運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM系列及其構建方法
2023-10-10 11:02:09
運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM系列及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一類運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3及其構建方法。所述的運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體是一類環狀載體，pSUZM1包含來自於運動發酵單胞菌染色體上複製起點oriC、來自於質粒pUC18上的大腸桿菌質粒複製起點，卡那黴素篩選標記基因；pSUZM2包含來自於運動發酵單胞菌內源性質粒pZZM401的複製起點、DNA複製蛋白基因序列和來自於質粒pUC18上的大腸桿菌質粒複製起點、卡那黴素篩選標記基因；pSUZM3包含來自於運動發酵內源性質粒pZZM402上的複製起點、DNA複製蛋白基因序列和來自於質粒pUC18上的大腸桿菌質粒複製起點、卡那黴素篩選標記基因。本發明的穿梭載體既能在大腸桿菌中複製，又能在運動發酵單胞菌中複製，並且在運動發酵單胞菌中能夠穩定的遺傳，具有很好的應用前景。
【專利說明】運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體PSUZM系列及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZMl、PSUZM2、pSUZM3及其構建方法與應用，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]能源安全和環境問題作為全世界共同關注的焦點，燃料乙醇作為一種優良的可替代能源引起了研究者的廣泛關注。運動發酵單胞菌(Zymomonasmobi I is, Z.mobilis)在生物【技術領域】的應用前景越來越受到廣泛關注，它不僅可用於生產重要的化工產品，而且可用於產生燃料乙醇。與釀酒酵母和其他燃料乙醇基因工程菌相比較，運動發酵單胞菌具備許多突出的優點，比如吸收糖效率高，產生物量少；發酵時無需控制加氧；耐高滲透壓和易於基因操作；乙醇耐受性強，理想的乙醇產量等等。但是，運動發酵單胞菌也具有一些不足之處，如底物範圍過窄，不能利用複雜的碳水化合物轉化為乙醇。除此之外，該細菌在發酵時對醪液中的鹽類、pH、抑制劑比較敏感，因而需對生產過程進行嚴格控制。為滿足對該菌的基礎研究和工業應用的要求，需要創建不同的基因工程菌株，因此首先需要有優良的載體系統。 [0003]基因組DNA的複製對於一個細胞來說是極其重要的。原核生物的基因組具有一個或多個染色體，且多為環形，真細菌染色體的複製起點僅有一個，古細菌的染色體複製起點則為單個或多個。其中，真細菌的複製起始位點(oriC)片段長度從10bp到100bp不等，染色體從此處開始複製，以雙複製叉的形式前行，在複製終點(terC)結束。絕大多數細菌的oriC位點位於dnaA基因附近,個別位於gidA和rpmH基因之間，或者靠近hemE基因。
[0004]細菌質粒主要有theta (Θ)和滾環兩種複製形式，Θ型複製與細菌基因組複製形式相似，由RNA聚合胸(RNA polymerase)和DNA聚合胸(DNA polymerase)共同作用，以雙複製叉的形式向兩端進行延伸。滾環複製與部分噬菌體的複製形式相似，質粒雙鏈中的一條鏈在複製起始位點區被質粒編碼起始蛋白(plasmid-encodedinitiator-protein, Rep)切開,然後環狀鏈和線狀鏈分別進行複製。滾環複製質粒最早是在 Staphylococcusaureus 中被發現，隨後在Bacillus subtilis, Clostridium butyricum,Brevibacteriumlactofermentum 等革蘭氏陽性菌中均有發現，而 Zymomonasmobilis,Bacteroides, cyanobacteria,Helicobacter pylori等革蘭氏陰性菌中質粒的複製也屬於該複製形式。滾環複製質粒的大小從1.3kb到1kb不等，具有精簡的結構，質粒上基因的轉錄方向大多相一致。Arvanitis等對Z.mobilis 10988內源性質粒pZMOl和pZM02的特徵和複製相關組分進行了研究，將質粒PZMOl線性化後克隆到PUC19中測序，全長為1651bp，G+C含量為38%，其中開放閱讀框(0RFZM01)編碼348個胺基酸，與其他革蘭氏陰性菌滾環複製質粒的複製蛋白高度同源。質粒PZM02全長為1669 bp，G+C含量為38.5，開放閱讀框(0RFZM02)編碼184個胺基酸，其N-端與滾環複製質粒的複製蛋白高度同源。
[0005]運動發酵單胞菌自身的不足限制了其在基礎研究和生物【技術領域】的應用，其中一個主要的瓶頸便是缺乏基因工程菌株。為了獲得乙醇生產效率高且又能利用多種碳源的運動發酵單胞菌基因工程菌，最為有效的方法是對其進行遺傳改造，常規的遺傳方法是利用載體攜帶感興趣的外源基因，其編碼的蛋白質使運動發酵單胞菌獲得相應的功能。運動發酵單胞菌現有的常用載體主要有，光譜載體pBBRlMCS系列和RSF1010系列等，但這些載體均有一定的缺陷，其中pBBRlMCS系列存在結構穩定性，而載體RSF1010系列則載體偏大。因此，將運動發酵單胞菌內源性質粒和大腸桿菌的質粒進行有效整合後形成大小較為合適的穿梭載體，這種類型的載體既能在大腸桿菌中複製，又能在運動發酵單胞菌中複製，且在運動發酵單胞菌中能夠穩定的遺傳，具有很好的應用前景。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZMl、pSUZM2和PSUZM3及其構建方法。
