白靈菇的DNA指紋圖譜及其獲取方法與專用引物與流程
2023-10-10 20:35:54 1
本發明涉及生物領域中白靈菇的DNA指紋圖譜及其獲取方法與專用引物。
背景技術：
：白靈菇(Pleurotusnebrodensis)，屬真菌門(Fungidoor)擔子菌亞門(Basidiomycolina)真菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)側耳科(Pleurotaceae)側耳屬(Pleurotus)。其子實體外形美觀，通體潔白，菇體肥大，蓋厚柄粗，質地密實，味鮮，質脆，風味極佳。白靈菇營養豐富，蛋白質含量為14.7％，碳水化合物含量為43.2％，脂肪含量為4.31％，纖維素含量為15.4％。白靈菇富含18種胺基酸，其中人體必需的賴氨酸、精氨酸等8種胺基酸的含量佔總胺基酸含量的35％。同時，它又含有大量的磷、鐵、鈣等礦物元素。白靈菇內的真菌多糖含量達到190mg/g，對提高人體的非特異性免疫功能具有促進作用，是一種珍稀的天然保健食品。DNA分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。分子標記作為食用菌遺傳育種研究中的一個重要手段，其應用越來越廣泛，如菌種鑑定、遺傳多樣性分析、親本選擇、遺傳圖譜的繪製、質量性狀基因和數量性狀位點的定位、分子輔助選擇育種以及系統分類等諸多方面。SSR(simplesequencerepeat)亦稱微衛星(microsatellites)DNA,是指由1-6個鹼基組成的基序(motif)串聯重複形成的DNA片段,其長度一般較短,它們廣泛分布於真核生物的基因組中，如(GT)n、(GATA)n等。重複單元數目差異及重複程度不同可造成SSR片段長度的多態性。SSR具有多態性強、共顯性遺傳、特異性高、在基因組中分布廣泛等優點，被稱為第二代分子標記，易於操作，結果可靠，重複性好，被廣泛的應用於真核生物的遺傳育種研究中。在基因組序列未知的情況下，SSR分子標記的引物獲得主要通過傳統的基因組文庫和富集文庫篩選法進行，引物的獲得相對困難。目前食用菌SSR分子標記開發和應用還非常少。為了有效地開發利用白靈菇的資源優勢，需要建立白靈菇的SSR分子標記技術體系，為白靈菇的菌種鑑定、資源保護、雜交育種提供科學的理論依據。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何獲得白靈菇的DNA指紋圖譜。為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對。本發明所提供的一種獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對(即獲取白靈菇簡單序列重複(SSR)標記的引物對)，是由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF89/baiSSRR89的引物對。為解決上述技術問題，本發明還提供了獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A。本發明所提供的獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A(即獲取白靈菇簡單序列重複標記的成套引物對A)，由所述baiSSRF89/baiSSRR89和下述四種引物對中的四種、三種、兩種或一種引物對組成：A1)由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF150/baiSSRR150的引物對；A2)由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF90/baiSSRR90的引物對；A3)由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF189/baiSSRR189的引物對；A4)由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF162/baiSSRR162的引物對。為解決上述技術問題，本發明還提供了獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B。本發明所提供的獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B(即獲取白靈菇簡單序列重複標記的成套引物對B)，由所述成套引物對A和下述15種引物對中的n種引物對組成，n為15至1中的任一個自然數：B1)由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF108/baiSSRR108的引物對；B2)由SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF118/baiSSRR118的引物對；B3)由SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF122/baiSSRR122的引物對；B4)由SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF143/baiSSRR143的引物對；B5)由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF87/baiSSRR87的引物對；B6)序列表中SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF91/baiSSRR91的引物對；B7)序列表中SEQIDNo.23和SEQIDNo.24所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF195/baiSSRR195的引物對；B8)序列表中SEQIDNo.25和SEQIDNo.26所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF93/baiSSRR93的引物對；B9)序列表中SEQIDNo.27和SEQIDNo.28所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF83/baiSSRR83的引物對；B10)序列表中SEQIDNo.29和SEQIDNo.30所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF98/baiSSRR98的引物對；B11)序列表中SEQIDNo.31和SEQIDNo.32所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF86/baiSSRR86的引物對；B12)序列表中SEQIDNo.33和SEQIDNo.34所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF164/baiSSRR164的引物對；B13)序列表中SEQIDNo.35和SEQIDNo.36所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF53/baiSSRR53的引物對；B14)序列表中SEQIDNo.37和SEQIDNo.38所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF62/baiSSRR62的引物對；B15)序列表中SEQIDNo.39和SEQIDNo.40所示的兩條單鏈DNA組成的名稱為baiSSRF41/baiSSRR41的引物對。上文中，SEQIDNo.1所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF89，SEQIDNo.2所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR89，SEQIDNo.3所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF150，SEQIDNo.4所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR150，SEQIDNo.5所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF90，SEQIDNo.6所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR90，SEQIDNo.7所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF189，SEQIDNo.8所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR189，SEQIDNo.9所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF162，SEQIDNo.10所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR162，SEQIDNo.11所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF108，SEQIDNo.12所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR108，SEQIDNo.13所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF118，SEQIDNo.14所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR118，SEQIDNo.15所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF122，SEQIDNo.16所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR122，SEQIDNo.17所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF143，SEQIDNo.18所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR143，SEQIDNo.19所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF87，SEQIDNo.20所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR87，SEQIDNo.21所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF91，SEQIDNo.22所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR91，SEQIDNo.23所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF195，SEQIDNo.24所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR195，SEQIDNo.25所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF93，SEQIDNo.26所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR93，SEQIDNo.27所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF83，SEQIDNo.28所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR83，SEQIDNo.29所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF98，SEQIDNo.30所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR98，SEQIDNo.31所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF86，SEQIDNo.32 所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR86，SEQIDNo.33所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF164，SEQIDNo.34所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR164，SEQIDNo.35所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF53，SEQIDNo.36所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR53，SEQIDNo.37所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF62，SEQIDNo.38所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR62，SEQIDNo.39所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF41，SEQIDNo.40所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR41。為解決上述技術問題，本發明還提供了獲取白靈菇DNA指紋圖譜的產品。本發明所提供的獲取白靈菇DNA指紋圖譜的產品(即獲取白靈菇簡單序列重複多態性的產品)，含有所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對、所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A或所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B。上述產品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒與儀器組成的系統，如由上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對、上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A或上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B和下述至少一種試劑和/或儀器組成的系統：進行PCR擴增所需的其它試劑、進行凝膠電泳所需的試劑、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統和照相機。為解決上述技術問題，本發明還提供了製備所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對、所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A或所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B的方法。本發明所提供的製備所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對、所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A或所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B的方法，包括將任一所述的引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。為解決上述技術問題，本發明還提供了一種獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法。本發明所提供的一種獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法(即獲取白靈菇簡單序列重複多態性的方法)，包括：1)以白靈菇的基因組DNA為模板，用所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對、所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A或所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；2)將1)中得到的所述PCR擴增產物進行電泳，得到所述白靈菇的DNA指紋圖譜(即得到所述白靈菇的簡單序列重複多態性)。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，每25μLPCR擴增反應體系中含有1μL模板DNA(25ng/μL)、1μL正向引物(10μM)、1μL反向引物(10μM)、12.5μL2×TaqPCRMix，其餘為無菌雙蒸餾水。