轉氨酶突變體及其應用的製作方法

2023-10-18 01:29:30

1.本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種轉氨酶突變體及其應用。


背景技術：

2.手性胺是指小分子化合物手性中心含有氨基的一類化合物，是眾多醫藥及農藥的關鍵中間體，在藥品生產和工農業生產中越來越受到人們的重視。其中，手性胺是合成神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等的重要中間體，目前，40％～50％的手性藥物都是手性胺類化合物，高效、便捷合成手性胺化合物是有機合成化學研究的重要方向。例如，糖尿病類治療藥物-西他列汀(merck公司及codexis公司)及廣譜觸殺型除草劑-草銨膦(bayer公司)都具有手性胺化學模塊。
3.目前，製備手性胺的方法主要有化學法、生物拆分法和生物不對稱合成法。其中，化學法合成手性胺往往需要使用昂貴的金屬催化劑及特製的溶劑，生產成本較高，對映選擇性較低，並會造成一定的環境汙染；而酶法製備手性芳香胺具有催化效率高、立體選擇性強、反應條件溫和、環境友好等特點，符合綠色合成的大趨勢，因而成為當前研究的熱點。目前用於製備手性芳香胺的酶主要為脂肪酶和轉氨酶。相對於生物催化劑(脂肪酶)進行手性拆分法製備高純度手性胺的最大理論收率只有50％，生物不對稱合成法(轉氨酶)理論收率高達100％，因此其在生產工業領域有著強大的應用前景，相關研究受到了廣泛的重視。其中ω-轉氨酶(ω-tas)具有對映選擇性和區域選擇性高、底物譜較廣以及無需額外添加昂貴的輔酶的優勢，成為工業上用於生產手性胺的重要工業酶之一。
4.轉氨酶又稱氨基轉移酶，屬於轉移酶類，能夠可逆催化酮基與氨基之間的氨基轉移反應。當這類酶催化的轉氨反應中，底物或產物含有α胺基酸時，就稱該酶為α轉氨酶，反之則稱之為ω轉氨酶。α轉氨酶的產物一般只是α胺基酸，而ω轉氨酶能夠氨基化酮酸、醛和酮，且具有立體選擇性高、輔因子可再生的特點，因此，ω轉氨酶被更廣泛地應用於合成醫藥和農藥中間體。但是目前報導的野生ω-tas中能直接用於製藥工業的為數不多，主要受限於酶的不穩定性及不利的反應平衡。


技術實現要素：

5.本發明旨在提供一種轉氨酶突變體及其應用，以提高轉氨酶的活性。
6.為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種轉氨酶突變體。該轉氨酶突變體，轉氨酶突變體是由seq id no：1所示的胺基酸序列發生突變得到，突變至少包括：g292a；或者轉氨酶突變體的胺基酸序列具有發生突變的胺基酸序列中的突變位點，且與發生突變的胺基酸序列具有80％以上同源性的胺基酸序列，優選具有85％的同源性，更優選具有90％的同源性，進一步優選具有95％的同源性，再優選具有99％的同源性。
7.根據本發明的另一方面，提供了一種dna分子。該dna分子編碼上述任一種轉氨酶突變體。
8.根據本發明的再一方面，提供了一種重組質粒。該重組質粒含有上述任一種dna分
子。
9.進一步地，重組質粒為pet-22a(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b(+)、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pgex-6p-2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、puc-18或puc-19。
10.根據本發明的又一方面，提供了一種宿主細胞。該宿主細胞含有上述重組質粒。
11.進一步地，宿主細胞包括原核細胞或真核細胞；優選原核細胞為大腸桿菌bl21-de3細胞或大腸桿菌rosetta-de3細胞；真核細胞為酵母。
12.根據本發明的再一方面，提供了一種生產手性胺的方法。該方法包括轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的步驟，轉氨酶為上述任一種轉氨酶突變體。
13.進一步地，酮類化合物為其中，r1為h、未被取代或被滷素任選取代的c1～c10烷基、未被取代或被滷素任選取代c5～c10環烷基、未被取代或被滷素任選取代的c5～c10芳基或c5～c10雜芳基，r2為h、滷素、未被取代或被滷素、nh3或帶boc、cbz保護的nh3中至少一個基團所任選取代c1～c10烷基，r3為未被取代或被滷素任選取代的c6-12的芳基、未被取代或被滷素任選取代的c3-6的雜環基；優選的，酮類化合物為
14.進一步地，氨基供體為異丙胺或丙氨酸，優選為異丙胺。
15.進一步地，在轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的反應體系中，ph為7～11，優選為8～10.5，更優選為10.5；優選的，轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的反應體系的溫度為25～60℃，進一步優選為30～55℃，更優選為50℃；優選的，轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的反應體系中二甲基亞碸體積濃度為0％～50％。