[0007]本發明提供的運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZMl、pSUZM2和pSUZM3是一類環狀載體。
[0008]其中複製載體pSUZMl包含來自於運動發酵單胞菌染色體上複製起點oriC、來自於質粒PUC18上的大腸桿菌質粒複製起點，卡那黴素篩選標記基因。
[0009]其中複製載體pSUZM2包含來自於運動發酵單胞菌內源性質粒PZZM401的複製起點、DNA複製蛋白基因序列、來自於質粒PUC18上的大腸桿菌質粒複製起點、卡那黴素篩選標記基因。
[0010]其中PSUZM3包含來自於運動發酵內源性質粒PZZM402上的複製起點、DNA複製蛋白基因序列、來自於質粒PUC18上的大腸桿菌質粒複製起點、卡那黴素篩選標記基因。
[0011]本發明的另一個目的是提供運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZMl、pSUZM2和pSUZM3的構建方法。
[0012]本發明所提供的pSUZMl的構建方法，包括如下步驟:
I)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA。
[0013]2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5』-GGCACGACAGGTTTCCTCTTCGACCAGCGGTAAG-3』 和 5』 -CCCACTGCAAGCTACCTTCAGTCGCGGCTTCTACC-3』 進行 PCR 擴增，得到運動發酵單胞菌複製起點片段oriC.3)以載體pUC18 模板，用以下引物 5 』 -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3，和5』 -CTTACCGCTGGTCGAAGAGGAAACCTGTCGTGCC-3』，進行PCR擴增，得到大腸桿菌質粒複製起點片段oriE-1.4)以載體pBBRlMCS-2 為模板，用以下引物 5』-GGTAGAAGCCGCGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3』和 5』-GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3』，進行 PCR 擴增，得到篩選標記基因片段 kan_l
5)將3個PCR產物oriC、oriE-l和kan_l分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得重組載體pSUZMl。
[0014]本發明所提供的pSUZM2的構建方法，包括如下步驟:
I)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA。
[0015]2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5』-GGCACGACAGGTTTCCGCACCGCAAAGGACATG-3』 和 5』 -CCCACTGCAAGCTACCTCGATTAACCGCAGGATTACG -3』 進行 PCR 擴增，得到片段運功發酵單胞菌質粒PZZM401的複製起點和DNA複製酶基因片段oriPl
3)以載體pUC18 模板，用以下引物 5 』 -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3，和5』 - GCATGTCCTTTGCGGTGCGGAAACCTGTCGTGCC-3』，進行PCR擴增，得到大腸桿菌複製起點片段 oriE-2.4)以載體pBBRlMCS-2 為模板，用以下引物 5』-CGTAATCCTGCGGTTAATCGAGGTAGCTTGCAGTGGG-3』 和 5』 - GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3』，進行 PCR 擴增，得到片段 kan_2
5)將3個PCR產物oriPl、oriE-2和kan_2分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得重組載體PSUZM2。
[0016]本發明所提供的pSUZM3的構建方法，包括如下步驟:
I)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA。
[0017]2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5』 -GGCACGACAGGTTTCCCGGAAAGGTCATCCTG -3』 和 5』 - CCCACTGCAAGCTACCTCTGAGGCGACGACAG -3』 進行 PCR 擴增，得到片段運功發酵單胞菌質粒PZZM402的複製起點和DNA複製酶基因片段oriP2.3)以載體pUC18 模板，用以下引物 5』 -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3』 和5』 - CAGGATGACCTTTCCGGGAAACCTGTCGTGCC -3』，進行PCR擴增，得到大腸桿菌質粒複製起點片段 oriE-3.4)以載體pBBRlMCS-2 為模板，用以下引物 5』-CTTCTGTCGTCGCCTCAGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3』 和 5』 - GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3』，進行 PCR 擴增，得到片段 kan_3.5)將3個PCR產物oriP2、o riE-3和kan_3分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得重組載體PSUZM3。
