一種促進裂殖壺菌油脂中dha合成的方法

2023-10-17 20:04:14 4

一種促進裂殖壺菌油脂中dha合成的方法
【專利摘要】一種促進裂殖壺菌油脂中DHA合成的方法，本發明涉及一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，該方法通過添加外源調控因子對三羧酸轉運體系中的蘋果酸酶的活性進行抑制，使裂殖壺菌體內煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)含量大幅下降，促進DHA的大量合成，所述外源調控因子為芝麻酚。該方法還可以通過選擇發酵碳源，使菌體內的磷酸戊糖途徑代謝通量降低，使裂殖壺菌體內NADPH含量大幅下降，促進DHA的大量合成，使最終所獲取菌體的油脂中DHA含量最高可達55.3％。本發明方法簡單易行，效果明顯，可大幅提高菌體油脂中DHA含量，且易於工業化應用。
【專利說明】一種促進裂殖壺菌油脂中DHA合成的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸 (DHA)合成的方法。

【背景技術】
[0002] 二十二碳六烯酸（DHA)屬於omega-3多不飽和脂肪酸系列，在人體中具有十分重 要的生理功能，是人體不能自身合成但又不可缺少的重要功能營養物質。經研究發現，DHA 大量存在於人體大腦皮層的神經組織和視網膜中，是大腦和視覺細胞中重要的脂肪酸組成 成分，具有促進腦部發育，提高智力和改善記憶力，同時，又具有促進視覺系統的發育，提升 視力的作用；此外，它還能阻止膽固醇在血管壁上沉積，預防或減輕動脈粥樣硬化及冠心病 的發生；也有研究證據表明，DHA可有效誘導癌變細胞的凋亡，在抗癌的研究中也發揮著重 要的應用價值。
[0003] 裂殖壺菌（Schizochytrium)，屬於破囊壺菌科（Thraustochytriaceae)，是一種 優良的生產多不飽和脂肪酸油脂的海洋真菌，由於其具有生長周期短，培養簡單，且胞內脂 肪酸和DHA含量高等優點，因而受到人們的廣泛關注，並對其生產過程進行了深入的研究。 申請號為200910033493. 8的專利公開了一種通過誘變篩選的方法獲得較高DHA含量的菌 株，且誘變後菌株DHA的含量高出出發菌株約1. 53倍。但該方法的誘變篩選方法較為繁瑣， 且誘變後的菌株通常具有遺傳不穩定性，易導致回復突變，不適合應用於工業大規模生產， 且誘變後的菌株中DHA含量僅有40%，油脂的品質依然不高。申請號為201010504635. 7的 專利公開了外源添加因子促進微生物合成二十二碳六烯酸的方法，該方法指出，向可產DHA 的微生物培養基中添加乙酸、檸檬酸和辛伐他汀中的任意一種或幾種組合時，微生物體內 的DHA含量可有效得到提高，從初始的35. 51 %最高可提高到45. 00%。該方法對裂殖壺 菌發酵產DHA的工藝技術具有一定的提升，但，乙酸、檸檬酸等物質的添加不僅導致DHA在 內的不飽和脂肪酸含量的升高，同時，也會導致飽和脂肪酸含量的升高，致使DHA含量提升 的空間受限。


【發明內容】

[0004] 針對現有利用裂殖壺菌發酵產DHA油脂技術的不足，本發明提供了一種促進裂殖 壺菌油脂中二十二碳六烯酸（DHA)合成的方法，該方法根據裂殖壺菌體內所特有的DHA合 成路徑的特點，在裂殖壺菌發酵過程中，通過添加外源調控因子對三羧酸轉運體系中的蘋 果酸酶的活性進行抑制，提高裂殖壺菌所產油脂中DHA的含量，提升DHA油脂的品質，同時， 也提高了生產效率，降低了生產成本。
[0005] 為了實現上述目的，本發明提供了一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成 的方法，其特徵在於，該方法通過添加外源調控因子對三羧酸轉運體系中的蘋果酸酶（ME) 的活性進行抑制，使裂殖壺菌體內煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)含量大幅下降，促 進DHA的大量合成，所述外源調控因子為芝麻酚。
[0006] 作為上述技術方案的改進，該方法還通過選擇發酵碳源，使三羧酸轉運體系中的 蘋果酸酶的活性受到抑制，同時菌體內的磷酸戊糖途徑代謝通量降低，使裂殖壺菌體內 NADPH含量大幅下降，促進DHA的大量合成。
[0007] 作為上述技術方案的進一步改進，發酵碳源為1，2-丙二醇，1，2-丙二醇與乙醇， 1，2-丙二醇與乙酸鹽，或1，2-丙二醇、乙醇與乙酸鹽的組合中的任意一種。
[0008] 作為上述技術方案的更進一步改進，所述芝麻酚的添加量為0. 5-3. OmM/L。
[0009] 本發明的優點在於通過添加外源調控因子對三羧酸轉運體系中的蘋果酸酶的活 性進行抑制，還可以進一步添加外源調控因子和選擇發酵碳源，使三羧酸轉運體系中的蘋 果酸酶的活性受到抑制，同時菌體內的磷酸戊糖途徑代謝通量降低，使裂殖壺菌體內的還 原力NADPH含量大幅下降，致使碳代謝流轉向聚酮合酶路徑來合成DHA，從而促進DHA的大 量合成，大幅提高裂殖壺菌油脂中DHA的含量，顯著提升了 DHA油脂的品質。