16.本發明的上述轉氨酶突變體是在seq id no：1所示的轉氨酶的基礎上，通過理性設計和定向進化的方式對蛋白進行胺基酸突變及其組合突變獲得突變體，以此擴大酶的底物譜、提高酶對大位阻底物的催化能力；同時增強其穩定性，可在高濃度溶劑和高溫度條件下進行催化反應，進而此突變體的應用可以提高反應速率，提高酶穩定性，減少了酶用量，降低了後處理的難度，使得其能夠適合工業化生產；另外，轉氨酶突變體的立體選擇性也得到了極大的提高，可以更加高效生產手性胺，降低了生產成本和後期處理難度，適合推廣用
於手性胺的工業生產。
具體實施方式
17.需要說明的是，在不衝突的情況下，本技術中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發明。
18.轉氨酶是一類以蛋白質為主體的生物催化劑，而在工業生產過程中往往需要在一定的有機溶劑、壓力、溫度等易使蛋白質變性的條件，因此需要所用的生物催化劑具有較高的耐受性，以適應工業化生產需要。而野生轉氨酶一方面催化活性較低、底物譜較窄，且往往其對工業需求條件耐受性較低，從而限制了其廣泛應用。
19.本發明力圖通過理性設計和定向進化的方式對蛋白進行胺基酸突變及其組合突變獲得突變體，以此擴大酶的底物譜、提高酶對大位阻底物的催化能力；同時增強其穩定性，可在高濃度溶劑和高溫度條件下進行催化反應；並且提高結構中(1)手性中心的立體選擇性。
20.酶的理性改造是基於酶的三維分子結構對酶的底物結合部位、輔酶結合部位、表面及其他部位進行改造，以改變酶的催化特性，提高酶活力、選擇性等特性。酶的定向進化是一種蛋白質的非理性設計，人為創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外改造基因，應用易錯pcr、dna改組(dna shuffling)等技術，結合高效篩選系統獲得具有預期特性的新酶。
21.本發明對本實驗室已有的150種天然轉氨酶及190種轉氨酶突變體進行底物1的活力篩選，發現只有來源於sciscionella sp.的轉氨酶突變體mtttefanreih(12aa)+g17v+q40h+t66m+g69y+h70t+l73a+v77g+a78i+k141s+k142t+r143p+g144y+y130m+l148a+l151h+t152r+h153p+l163q+a165i+r188l+t204s+s207i+f208r+k211h+t290s+a292g+k146r+e145g(template，其胺基酸序列為seq id 1：mtttefanreih(12aa)mtttefansnlvavepvaireptppgsviqyseyeldrshplaggvawiegeyvpadearisifdmgfytsdatytgihvwhgnifrledhldrllhgaarlkletgmsreelagiakrcvslsqlreamvnititrgygstpygrdatkhrpqvyvyaipyqwifppeeqifgtsvivprhvrraglntidptiknfqwgdlsaaireahdrgarsavlldadncvaegpgfnvvlvkdgalvspsrnalpgitrktvyeiaaakgietmlrdvtsselyeadelmavstgggvtpitsldgeqvgngepgpitvairdrfwalmdepsslieaidy*；對應的，template鹼基序列為seq id no2：atgaccaccaccgagtttgccaacagggaattccat(12aa)atgaccaccaccgagtttgccaacagcaatctggtggccgtggaaccggttgcaatccgtgagcctacccctccgggcagcgtgattcagtacagcgagtacgaactggatcgcagccatccgctggcaggtggcgttgcctggattgaaggcgagtatgttcctgccgatgaagcccgtatcagcatcttcgatatgggcttttataccagcgatgcgacctataccgggatccacgtttggcacggcaatatcttccgcctggaagaccacctggaccgcctgctgcatggtgccgcacgtctgaaactggaaaccggtatgagccgcgaagaactggccggcattgccaagcgttgtgttagcctgagccagctgcgcgaagccatggtgaacatcaccattacccgcggctatggcagcaccccctacggaagggatgcgaccaaacataggccccaggtgtacgtgtatgccatcccgtatcagtggatcttccctccggaggaacagattttcggcaccagcgtgattgtgccgcgtcatgtgcgccgcgccggtctcaataccatcgacccgaccatcaagaactttcagtggggtgacctgtccgccgccatccgtgaggcccatgatcgcggcgcacg