[0018]本發明的運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭複製載體既可以在運動發酵單胞菌中複製，也可以在大腸桿菌中複製。相對於以前使用廣譜性載體，其穩定性更強，具有很好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1載體pSUZMl的構建策略 圖2載體pSUZMl引物序列及其用途
圖 3 載體 pSUZMl 構建凝膠電泳 Μ, λ Eco Τ14 DNA marker, 1: kan; 2: oriE; 3: oriC
圖 4 載體 pSUZMl 質粒電泳圖 Μ, λ Eco Τ14 DNA marker, I; 2: pSUZMl 質粒
圖5載體pSUZM2的構建策略
圖6載體pSUZM2引物序列及其用途
圖 7 載體 pSUZM2 構建凝膠電泳 Μ, λ Eco Τ14 DNA marker, 1: kan; 2: oriE; 3: oriPl
圖 8 載體 pSUZM2 質粒電泳圖 M, AEco T14 DNA marker, I; 2; 3; 4; 5; 6; 7: pSUZM2 質粒
圖9載體pSUZM3的構建策略
圖10載體pSUZM3引物序列及其用途
圖 11 載體 pSUZM3構建凝膠電泳.Μ, λ Eco T14 DNA marker, 1: kan; 2: oriE; 3: oriP2圖 12 載體 pSUZM3 質粒電泳圖 M, AEco T14 DNA marker, I; 2; 3; 4; 5; 6; 7: pSUZM3 質粒圖 13 載體 pSUZMl-3 質粒凝膠電泳 M, AEco T14 DNA marker, I; 2pSUZMl 質粒-Nco I; 3; 4: pSUZM2 質粒-Nco I;5;6;7;8: pSUZM3 質粒-Nco I
圖 14 質粒 pSUZMl，pSUZM2, pSUZM3 在Z.mobiIisWA 中的穩定性。Times:轉接次數，CC:抗性菌落數
圖 15 質粒 pSUZMl，PSUZM2, pSUZM3 在Z.mobilis\Q22^ 中的穩定性。Times:轉接次數，CC:抗性菌落數
圖 16 質粒 pSUZMl，pSUZM2, pSUZM3 在Z.mobilislQ2?,2 中的穩定性。Times:轉接次數，CC:抗性菌落數
圖 17 質粒 pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3 在Z- ?ο&7Υ.529191 中的穩定性。Times:轉接次數，CC:抗性菌落數
【具體實施方式】
[0020]實例I載體pSUZMl的構建
載體pSUZMl的構建策 略見圖1，具體如下:
1)設計篩選標記卡那黴素抗性基因的上遊引物KanCF，下遊引物KanR;大腸桿菌pUC18質粒複製起點上遊引物OriEF，下遊引物OriECR;運動發酵單胞菌ZM4染色體複製起點上遊引物OriZCF，下遊引物OriZCR，具體引物序列見圖2.2)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA。取2mL菌液，12000rpm離心2min後的沉澱用TE洗滌，離心後再用ImLTE重懸菌體。加入53 μ L 10%SDS,混勻，加入IlyL 10mg/mL蛋白酶 K，混勻，37°C溫育 I h。加入 211 μ L 5mol/LNaCl，再加入 146 μ L CTAB/NaCl(50 g/ LCTAB，0.5 mol/ L NaCl),混勻，65°C溫育1min0加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1 )，混勻，12000rpm離心5min,保留上清。上清中加入等體積的酹:氯仿:異戍醇(25: 24: I),混勻,12000rpm離心5min,保留上清。加入0.6倍的異丙醇，混勻，12000rpm離心5min,收集DNA沉澱，用70%乙醇洗滌DNA沉澱後離心，棄上清。用100 μ LTE或去離子水溶解DNA，加入終濃度為20μ g/mLRNaseA，4°C保存。
[0021]3)以載體pBBRlMCS-2為模板，用KanCF、KanR為引物擴增片段kan_l ;以載體PUC18為模板用，0riEF、0riECR為引物擴增oriE-Ι ;以運動發酵單胞菌全基因組為模板，用OriZCF、OriZCR 為引物擴增 oriC。
[0022]PCR反應體系:2 XPCR buffer 25 μ L，上遊引物1.5 μ L，下遊引物1.5 μ L，模板DNA IyL,加水至 50 μ L。
[0023]PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸35s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0024]PCR 結果如圖 3 所示，kan-1、oriE-1、oriC PCR 產物大小分別為 1.1 kb，0.95 kb,
