞鐵酸鉀，1mM氯化鎂，15mM氯化鈉，60mMfl酸氫二鈉，40mM磷酸二氫鈉)的潮溼箱中37。C下染色一整夜。衝洗標本固定器2次、2分鐘來終止染色，並用Hydro-Matrix(Micro-Tech-Lab，Graz,Austria,用水稀釋了二次)介質來處理它們。為了得到有關組織形態的信息，對於另一組切片，X-gal染色與蘇木精-伊紅(HE)染色相結合進行。為此目的，在X-gal染色之後，切片在PBS中衝洗3次，每次2分鐘，並再在雙蒸水裡面洗5分鐘，然後，用Mayershaemalaun(Merck，Darmstadt,Germany)進行二次染色。該染色處理在活水下進行10分鐘，然後，在水中用0.1%伊紅Y(Sigma,Schnelldorf,Germany)進行10分鐘的對比染色。然後在雙蒸水中快速地衝洗，終止染色，然後用遞增濃度的酒精脫水(2分鐘80%乙醇，2分鐘95%乙醇，2分鐘100%乙醇，5分鐘100%二甲苯)。最後，乾燥了的切片用Roti⑧-Histokitt(Roth,Karlsruhe，Germany)介質處理。.為了確定用威NA轉染的目標細胞是否是抗原遞呈細胞，對MHC第II類分子(用APC表達)和mRNA轉移(與(3-半乳糖苷酶的表達有關)進行雙染色。對MHC第II類分子進行免疫組織化學和免疫螢光檢測。對於兩種方法，在所有的3個步驟之間，切片都用PBS衝洗3次，每次2分鐘。對於免疫組織化學檢測程序，切片用PBS內1%(w/v)甲醛(Fluka)來固定。然後用純的丙酮浸泡30秒去除油脂。之後，立即在室溫下用含4%山羊血(VektorLaboratoriesInc.,Burlingame,CA)禾卩50|ag/ml抗生素蛋白的PBS進行阻斷(blocking)。剩餘的生物素結合位點用50lag/ml生物素(AppliChem,Darmstadt,Germany)阻斷，同時用單克隆抗體2G9(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)或合適的同型對照抗體(大鼠IgG2a，R35-95,BectonDickinson,Heidelberg,Germany)染色MHC第II類分子，每種情況下都稀釋成l嗎/ml(均在PBS中)。之後，在室溫下用生物素化的山羊/抗大鼠IgG(3pg/ml)媒介和2X小鼠血清(CCPraNeustadt,Germany)在PBS中將切片培養30分鐘。然後加入ABC複合體(PBS中的1:100的反應物A禾QB)(VektorLaboratoriesInc.,Burlingame，CA)，在室溫下維持30分鐘。用剛製備的已通過0.45pm過濾器過濾的3-氨-9-乙基咔吧唑(3-amino誦9-ethylcarbazole，AEC，Sigma)基質溶液(0.5mg/mlAEC，0.015%過氧化氫,50mM醋酸鈉，pH5.5)來檢驗MHC第II類分子染色的完成。底物反應通過用水衝洗5分鐘兩次並用PBS衝洗5分鐘3次來終止。如上所述那樣，接著進行X-gal染色。免疫螢光檢測也使用了類似的染色方法。在丙酮處理步驟之後，切片在室溫下在阻斷緩衝液(PBS中1%的牛血清白蛋白)中阻斷50分鐘。然後將切片用在阻斷緩衝液中稀釋至1pg/ml的原發抗體(2G9或同型對照抗體)培養40分鐘。然後，在室溫下用AlexaFluor546山羊/抗大鼠IgG(1:400，分子探針，Leiden，Netheriands)在阻斷緩衝液中培養40分鐘。最後，進行洋紅色-gal染色。為此目的，染液中的X-gal用0.1mg/ml的洋紅色-gal(Peqlab,Erlangen,Germany)來代替。切片用帶有AxiocamHRc照相機和Axiovision4.0軟體的Zeiss(Oberkochen,Germany)Axioplan2顯微鏡來進行分析，併線性調節照片的顏色和對比度。例6:人體的RNA轉移和翻譯此實驗在健康的男性志願者身上進行。注射部位被刮去毛髮，消毒並用RnaseZap(Ambion,Austin,USA)溶液進行了處理。然後，在一組中注射0.8xRL注射緩衝液中的120嗎mRNA，總量為200pl。在其它組中，用下列RL注射緩衝液代替-不含氯化鈉含乳酸鹽的RL注射緩衝液，-不含氯化鉀含乳酸鹽的RL注射緩衝液，-不含氯化鈣含乳酸鹽的RL注射緩衝液。注射後15小時，局部麻醉狀態下取直徑4mm的活組織(模壓取出)。活組織在液氮中迅速冷凍，並如上描述的那樣進行製備(例3)。研碎了的活組織重懸在600^1消化緩衝液中。統計評估兩個不同組的平均值採用"非參數曼-惠特尼秩和檢驗(non-parametricMann-Whitneyranksumtest)"來進行比較。p值<0.05被認為是顯著的差異，並且在圖中示出。例7:對各種染色處理的評價為了識別出在體內吸收並表達mRNA的細胞類型，使用了組織學處理，使得可以將mRNA的檢測與細胞類型特異性染色相結合。