tagcgcagttctgctggatgccgataattgcgtggccgagggtccgggctttaatgtggttctggtgaaggacggcgcactggtgagtccgagtcgtaacgcactgccgggcatcacccgcaaaaccgtgtacgaaatcgcagcagccaaaggcatcgaaaccatgctgcgcgacgtgaccagcagtgaactgtatgaggcagatgagctgatggccgtgagcaccggaggtggtgtgacccctattaccagcctggatggcgagcaggttggcaacggtgagccgggcccgattaccgtggccattcgtgatcgcttttgggcactgatggatgagccgagcagcctgattgaggccattgactattaa)可以催化目標底物得到產物，但是催化活性較差。
22.為了擴大酶的底物譜、提高酶對大位阻底物的催化能力，增強其穩定性，本技術以pet22b為表達載體，通過定點突變、飽和突變、易錯pcr以及組合突變等方式在轉氨酶上引入突變位點，獲得含有突變基因的質粒，以bl21(de3)為表達菌株，在iptg的誘導下獲得突變體蛋白。然後對突變體進行活性檢測，挑選活性提高的突變體。
23.其中，定點突變：是指通過聚合酶鏈式反應(pcr)等方法向目的dna片段(可以是基因組，也可以是質粒)中引入所需變化(通常是表徵有利方向的變化)，包括鹼基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高dna所表達的目的蛋白的性狀及表徵，是基因研究工作中一種非常有用的手段。
24.利用全質粒pcr引入定點突變的方法簡單有效，是目前使用比較多的手段。其原理是，一對包含突變位點的引物(正、反向)，和模版質粒退火後用聚合酶「循環延伸」，所謂的循環延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈後回到引物5』端終止，再經過反覆加熱退火延伸的循環，這個反應區別於滾環擴增，不會形成多個串聯拷貝。正反向引物的延伸產物退火後配對成為帶缺刻的開環質粒。dpn i酶切延伸產物，由於原來的模版質粒來源於常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的，對dpn i敏感而被切碎，而體外合成的帶突變序列的質粒由於沒有甲基化而不被切開，因此在隨後的轉化中得以成功轉化，即可得到突變質粒的克隆。
25.上述得將突變質粒轉化至大腸桿菌細胞內，在大腸桿菌中過量表達。轉氨酶誘導表達最佳條件：25℃，0.1mm iptg誘導過夜。然後通過超聲破碎細胞的方法獲得粗酶。
26.反應驗證條件：配置底物母液(底物溶於dmso中)和plp母液(10mg 5-磷酸吡哆醛溶於1ml的buffer中)，在10ml反應器中依次加入硼酸buffer、plp母液、6m異丙胺鹽酸鹽溶液、底物母液，最後加入酶(20％酶液)，在搖床中200rpm反應，反應結束後在反應體系中加入乙腈，震蕩混勻後12000rpm，離心3min，取上清稀釋適合的倍數，送hplc檢測活性。
27.前期通過定點突變和單點飽和突變的理性方式對轉氨酶進行初步的改造，用底物1進行活力驗證：反應式如下，結果如表1所示。
[0028][0029]
表1
[0030]
[0031]
[0032]
[0033][0034]
備註：
[0035]
1)反應條件a：5wt酶、plp 2mg、dmso 20％、ipn 30eq、500v、0.1m tris-cl 9.0、37℃、40h；
[0036]
2)n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～1％，+表示1～5％，++表示5～10％，+++表示10～15％，++++表示》15％。
[0037]
上述結果說明，經過定點突變和定向進化改造的突變體獲得了對具有較大空間位阻的底物的催化能力，且活力不斷逐步提高。為了進一步提升突變體的催化活力和穩定性，通過飽和突變以及組合突變的方式和定向篩選的方法對突變體的耐受性進行改造。效果驗證反應式如下，結果如表2所示。
[0038][0039]
表2
[0040]
[0041]
[0042][0043]
備註：
[0044]
1)反應條件b：2wt酶、plp 4mg、dmso 30％、ipn 30eq、200v、0.1m硼酸10.0、50℃、16h；
[0045]
2)反應條件c：0.5wt酶、plp 4g/l、dmso 30％、ipn 30eq、100v、0.1m硼酸10.0、50℃、16h；
[0046]
3)反應條件d：0.5wt酶、plp 1g/l、dmso 30％、ipn 30eq、100v、0.1m硼酸10.5、55℃、16h；
[0047]
4)反應條件e：0.1wt酶、plp 1g/l、dmso 50％、ipn 5eq、100v、0.2m硼酸10.5、60℃、16h；
[0048]
5)n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示》90％。
[0049]
經過上述耐受性改造後的突變體經過底物1的酶活驗證，突變體耐高溫的穩定性
得到顯著的提升，template最適反應溫度為37℃，突變體t291a+g292a+t70c、突變體t291a+g292a+t70c+i160g等突變體的最適反應溫度提升到50℃，突變體t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q、t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y158v最適反應溫度提升到60℃；同時突變體在溶劑中穩定性也有顯著提高，最適反應dmso濃度由20％提升到50％；而且酶活力也得到不斷的逐步提高，突變體t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y158v的酶活力相較template大幅度提高。為了改善突變體的立體選擇性，通過飽和突變、組合突變以及易錯pcr的進化方式和定向篩選的方法對突變體的選擇性進行改造。效果驗證反應式如下，結果如表3所示。