1.1 kb，與預期結果相符。
[0025]4) PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
[0026]5)片段不依賴基因序列和連接反應克隆(SLIC)，具體步驟如下:
在0.5mL的EP管中，按以下比例混合各組分:4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶緩衝液(Fermentas), 0.1 μ L Τ4 DNA 聚合酶(5 U/μ L Fermentas), I μ L kan_l 片段、I μ L oriE-1片段、I μ L oriC-Ι 片段，加 ddH20 到 20 μ L。[0027]37°C孵育6 min，然後將EP管置於70°C的水浴中孵育lOmin，終止反應。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶處理的DNA到另外一個新的0.5mL的EP管，加入2 μ L 10 X退火緩衝液，10 μ LddH2O0將混合物置於75°C的水浴中反應15min，然後自然冷卻至室溫。取5yL產物轉化大腸桿菌。
[0028]6)電轉化運動發酵單胞菌
挑取Z.mobilis單菌落培養於5 mL RM培養基中，得到菌液全部接種於100 mL RM培養基中，培養至OD6tltl為0.3-0.4。於4°C 6000 rpml0min收集菌體，用10 mL 10%甘油清洗菌體，於4°C 6000 rpm 10 min收集菌體，重複清洗一次,將收集到的菌體懸浮於2 mL 10%甘油中，製備感受態。
[0029]採用美國BTX公司的ECM830脈衝導入儀。將細胞懸浮液與質粒DNA注入反應小池內，並將小池插在支座上，導線與儀器連接；接通電源；根據需要選擇所需的電容值、電壓值和電阻值；檢查上述操作無誤後，開始脈衝；實驗結束後，記錄實驗數據。
[0030]將I μ g質粒與200 μ L?.mobilis電擊感受態混合後在2500 V、200 Ω、50 μ F條件下電擊，電擊後把菌液迅速轉移至3mL RM培養基中靜止恢復3 h，取100 μ L菌液塗布於含卡那黴素(200 μ g/mL)的平板,3 d後先出現轉化子。
[0031]7) pSUZMl質粒的提取
接種菌落於2mL RM培養基,取1.5 mL菌液於EP管中，10, 000 rpm離心2 min,棄上清液。加入0.1mL溶液I，充分混合，靜置5 min,加入0.2 mL溶液II，混勻，置冰浴上5 min,加入
0.15 mL溶液III，混勻後置冰浴上20 min。10, 000 rpm離心5 min,取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，混勻後於_20°C靜置30 min。10, OOOrpm離心5 min，棄上清液，用70%乙醇清洗一次，1000rpm離心2min，棄上清，沉澱乾燥後溶於50 μ L ddH20或TE中，加入0.5 μ LlOmg/mL RNaseA 37°C消化lOmin。獲得重組載體pSUZMl，其質粒提取結果見圖4.實例2載體pSUZM2的構建
載體PSUZM2的構建策略見圖5，具體如下:
O設計篩選標記卡那黴素抗性基因的上遊引物KanPlF，下遊引物KanR;大腸桿菌PUC18質粒複製起點上遊引物Or iEF，下遊引物Or iEP IR ;運動發酵單胞菌ZM4質粒pZZM401複製起點和DNA複製酶基因上遊引物OriZPlF，下遊引物OriZPIR，具體引物序列見圖6.2)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA。具體步驟見實例I。
[0032]3)以載體pBBRlMCS-2為模板，用KanPlF、KanR為引物擴增kan_2 ;以載體pUC18為模板用OriEF、OriEPlR為引物擴增oriE-2 ;以運動發酵單胞菌全基因組為模板，用OriZPlF, OriZPlR 為引物擴增 OriPl0
[0033]PCR反應體系:2 XPCR buffer 25 μ L，上遊引物1.5 μ L，下遊引物1.5 μ L，模板DNA IyL,加水至 50 μ L。
[0034]PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸35s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0035]PCR 結果如圖 7 所示，kan-2、oriE-2、oriPl PCR 產物大小分別為 1.1 kb，0.95 kb,
2.8 kb，與預期結果相符。
[0036]4) PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
[0037]5)片段不依賴基因序列和連接反應克隆(SLIC)，具體步驟如下:
在0.5mL的EP管中，按以下比例混合各組分:4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶緩衝液(Fermentas), 0.1 μ L Τ4 DNA 聚合酶(5 U/μ L Fermentas), I μ Lkan-2 片段、I μ LoriE_2片段、I μ LoriPl 片段，加 ddH20 到 20 μ L。
[0038]37°C孵育6 min，然後將EP管置於70°C的水浴中孵育lOmin，終止反應。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶處理的DNA到另外一個新的0.5mL EP管，加入2 μ L 10 X退火緩衝液，10 μ LddH2Oo將混合物置於75°C的水浴中反應15min，然後自然冷卻至室溫。取5 μ L產物轉化大腸桿菌。