因為mRNA的轉移不能用螢光探針檢測出，因而執行了一種處理，在其內，編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶的mRNA與各種靛青染料(X-gal或洋紅-gal)相結合使用。1、B-半乳糖苷酶檢測系統的特別特徵為了確保靛青染色處理中所有的細胞都在單層中呈現，製備了小鼠耳的薄切片。考慮到小鼠耳部肌肉的形態結構(大約0.5mm至1mm厚的薄層)和只可用冰凍切片的事實(p-半乳糖苷酶在製備石蠟切片所需的某些步驟中被熱失活)，以及需要儘可能多的高質量的切片的需求，製備這些切片事實上很困難。儘管如此，也可能製備出幾組厚度為20|am的高質量的切片。兩種不同的染料用來檢測P-半乳糖苷酶的活性。X-gal(陽性細胞被染成藍綠色)的結果比用洋紅-gal(陽性細胞被染成紫羅蘭色)具有更好的對比度。然而，同時，非特定的背景染色，例如，由於毛囊引起的染色，在X-gal染色中很易見到。儘管如此，清楚地區分mRNA的轉移也是可能的。對于洋紅-gal染色來說，看不到非特定的背景染色。2、靛青和免疫組合染色的要求將mRNA轉移染色(靛青染料)和特定細胞特定的標記物染色(特定抗體)相結合，需要對固定劑和組合染色(靛青染色包括在37"C下培育14小時)的順序進行一些適應性修飾。先用丙酮固定再用抗體染色，可得到最好的抗體染色結果(對第II類MHC分子)。相反，首先用甲醛和戊二酸的混合物固定在進行靛青染色，可得到(3-半乳糖苷酶活性的最佳結果。考慮到環境的各種變化，採用了如下步驟用甲醛固定但不用戊二醛，然後進行抗體染色。不用戊二醛是因為雖然它對靛青染色有輕微的影響，但它會大大地增加組織的自身螢光。用甲醛來固定是由於下列原因1、比用丙酮可更好地保護組織的形態；2、靈敏強烈的靛青染色需要用甲醛固定；並且3、用甲醛固定時抗-MHC第II類抗體染色的質量仍然是可接受的。然後在純丙酮中進行短暫的培養來去除油脂和脂肪。使用水溶性的介質時，這可得到更好的質量(很少或沒有氣泡)。最後，當首先進行此染色時，可得到高質量的抗體染色。染色順序(甲酲固定)只對靛青染色的質量有輕微的影響。3、在靛青和免疫組合染色中染料的相容性兩種不同染色的組合不僅需要兩種方法中各種步驟的相容性，也需要用於檢測的探針的相容性。原則上，免疫染色可使用沉澱染料(酶探針)或螢光染料(標記的探針)。為了將靛青染料和沉澱染料組合起來，採用X-gal和AEC。雙陽性細胞在此染色中呈現出黑色(圖158)。很難區分高強度染色了的各個陽性細胞。因此，最好將洋紅-gal與螢光染料AlexaFluor546組合。用洋紅-gal來代替X-gal是基於兩個原因1、洋紅-gal染色的強度更弱(甚至當染料加到飽和量時)，2、洋紅-gal陽性細胞的顏色與螢光染料AlexaFluor546發射的波長對應得更好。兩個因素使AlexaFluor546螢光信號的淬熄(quenching)降到最低程度。此染料組合實際上允許兩個信號的檢測(圖13)，至少當靛青染色不是太強時(這便是切片中mRNA轉移陽性細胞的情況)。參考文獻1.UlmerJ.B.,Oot:(9—.2001，4:192-1972.J.A.Wolffe"/"5c/e薦247,1465-1468(19卯).3.H.L.Robinson,L.A.Hunt,R.G.Webster,Wcc/he11,957-960(1993).4.J.B.Ulmere"/"5t/e刀ce259,1745-1749(1993).5.J.A.Wolffe"7"5W認e247，1465-1468(1990).6.D.Boczkowski,S.K.Nair,D.Snyder，E.Gilboa，/~.Mec/-184,465-472(1996).7.J.P.Carralote"/.，Ce//AfoLL//e(2004).8.R.M.Cornye"/，C露er勉55,1397-1400(1995).9.R.D.Granstein，W.Ding,H.Ozawa,//露W",ato/114,632-636(2000).10.I.Hoerr,R.Obst,H.G.Rammensee,G.Jung,///77細"0/30,1-7(2000).ll丄Donnelly,K.Berry，J.B.Ulmer,/"〃i^扁.to/.33，457-467(2003).12.D.M.Klinmane"/"，—erS，h.7ffl層，a幼o/.19,245-256(1997).13.RForg，P.vonHoegen,W.Dalemans,V.Schirrmacher,GeneTher.5,789-797(1998).權利要求1、一種RNA和包含鈉鹽、鈣鹽和可選的鉀鹽的水性注射緩衝液在製備用於增加RNA轉移到寄助物和/或寄助物內RNA翻譯的RNA注射液中的用途。