[0050][0051]
表3
[0052]
[0053]
[0054]
[0055][0056]
[0057]
「‑
12aa」表示去掉蛋白前端的12個胺基酸。
[0058]
備註：
[0059][0060]
1)轉氨酶突變體ee值，ee值＝((cp1+cp)-(cp2+cp3))/(cp+cp1+cp2+cp3)
[0061]
2)反應條件d：0.5wt酶、plp 1g/l、dmso 30％、ipn(異丙胺鹽酸鹽)30eq、100v、0.1m硼酸10.5、55℃、16h；
[0062]
3)反應條件f：7wt酶、plp 1g/l、dmso 20％、ipn 30eq、500v、0.2m硼酸10.5、60℃、16h；
[0063]
4)反應條件g：0.1wt酶、plp 1g/l、dmso 30％、ipn 10eq、200v、0.2m硼酸10.5、60℃、16h；
[0064]
5)反應條件h：0.3wt酶、plp 1g/l、dmso 30％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸10.5、60℃、16h；
[0065]
6)反應條件l：0.3wt酶、plp 1g/l、dmso 40％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸10.5、60℃、16h；
[0066]
7)反應條件m：0.3wt酶、plp 1g/l、dmso 40％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸10.5、55℃、16h；
[0067]
8)n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示》90％；
[0068]
9)n.d.表示0，*表示0～10％，**表示10～50％，***表示50～80％，****表示80～90％，*****表示90～95％，******表示》95％。
[0069]
上述選擇性改造後的突變體經過底物1的酶活驗證，突變體的選擇性在不斷逐步改善，突變體t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144l+g77l轉氨酶突變體ee值提高至70％以上，突變體t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144l+g77t、t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144l+g77t+l144w-12aa、t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144w+g77t+i165l-12aa轉氨酶突變體ee值提高至80％以上，t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144w+g77t+i165l+a292s-12aa、t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144w+g77t+i165l+a292s+s278r-12aa轉氨酶突變體ee值提高至90％以上，t291a+g292a+t70c+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144w+g77t+i165l+a292s+s278r+y69h+t70g+g160t+t106s-12aa轉氨酶突變體ee值提高至95％以上。
[0070]
通過採用軟體對轉氨酶(template)的三維結構進行計算機模擬分析，突變的位點大部分位於活性中心附近(活性中心位點主要包括t70、y144、a292、y69、i160等位點)，突變後有可能增強了底物和酶的結合，從而提高了選擇性和催化效率。
[0071]
根據本發明一種典型的實施方式，提供一種轉氨酶突變體。該轉氨酶突變體的胺基酸序列是由seq id no：1所示的胺基酸序列發生突變得到，所述突變至少包括：g292a；或者所述轉氨酶突變體的胺基酸序列具有所述發生突變的胺基酸序列中的所述突變位點，且與所述發生突變的胺基酸序列具有80％以上同源性的胺基酸序列，優選具有85％的同源性，更優選具有90％的同源性，進一步優選具有95％的同源性，再優選具有99％的同源性。
[0072]
本文使用的術語「同源性」具有本領域通常已知的含義，本領域技術人員也熟知測定不同序列間同源性的規則、標準。本發明用不同程度同源性限定的序列還必須要同時具有改進的轉氨酶對有機溶劑的耐受性。在上述實施方式中，優選轉氨酶突變體的胺基酸序列具有以上的同源性並具有或編碼具有改進的有機溶劑的耐受性的胺基酸序列。本領域技術人員可以在本技術公開內容的教導下獲得這樣的變體序列。
[0073]