【具體實施方式】
[0010] 本發明根據裂殖壺菌體內的磷酸戊糖途徑和三羧酸轉運體系與DHA的合成密切 相關的特點，通過其中一個路徑或二個路徑的調節，可有效促進DHA的大量合成。
[0011] 本發明實例提供一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸（DHA)合成的方法，具 體實現步驟如下：
[0012] (1)將低溫凍存的裂殖壺菌種活化培養成裂殖壺菌種子液；
[0013] 活化培養所採用的種子培養基可以採用現有技術提供的各種組分，其優選的組分 (g/L)為：葡萄糖15. 0-30. 0,酵母粉4. 0-8. 0,牛肉膏0-5. 0蛋白腖0-5. 0,玉米漿2. 0-6. 0， MgS04 ? 7H20 0? 2-1. 0, KH2P040 . 5-2 . 0,海水晶 10. 0-20. 0。
[0014] (2)將裂殖壺菌種子液按照體積百分比4% -10% (優選8% )接入添加外源調控 因子的發酵培養基進行培養；
[0015] 外源調控因子（芝麻酚）在發酵培養基滅菌後，進行過濾除菌後添加，添加量為 0. 5-3. OmM/L ；
[0016] 發酵培養基可以採用現有技術提供的各種組分，如發酵培養基組分（g/L): 葡萄糖 40. 0-60. 0,酵母抽提物 6. 0-15. 0,穀氨酸鈉 0-10. 0, MgS04 ? 7H20 0. 2-1. 0， KH2P040. 5-2. 0,（NH4)2S040-5. 0, NaN03l. 0-3. 0, Na2S045 . 0-12 . 0。
[0017] 也可以進一步選擇發酵碳源替代葡萄糖，以進一步提高DHA的含量，所選擇的發 酵碳源為1，2-丙二醇，或者為1，2-丙二醇與乙醇和/或乙酸鹽的混合，乙醇需經過濾除菌 後加入已滅菌後的發酵培養基中，其中，乙酸鹽優選乙酸鈉。
[0018] 發酵培養基優選的組分（g/L)為：發酵碳源40. 0-60. 0,酵母抽提物6. 0-15. 0， 穀氨酸鈉 0-10. 〇, MgS04 ? 7H20 0? 2-1. 0, KH2P040. 5-2. 0，（NH4) 2S040-5. 0, NaN03l. 0-3. 0， Na2S045. 0-12. 0〇
[0019] 當發酵碳源為多種物質的混合時，其組份（g/L)為：
[0020] 1，2-丙二醇與乙酸鹽：1，2-丙二醇40-60 ;乙酸鈉0-10 ;
[0021] 1，2-丙二醇與乙醇：1，2-丙二醇 40-60 ;乙醇 0-10 ;
[0022] 1，2-丙二醇、乙醇與乙酸鹽：1，2-丙二醇40-60 ;乙醇0-10 ;乙酸鹽0-10。
[0023] (3)結束髮酵後，收集溼菌體並真空乾燥，直至菌體保持恆重，並稱重。
[0024] (4)對乾燥的菌體進行破壁，加入有機溶劑（如石油醚30-60沸程，或60-90沸程、 正己烷等）進行萃取，從而得到富含二十二碳六烯酸的油脂；進行甲酯化後的氣相檢測分 析，可以得到DHA的含量。
[0025]步驟（3)、（4)均可以採用現有技術，在此不再贅述。
[0026] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施 例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範 圍。
[0027] 實施例1
[0028] (1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培 養溫度25°C，搖床轉速200rpm條件下培養2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌 種子液；
[0029] 種子培養基組分（g/L):葡萄糖15.0,酵母粉6.0,牛肉膏3.0,蛋白腖2.0,玉米 漿 4. 0, MgS04 ? 7H20 0? 2, KH2P042. 0,海水晶 15. 0。
[0030] (2)在250mL三角瓶中加入50mL發酵培養基，將裂殖壺菌以10%的接種量接入發 酵培養基，26°C恆溫培養3天，轉速200rpm ;
[0031]發酵培養基組分（g/L):葡萄糖60. 0，酵母抽提物6. 0，MgS04 ? 7H200. 6，KH2P040. 5， NaN03l. 0, Na2S045. 0 ；
[0032] 在發酵培養基滅菌後，進行過濾除菌後添加外源調控因子芝麻酚，其添加量為 0. 5mM/L ；
[0033] CK(g/L):葡萄糖 60. 0,酵母抽提物 6. 0, MgS04 ? 7H20 0? 6, KH2P040. 5, NaN03l. 0， Na2S045. 0 ；
[0034] 每種不同的培養基配製3個平行樣，121°C，滅菌25min，冷卻備用；
[0035] (3)連續培養3天後結束髮酵，發酵液進行8000g離心15分鐘，並用單蒸水洗2-3 次後，再次離心，收集溼菌體並置於真空乾燥箱內，在真空度為〇.9Mpa，溫度為80°C條件 下，大約烘10小時，直至菌體保持恆重，並稱重。
[0036] (4)對真空乾燥的菌體進行機械破壁，稱取lg破壁菌粉於試管中，加入30-60沸 程的石油醚進行等體積萃取三次，每次加入石油醚5mL，收集石油醚萃取液，並置於真空幹 燥箱內，於80°C，真空度為0. 9Mpa條件下，除去石油醚，從而得到富含二十二碳六烯酸的油 月旨，並進行甲酯化後的氣相檢測分析。
[0037] 發酵結果如下所示。
[0038]表1發酵過程中菌體內的蘋果酸酶（ME)活性變化對比
[0039]

