一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗的製作方法

2023-07-10 18:49:41 3

專利名稱：一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬分子免疫學領域，涉及一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗，具體涉及一種與分子佐劑C3d交聯的DNA及蛋白避孕疫苗。
已有實驗證明儘管不同種的α亞基之間不具免疫交叉反應性，但它們與hCGβ結合形成的異源二聚體保留了hCG的大部分生物活性和理化特性。有文獻報導將hCGβ與綿羊促黃體生成素α亞基(oLHα)體外合成異源二聚體，可使hCGβ免疫原性增強，再進一步將此異源二聚體與蛋白載體分子TT(破傷風毒素)或DT(白喉毒素)偶聯，發現該疫苗有良好的免疫避孕效果，而且其作用是可逆的。雖然hCGβ作為避孕疫苗的研究已取得了一些進展。但這些疫苗均未達到高效、安全、及補體受體CR2穩定持久的要求。
C3d是補體C3b的一個重要片段。C3的α鏈靠近N端有一標誌性的鏈內硫酯鍵結構，此結構的水解是C3發揮眾多功能的先決條件之一，而C3d即為包含該硫酯鍵的片段。其空間構型呈α-α桶狀結構，桶狀結構的兩端分別具有與外來抗原以的結合位點。CR2是在成熟B細胞表面表達的單鏈跨膜糖蛋白，又稱CD21，是C3d的特異受體，其主要功能是調節B細胞的激活、分化增殖和產生抗體。C3d與其結合後，可通過與CD19、CR1等聯合成表面信號傳遞複合體，放大刺激信號，增強B細胞免疫應答效應。三個拷貝C3d分子與抗原組成的重組抗原的免疫原性比原先抗原高10000倍，其免疫增強作用比加用完全弗氏佐劑也高出100倍。以C3d作為分子佐劑，可將抗原與免疫系統的效應分子直接相連，實現天然免疫與獲得性免疫的細胞內部聯繫，大大提高了原有抗原的免疫原性，可以得到高效的重組抗原。而且，當外來抗原耦聯C3d後，可直接使靶抗原與機體免疫效應B細胞相連，通過BCR複合物和CD21-CD19複合物激活B細胞產生體液免疫應答，而不需要APC處理和Th細胞輔助，從而改變免疫應答模式，使免疫應答由TH1型轉變成Th2型，削弱細胞免疫對機體的損傷。近年來，隨著基因工程疫苗的產生，相應誕生了分子佐劑系統。C3d是一新型分子佐劑，可與B細胞表面CD21相連，依次激活CD19放大信號，增強B細胞免疫效應，削弱CTL損傷，改變Th1/Th2型免疫應答模式。
雖然hCGβ疫苗的研製與應用已取得較大進展，但其免疫原性弱、體內存留時間短等問題仍未得到解決。
本發明所採用質粒、載體和真核啟動子CMV均為本技術領域常規所用。
2、基因免疫動物將pcDNA3、pcDNA3-hCGβ、pcDNA3-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ-C3d3分作為A組，B組，C組和D組實驗組。選擇6周齡BALB/c雌性小鼠分組，免疫前一周，予小鼠肌肉注射0.25％普魯卡因。一周後，在相同部位分別予小鼠肌注前述四種質粒5pmol、10pmol和、20pmol。三周後，再次給予相同劑量質粒加強免疫。於第二次免疫三周後，取小鼠外周血及脾細胞，ELISA法測定外周血抗hCGβ抗體效價及hCG抗原體外刺激脾細胞培養上清中Th1型(IL-2、INF-γ、TNF-α)/Th2型(IL-4、IL-10)細胞因子表達水平。
實驗結果顯示，pCMV4的表達效率明顯高於pcDNA3。攜hCGβ-C3d3的質粒刺激宿主產生的抗hCGβ抗體顯著高於僅攜hCGβ的質粒；hCGβ-C3d3 cDNA使宿主免疫細胞Th1型細胞因子表達水平下降，Th2型細胞因子表達水平上升；而單獨hCGβ cDNA無此作用。證實C3d分子佐劑能夠增強hCGβ cDNA免疫原性，且作用呈劑量依賴關係；並使免疫應答由Th1型細胞免疫向Th2型體液免疫偏轉。
上述實驗結果表明，交聯了分子佐劑C3d的避孕疫苗有明顯的抗hCGβ體液免疫效應和抗生育作用。
免疫效果評價為交聯了分子佐劑C3d的避孕疫苗抗hCGβ體液免疫效應增強100-1000倍，增強抗生育作用1000倍，可用於免疫避孕及抗感染。表1是動物免疫方案。表1分組pCMV4-hCGβ-C3d3pcDNA3-hCGβ-C3d3pcDNA3-hCGβ pcDNA3劑量 均為5pmol、10pmol、20pmol免疫次序肌肉注射0.25％普魯卡因0.1ml後一周分別給BALB/c小鼠肌肉注射基因疫苗一次，三周後重複免疫一次TH1/TH2 免疫後6周取脾細胞，在hCGβ體外刺激培養24小時，收集上清，待測型應答 IL-2、IFN-γ、IL-4等細胞因子抗hCGβ 於免疫後6周取外周血，分析hCG抗血清效價.效應實驗結果還證實，本發明疫苗的C3d分子佐劑確能提高hCGβ基因避孕疫苗的免疫原性，並使抗體生成為主的體液免疫反應在免疫應答中起主要作用，實現了Th1型向Th2型免疫應答模式的轉變，為hCGβ基因避孕疫苗進一步研製及實際應用提供了基礎。
本發明的C3d作為增強體液免疫效力的分子佐劑，還可應用於製備其他基因疫苗或基因工程疫苗。如抗感染疫苗。
本發明還能通過基因工程表達相應產物，形成蛋白避孕疫苗，免疫動物或人類同樣具有抗生育效果。
權利要求
1.一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗，其特徵在於將分子佐劑與hCGβ通過基因克隆構建入真核表達質粒pCMV4製成。
2.根據權利要求1所述的與分子佐劑交聯的避孕疫苗，其特徵在於所述的分子佐劑是C3d。
全文摘要
本發明屬分子免疫學領域，涉及一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗。本發明將起分子佐劑作用的3個拷貝C3d與hCGβ通過基因克隆構建入真核表達質粒pCMV
文檔編號A61P15/18GK1440811SQ0310856
公開日2003年9月10日 申請日期2003年3月28日 優先權日2002年7月9日
發明者李大金 申請人:復旦大學附屬婦產科醫院