根據本發明一種典型的實施方式，提供一種dna分子。該dna分子編碼上述耐有機溶劑的轉氨酶突變體。該dna分子編碼的上述轉氨酶突變體具有很好的有機溶劑耐受性和高ph耐受性，並且具有高可溶性表達特性以及高活力特性。
[0074]
本發明的上述dna分子還可以以「表達盒」的形式存在。「表達盒」是指線性或環狀的核酸分子，涵蓋了能夠指導特定核苷酸序列在恰當宿主細胞中表達的dna和rna序列。一般而言，包括與目標核苷酸有效連接的啟動子，其任選的是與終止信號和/或其他調控元件有效連接的。表達盒還可以包括核苷酸序列正確翻譯所需的序列。編碼區通常編碼目標蛋白，但在正義或反義方向也編碼目標功能rna，例如反義rna或非翻譯的rna。包含目標多核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，意指至少一個其組分與其至少一個其他組分是異源的。表達盒還可以是天然存在的，但以用於異源表達的有效重組形成獲得的。
[0075]
根據本發明一種典型的實施方式，提供一種重組質粒。該重組質粒含有上述任一種dna分子。上述重組質粒中的dna分子置於重組質粒的適當位置，使得上述dna分子能夠正確地、順利地複製、轉錄或表達。
[0076]
雖然本發明在限定上述dna分子時所用限定語為「含有」，但其並不意味著可以在dna序列的兩端任意加入與其功能不相關的其他序列。本領域技術人員知曉，為了滿足重組操作的要求，需要在dna序列的兩端添加合適的限制性內切酶的酶切位點，或者額外增加啟動密碼子、終止密碼子等，因此，如果用封閉式的表述來限定將不能真實地覆蓋這些情形。
[0077]
本發明中所使用的術語「質粒」包括雙鏈或單鏈線狀或環狀形式的任何質粒、粘粒、噬菌體或農桿菌二元核酸分子，優選為重組表達質粒，可以是原核表達質粒也可以是真核表達質粒，但優選原核表達質粒，在某些實施方案中，重組質粒選自pet-22a(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b(+)、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pgex-6p-2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、puc-18或puc-19。更優選，上述重組質粒是pet-22b(+)。
[0078]
根據本發明一種典型的實施方式，提供一種宿主細胞，宿主細胞含有上述任一種
重組質粒。適用於本發明的宿主細胞包括但不僅限於原核細胞或真核細胞。優選原核細胞為真細菌，例如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。更優選原核細胞為大腸桿菌bl21細胞或大腸桿菌dh5α感受態細胞，真核細胞為酵母。
[0079]
根據本發明一種典型的實施方式，提供一種生產手性胺的方法。該方法包括轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的步驟，轉氨酶為上述任一種耐有機溶劑的轉氨酶突變體。由於本發明的上述轉氨酶突變體具有擴大的酶底物譜、對大位阻底物的催化能力較高；同時穩定性增強，可在高濃度溶劑和高溫度條件下進行催化反應，進而此突變體的應用可以提高反應速率，提高酶穩定性，減少了酶用量，降低了後處理的難度，使得其能夠適合工業化生產。
[0080]
進一步地，酮類化合物為其中，r1為h、未被取代或被滷素任選取代的c1～c10烷基、未被取代或被滷素任選取代c5～c10環烷基、未被取代或被滷素任選取代的c5～c10芳基或c5～c10雜芳基，r2為h、滷素、未被取代或被滷素、nh3或帶boc、cbz保護的nh3中至少一個基團所任選取代c1～c10烷基，r3為未被取代或被滷素任選取代的c6-12的芳基、未被取代或被滷素任選取代的c3-6的雜環基；
[0081]
優選的，所述酮類化合物為所述酮類化合物為
[0082]
在本發明一種典型的實施方式中，氨基供體為異丙胺或丙氨酸，優選為異丙胺。
[0083]
應用本發明的轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的反應體系中，ph為7～10.5，優選為8～10，更優選為9～10，也就是說ph的取值可以任選為7～10.5中的值，例如7、7.5、8、8、8.6、9、10、10.5等。轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的反應體系的溫度為25～60℃，更優選為30～55℃，進一步優選為40～50℃，也就是說溫度的取值可以任選為25～60℃中的值，例如30、31、32、35、37、38、39、40、42、45、48、50、51、52、55等。轉氨酶對酮類化合物及氨基供體進行催化轉氨基反應的反應體系中二甲基亞碸體積濃度為0％～50％，例如選10％、15％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％等。
[0084]
本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的範圍。且下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。
[0085]
下面將結合實施例進一步說明本發明的有益效果。
[0086]
實施例1
[0087]