【權利要求】
1. 一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特徵在於，該方法通過添 加外源調控因子對三羧酸轉運體系中的蘋果酸酶的活性進行抑制，使裂殖壺菌體內NADPH 含量大幅下降，促進DHA的大量合成，所述外源調控因子為芝麻酚。
2. 如權利要求1所述的促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特徵在 於，該方法還通過選擇發酵碳源，使三羧酸轉運體系中的蘋果酸酶的活性受到抑制，同時菌 體內的磷酸戊糖途徑代謝通量降低，使裂殖壺菌體內NADPH含量大幅下降，促進DHA的大量 合成。
3. 如權利要求2所述的促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特徵在 於，所述發酵碳源為1，2-丙二醇，1，2-丙二醇與乙醇，1，2-丙二醇與乙酸鹽，或1，2-丙二 醇、乙醇與乙酸鹽的組合中的任意一種。
4. 如權利要求3所述的促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特徵 在於，當發酵碳源為1，2-丙二醇與乙酸鹽時，其配比為：1，2-丙二醇40g/L-60g/L ;乙酸 鈉0-10g/L ;當發酵碳源為1，2-丙二醇與乙醇時，其配比為：1，2-丙二醇40-60g/L ;乙醇 0-10g/L ;當發酵碳源為1，2-丙二醇、乙醇與乙酸鹽時，其配比為：1，2-丙二醇40-60g/L ; 乙醇 0-10g/L ;乙酸鹽 0-10g/L。
5. 如權利要求1至4中任一所述的促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法， 其特徵在於，芝麻酚的添加量為0. 5-3. OmM/L。
6. 如權利要求1至4中任一所述的促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法， 其特徵在於，該方法具體實現步驟為： (1) 將低溫凍存的裂殖壺菌種活化培養成裂殖壺菌種子液； (2) 將裂殖壺菌種子液按照體積百分比4% -10%接入發酵培養基進行培養；並在發酵 培養基滅菌後，進行過濾除菌後添加所述外源調控因子； (3) 結束髮酵後，收集溼菌體並真空乾燥，直至菌體保持恆重，並稱重； (4) 對乾燥的菌體進行破壁，然後萃取得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
7. 如權利要求6所述的一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特 徵在於，所述發酵培養基的組分（g/L)為：發酵碳源40. 0-60.0,酵母抽提物6. 0-15.0， 穀氨酸鈉 0-10. 〇, MgS04 ? 7H20 0? 2-1. 0, KH2P040. 5-2. 0，（NH4)2S040-5. 0, NaN03l. 0-3. 0， Na2S045. 0-12. 0〇
8. 如權利要求6所述的一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特徵 在於，所述步驟（1)中的種子培養基組分（g/L)為：葡萄糖15. 0-30.0,酵母粉4. 0-8.0,牛 肉膏 0-5.0 蛋白腖 0-5.0,玉米漿 2. 0-6. 0, MgS04* 7H20 0.2-1. 0, KH2P040. 5-2.0,海水晶 10. 0_20. 0。
9. 如權利要求8所述的一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特徵 在於，所述發酵碳源為葡萄糖，或者為1，2-丙二醇與乙醇和/或乙酸鹽的混合溶液。
10. 如權利要求9所述的一種促進裂殖壺菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，其特 徵在於，當發酵培養基中含有乙醇時，所述乙醇在經過濾除菌後加入已滅菌後的發酵培養 基中，所述乙酸鹽選用乙酸鈉。
【文檔編號】C12P7/64GK104450809SQ201410667537
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】餘龍江, 陳偉, 朱圓敏, 金文聞, 餘金龍 申請人:武漢華士特工業生物技術開發有限公司