[0039]6)電轉化運動發酵單胞菌 具體步驟與實例I相同。
[0040]7 ) pSUZM2質粒的提取
具體步驟與實例I相同。獲得重組載體PSUZM2，其質粒提取結果見圖8.實例3載體pSUZM3的構建
載體PSUZM3的構建策略見圖9，具體如下:
O設計篩選標記卡那抗性基因的上遊引物KanPlF，下遊引物KanR;大腸桿菌複製起點上遊引物OriEF，下遊引物OriEPlR ;運動發酵單胞菌ZM4染色體複製起點上遊引物OriZPlF，下遊引物OriZPIR，具體引物序列見圖10.2)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA。具體步驟見實例I。
[0041]3)以載體pBBRlMCS-2為模板，用KanP2F、KanR為引物擴增kan_3片段；以載體PUC18為模板用0 riEF、0riEP2R為引物擴增oriE_3片段；以運動發酵單胞菌全基因組為模板，用0riZP2F、0riZP2R為引物擴增oriP2片段。
[0042]PCR反應體系:2 XPCR buffer 25 μ L，上遊引物1.5 μ L，下遊引物1.5 μ L，模板DNA IyL,加水至 50 μ L。
[0043]PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸35s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0044]PCR結果如圖 11 所示，kan-3、oriE-3、oriP2 PCR產物大小分別為 1.1 kb,0.95 kb,
2.3 kb，與預期結果相符。
[0045]4) PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
[0046]5)片段不依賴基因序列和連接反應克隆(SLIC)，具體步驟如下:
在0.5mL的EP管中，按以下比例混合各組分:4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶緩衝液(Fermentas), 0.1 μ L Τ4 DNA 聚合酶(5 U/μ L Fermentas), I μ Lkan-3 片段、I μ LoriE_3片段、I μ LoriP2 片段，加 ddH20 到 20 μ L。
[0047]37°C孵育6 min，然後將EP管置於70°C的水浴中孵育lOmin，終止反應。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶處理的DNA到另外一個新的0.5mL EP管，加入2 μ L 10 X退火緩衝液，10 μ L ddH20o將混合物置於75°C的水浴中反應15min，然後自然冷卻至室溫。取5yL產物轉化大腸桿菌。
[0048]6)電轉化運動發酵單胞菌 具體步驟與實例I相同。
[0049]7 ) pSUZM3質粒的提取
具體步驟與實例I相同。獲得重組載體PSUZM3，其質粒提取結果見圖12.實例5複製載體pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3的酶切鑑定
取新的 0.2ml 的 EP 管，pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3 質粒分別 2 μ L, 10* Tango buffer I μ L,AfcoI 0.8 μ L，ddH20 6.2 μ L，37V反應3_4h，電泳檢測酶切效果。
[0050]結果顯示，複製載體？3似11、？3似12和？3似10用價01單酶切，酶切結果與預期大小相符(圖13)。
[0051 ] 實例5載體pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3的穩定性檢測
挑取單菌落接種到RM培養基(kan，200)中，培養16 h後用於第一次接種，以後每隔24h轉接一次，培養基均為RM，接種量均為1%。不同次轉接培養物經過適當稀釋後，塗布RM平板，然後各取160個生長菌落點接在RM培養基(kan，200 μ g/mL)平板，記錄生長情況，統計平板上的菌落數，計算抗性菌落的百分數，每個樣品3個重複。
[0052]結果表明(圖 14)，載體 pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3 在Ζ.mobiIisim 穩定性較好，轉接10次抗性菌落數仍接近50%。複製載體PSUZM2和PSUZM3在Z.mobilisWZ25和Z.mobilisWZ25中的穩定性與在Z.mobiIisim中相當，但pSUZMl的穩定性較差，轉接10次抗性菌落數接近O (圖15，圖16)。這3種載體轉化麗^/7/^29191後，隨著轉接次數的增加，抗性菌落數 逐步減少，最後接近於O (圖17)。
【權利要求】
1.一類能在運動發酵單胞菌-大腸桿菌中穿梭的環狀載體pSUZMl、pSUZM2和pSUZM3，包含兩個原核複製起點，篩選標記基因。
2.根據權利I所述的載體，其特徵在於=PSUZMl包含來自於運動發酵單胞菌染色體上複製起點oriC和來自於質粒pUC18上的大腸桿菌質粒複製起點，卡那黴素篩選標記基因；PSUZM2包含來自於運動發酵單胞菌內源性質粒PZZM401的複製起點、DNA複製蛋白基因序列和來自於質粒PUC18上的大腸桿菌質粒複製起點、卡那黴素篩選標記基因；pSUZM3包含來自於運動發酵內源性質粒PZZM402上的複製起點、DNA複製蛋白基因序列和來自於質粒PUC18上的大腸桿菌質粒複製起點、卡那黴素篩選標記基因。