2、根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液包含具有從下組中選出的陰離子的鹽氯化物、碘化物、溴化物、氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽，特別地所述注射緩衝液包含NaCl、CaCl2和可選的KC1作為鹽。3、根據權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液包含至少50mM氯化鈉(NaCl)、至少0.01mM氯化l丐(CaCl2)、和可選的至少3mM的氯化鉀。4、根據權利要求1至3所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液包含50mM至U800mM、較優為60mM到500mM、更優為70mM到250mM、尤其較優為60mM到110mM的氯化鈉(NaCl),O.OlmM到100mM、較優為0.5mM到80mM、更優為1.5mM到40mM的氯化鈣(CaCl2)，以及可選地3mM到500mM、優選為4mM到300mM、更優地為5mMto200mM的氯化鉀(KC1)。5、根據權利要求1至4中任意一項所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液進一步包含乳酸鹽。6、根據權利要求1至5中任意一項所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液不含緩衝系統，例如HEPES、tris/HCl、Na(K)2HP04/Na(K)H2P04等。7、根據權利要求1至6中任意一項所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液不含單糖、二糖或多糖。8、根據權利要求1至7中任意一項所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液含至少50mM的氯化鈉(NaCl)、至少O.lmM的氯化鈣(CaCl2)、至少15mM的乳酸鹽和可選的至少3mM的氯化鉀(KC1)。9、根據權利要求8所述的用途，其特徵在於，所述注射緩衝液包含15mM到500mM的乳酸鹽，更佳地包含15mM到200mM的乳酸鹽，最好含15mM到100mM的乳酸鹽。10、根據權利要求1至9中任意一項所述的用途，其特徵在於，所述RNA是rRNA、tRNA、siRNA或最好是mRNA。11、根據權利要求1至10中任意一項所述的用途，其特徵在於，所述RNA是裸露RNA，特別是裸露的mRNA;或者是與聚陽離子結合的RNA特別是m腦A。12、根據權利要求ll所述的用途，其特徵在於，所述RNA特別是mRNA與魚精蛋白相結合。13、根據要求10至12中任意一項所述的用途，其特徵在於，mRNA具有至少一種自然或非自然發生的修飾，所述修飾從以下方式中選擇增加mRNA的編碼區內的G/C含量而不改變編碼胺基酸序列；引入至少一種核糖核苷酸相似物，消除WT序列中的不穩定序列；或增加核糖體結合位點的編碼區內的A/U含量。14、一種根據要求1至13所定義的包含RNA和注射緩衝液的RNA注射液，用於增加RNA轉移到寄助物和/或寄助物內的RNA表達。15、根據權利要求14所述的RNA注射液，其特徵在於，所述緩衝液進一步包含乳酸鹽。16、根據權利要求15所述的RNA注射液，其特徵在於，所述注射緩衝液包含至少15mM的乳酸鹽，較佳的含15mM至100mM的乳酸鹽。17、根據權利要求14至16所述的RNA注射液，其特徵在於，所述RNA是tRNA、rRNA或優選為mRNA。18、根據權利要求14至17所述的RNA注射液，其特徵在於，所述RNA是裸露的RNA，特別是裸露的mRNA。19、一種增加RNA轉移到寄助物和/或寄助物內RNA翻譯的方法，其特徵在於，所述方法包括下列步驟a.根據權利要求14到18中任意一項製備RNA注射液；b.將步驟a得到的RNA注射液給藥到寄助物中。20、根據權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述寄助物為從以下選擇的哺乳動物小鼠、大鼠、豬、牛、馬、狗、貓、猿，特別是人。21、一種用於體外細胞轉染的方法，其特徵在於，根據權利要求14到18中任一項所述的注射緩衝液注射到細胞中，特別是實驗室細胞系或疾病細胞中，優選藉助於電穿孔。全文摘要本發明涉及用RNA和包含鈉鹽、鈣鹽和可選的鉀鹽和可選的乳酸鹽的水性注射緩衝液製備RNA注射液，來增加寄助物中的RNA轉移和/或RNA翻譯。本發明還涉及一種RNA注射液和用於增加體內和體外RNA的RNA轉移和/或RNA翻譯的方法。文檔編號A61K47/02GK101203245SQ200680017126公開日2008年6月18日申請日期2006年5月19日優先權日2005年5月19日發明者史蒂夫·帕斯科洛,英格馬·霍爾申請人:庫瑞瓦格有限責任公司