template及突變體催化酮化合物生成手性胺，在反應條件m的情況下驗活，結果可見template對底物催化活力很差，而template突變體具有較好的催化活性，並且突變體
t291a+g292a+i160g+s204l+v244s+t134i+m326q+y144w+g77t+i165l+a292s+s278r+y69h+t70g+g160t+t106s-12aa轉氨酶突變體ee值提高至90％以上。經過本發明的改造後，template突變體的獲得了對空間位阻較大底物的催化活力，部分突變體活力極大提高，而且突變體的立體選擇性也大幅度提高，擴大了底物譜。反應式如下，結果如表4所示。
[0088][0089]
表4
[0090][0091][0092]
備註：
[0093]
1)反應條件m：0.3wt酶、plp 1g/l、dmso 40％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸ph＝10.5、55℃、16h；
[0094]
2)n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示》90％。
[0095]
3)n.d.表示0，*表示0～10％，**表示10～50％，***表示50～80％，****表示80～90％，*****表示90～95％，******表示》95％。
[0096]
實施例2
[0097]
template及突變體催化酮化合物生成手性胺，在反應條件n的情況下驗活，結果可見template對底物無催化活力，而template突變體具有較好的催化活性。經過本發明的改造後，template突變體擴大了催化底物譜。反應式如下，結果如表5所示。
[0098][0099]
表5
[0100][0101][0102]
備註：
[0103]
反應條件m：1wt酶、plp 1g/l、dmso 20％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸ph＝10.5、50℃、16h；
[0104]
n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示90％～95％，++++++表示》95％。
[0105]
實施例3
[0106]
template及突變體催化酮化合物生成手性胺，在反應條件n的情況下驗活，結果可
見template對底物無催化活力，而template突變體具有較好的催化活性。經過本發明的改造後，template突變體擴大了催化底物譜。反應式如下，結果如表6所示。
[0107][0108]
表6
[0109][0110][0111]
備註：
[0112]
反應條件m：1wt酶、plp 1g/l、dmso 20％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸ph＝10.5、50℃、16h；
[0113]
n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示90％～95％，++++++表示》95％。
[0114]
實施例4
[0115]
template及突變體催化酮化合物生成手性胺，在反應條件n的情況下驗活，結果可見template對底物無催化活力，而template突變體具有較好的催化活性。經過本發明的改造後，template突變體擴大了催化底物譜。反應式如下，結果如表7所示。
[0116][0117]
表7
[0118][0119][0120]
備註：
[0121]
反應條件m：1wt酶、plp 1g/l、dmso 20％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸ph＝10.5、50℃、16h；
[0122]
2)n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～20％，+表示20～40％，++表示40～60％，
+++表示60～80％，++++表示80～90％，+++++表示90～100％。
[0123]
實施例5
[0124]
template及突變體催化酮化合物生成手性胺，在反應條件n的情況下驗活，結果可見template對底物無催化活力，而template突變體具有較好的催化活性。經過本發明的改造後，template突變體擴大了催化底物譜。反應式如下，結果如表8所示。
[0125][0126]
表8
[0127][0128]
備註：
[0129]
反應條件m：1wt酶、plp 1g/l、dmso 20％、ipn 10eq、100v、0.2m硼酸ph＝10.5、50℃、16h；
[0130]
2)n.d.表示未檢測到產品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示》90％。
[0131]
從以上的描述中，可以看出，本發明上述的實施例實現了如下技術效果：本發明的突變體擴大了酶的底物譜、提高了酶對大位阻底物的催化能力；同時增強了其穩定性，可在高濃度溶劑和高溫度條件下進行催化反應，進而此突變體的應用可以提高反應速率，提高酶穩定性，減少了酶用量，降低了後處理的難度，使得其能夠適合工業化生產。
[0132]
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。