3.權利2所述的載體的構建方法，包括如下步驟: OpSUZMl的構建方法，包括 如下步驟: (1)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA； (2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5』-GGCACGACAGGTTTCCTCTTCGACCAGCGGTAAG-3』 和 5』 -CCCACTGCAAGCTACCTTCAGTCGCGGCTTCTACC-3』 進行 PCR 擴增，得到運動發酵單胞菌複製起點片段oriC ； (3)以載體pUC18 模板，用以下引物 5』 -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3』 和5』 -CTTACCGCTGGTCGAAGAGGAAACCTGTCGTGCC-3』，進行PCR擴增，得到大腸桿菌質粒複製起點片段oriE-Ι ； (4)以載體pBBRlMCS-2 為模板，用以下引物 5』 -GGTAGAAGCCGCGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3 』和 5 』 -GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3，，進行 PCR 擴增，得到篩選標記基因片段kan-Ι ； (5)將3個PCR產物oriC、oriE-1和kan_l分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合,混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得權利要求2所述的載體PSUZMl ； 2)pSUZM2的構建方法，包括如下步驟: (1)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA； (2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5』-GGCACGACAGGTTTCCGCACCGCAAAGGACATG -3』 和 5』 - CCCACTGCAAGCTACCTCGATTAACCGCAGGATTACG -3』 進行 PCR 擴增，得到運動發酵單胞菌質粒PZZM401的複製起點和DNA複製酶基因片段oriPl ；
(3)以載體pUC18 模板，用以下引物 5』 -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3』 和5』 - GCATGTCCTTTGCGGTGCGGAAACCTGTCGTGCC -3』，進行PCR擴增，得到大腸桿菌質粒複製起點片段oriE-2 ； (4)以載體pBBRlMCS-2 為模板，用以下引物 5』-CGTAATCCTGCGGTTAATCGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3』和 5』- GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3』，進行PCR擴增，得到片段kan_2 ； (5)將3個PCR產物oriPl、oriE-2和kan_2分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得權利要求2所述的載體PSUZM2 ； 3)pSUZM3的構建方法，包括如下步驟: (1)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA； (2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5』-GGCACGACAGGTTTCCCGGAAAGGTCATCCTG -3』 和 5』 - CCCACTGCAAGCTACCTCTGAGGCGACGACAG -3』 進行 PCR 擴增，得到運動發酵單胞菌質粒PZZM402的複製起點和DNA複製酶基因片段oriP2 ；
(3)以載體pUC18 模板，用以下引物 5』 -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3』 和5』 - CAGGATGACCTTTCCGGGAAACCTGTCGTGCC -3』，進行PCR擴增，得到大腸桿菌複製起點片段oriE-3 ； (4)以載體pBBRlMCS-2 為模板，用以下引物 5』-CTTCTGTCGTCGCCTCAGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3』 和 5』 - GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3』，進行 PCR 擴增，得到片段 kan_3 ； (5)將3個PCR產物oriP2、oriE-3和kan_3分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得權利要求2所述的載體 PSUZM3。
【文檔編號】C12N15/74GK104031932SQ201410296217
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】譚雪梅, 曹慶華, 張義正, 王海燕, 馮紅 申請人:四川大學