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述PCR擴增的退火溫度可為53-57℃， 其中，用所述baiSSRF189/baiSSRR189引物對進行PCR擴增的退火溫度為53℃；用所述baiSSRF86/baiSSRR86引物對進行PCR擴增的退火溫度為54℃；用所述baiSSRF89/baiSSRR89引物對、所述baiSSRF108/baiSSRR108引物對、所述baiSSRF118/baiSSRR118引物對、所述baiSSRF122/baiSSRR122引物對、所述baiSSRF143/baiSSRR143引物對、所述baiSSRF87/baiSSRR87引物對、所述baiSSRF91/baiSSRR91引物對、所述baiSSRF150/baiSSRR150引物對、所述baiSSRF93/baiSSRR93引物對、所述baiSSRF83/baiSSRR83引物對、所述baiSSRF98/baiSSRR98引物對、所述baiSSRF90/baiSSRR90引物對、所述baiSSRF164/baiSSRR164引物對和所述baiSSRF53/baiSSRR53引物對進行PCR擴增的退火溫度均為55℃；用所述baiSSRF162/baiSSRR162引物對進行PCR擴增的退火溫度為56℃；用所述baiSSRF195/baiSSRR195引物對、所述baiSSRF62/baiSSRR62引物對和所述baiSSRF41/baiSSRR41引物對進行PCR擴增的退火溫度均為57℃。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述PCR擴增中，用所述baiSSRF189/baiSSRR189引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述PCR擴增中，用所述baiSSRF86/baiSSRR86引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述PCR擴增中，用所述baiSSRF89/baiSSRR89引物對、所述baiSSRF108/baiSSRR108引物對、所述baiSSRF118/baiSSRR118引物對、所述baiSSRF122/baiSSRR122引物對、所述baiSSRF143/baiSSRR143引物對、所述baiSSRF87/baiSSRR87引物對、所述baiSSRF91/baiSSRR91引物對、所述baiSSRF150/baiSSRR150引物對、所述baiSSRF93/baiSSRR93引物對、所述baiSSRF83/baiSSRR83引物對、所述baiSSRF98/baiSSRR98引物對、所述baiSSRF90/baiSSRR90引物對、所述baiSSRF164/baiSSRR164引物對和所述baiSSRF53/baiSSRR53引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序均如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述PCR擴增中，用所述baiSSRF162/baiSSRR162引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min； 最後72℃延伸7min，4℃保存。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述PCR擴增中，用所述baiSSRF195/baiSSRR195引物對、所述baiSSRF62/baiSSRR62引物對和所述baiSSRF41/baiSSRR41引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序均如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。上述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法中，所述電泳具體可為聚丙烯醯胺凝膠電泳，所述聚丙烯醯胺凝膠電泳中，所述聚丙烯醯胺凝膠的濃度為8％(質量百分含量)。本發明所提供的利用所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的方法得到的白靈菇DNA指紋圖譜也屬於本發明保護的範圍。本發明還提供了下述1)-3)中任一種應用：1)所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的引物對、所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對A或所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的成套引物對B在獲取白靈菇DNA指紋圖譜中的應用；2)所述獲取白靈菇DNA指紋圖譜的產品在獲取白靈菇DNA指紋圖譜中的應用；3)所述白靈菇DNA指紋圖譜在構建白靈菇SSR聚類分析圖中的應用。上文中，所述白靈菇可為如下20種白靈菇中的至少一種：白3、白4、白5、白6、白7、白8、白9、白10、白11、白12、白13、白14、白10×白12、白工廠1號、白工廠2號、白工廠3號、白順、白焦作、阿魏菇和中農一號。實驗證明，採用本發明的20種SSR分子標記的引物對中任一種引物對均可以在供試的20種白靈菇菌株的基因組DNA中擴增出多態性條帶，共擴增出119條DNA片段，其中多態性條帶為85個，獲得了20種白靈菇的DNA指紋圖譜。依據20種SSR分子標記的引物對擴增的基因型數據，對20種白靈菇菌株進行了遺傳多樣性分析，菌株的分類結果與傳統的分類學鑑定方法結果一致，阿魏菇和中農一號與其它菌株親緣關係較遠。採用5種SSR分子標記的引物對(baiSSRF89/baiSSRR89引物對、baiSSRF150/baiSSRR150引物對、baiSSRF90/baiSSRR90引物對、baiSSRF189/baiSSRR189引物對和baiSSRF162/baiSSRR162引物對)共擴增出44條DNA片段，其中多態性條帶為37條，用上述5種SSR分子標記的引物對獲得的結果與20種SSR分子標記的引物對的結果基本一致，說明應用SSR分子標記鑑定白靈菇菌種的遺傳多樣性和親緣關係是可行的。本發明為白靈菇品種DNA指紋鑑定和雜交育種提供了技術支持。附圖說明圖1為利用baiSSRF118/baiSSRR118引物對在20種白靈菇中擴增出的多態性條帶 的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜。圖2為利用baiSSRF53/baiSSRR53引物對在20種白靈菇中擴增出的多態性條帶的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜。圖3為利用20種SSR引物對進行的20種白靈菇的聚類分析圖。圖4為利用5種SSR引物對進行的20種白靈菇的聚類分析圖。上述圖1和圖2中，泳道M為分子量為100-1500bp的DNAMarker；泳道1-20分別為如下的白靈菇品種擴增出的多態性條帶：白3、白4、白5、白6、白7、白8、白9、白10、白11、白12、白13、白14、白10×白12、白工廠1號、白工廠2號、白工廠3號、白順、白焦作、阿魏菇和中農一號。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的白靈菇菌株白3、白4、白5、白6、白7、白8、白9、白10，、白11、白12、白13、白14、白10×白12、白工廠1號、白工廠2號、白工廠3號、白順和白焦作(許峰，劉宇，王守現，張英春，趙爽，耿小麗，孟莉莉.北京地區白靈菇菌株的RAPD分析.生物技術.2010,20(4):21-23.)公眾可從北京市農林科學院獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的白靈菇菌株阿魏菇(王成，馮婷,薛曉珍,王海燕，嚴淑雲，喬坤雲.新疆阿魏菇與杏鮑菇中胺基酸含量的分析研究.胺基酸和生物資源.2013,35(2):56-58.)公眾可從北京市農林科學院獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的白靈菇菌株中農一號(劉秀明,鄭素月,圖力古爾,黃晨陽,張金霞.溫度脅迫對白靈側耳菌絲保護酶活性的影響.食用菌學報.2010,17(2):60-62)公眾可從北京市農林科學院獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的DNA提取試劑盒DNeasyplantMiniKit為德國Qiagen公司的產品。下述實施例中2×TaqPCRmix為北京艾德萊生物科技有限公司的產品。下述實施例中相關試劑的配製：PDA綜合培養基：將馬鈴薯去皮後切成片狀，取200g去皮馬鈴薯加入到500mL 水中煮沸30min，用16層紗布進行過濾，收集濾液；向濾液中加入20g葡萄糖，16g瓊脂，3g磷酸二氫鉀，1.5g硫酸鎂，5g蛋白腖和10mgVB1，混勻後加水定容至1L，錐形瓶分裝後115℃滅菌30min。TBE[5×]:Tris-Cl54g，硼酸27.5g，濃度為0.5M的EDTA溶液20mL，加水定容至1L。用時稀釋到0.5×。40％(w/v)聚丙烯醯胺:丙烯醯胺380g，甲叉雙丙烯醯胺20g，加水定容至1L，完全溶解後用0.45μm濾膜過濾，4℃保存。聚丙烯醯胺凝膠：40％(w/v)聚丙烯醯胺24mL，10％(w/v)過硫酸銨0.9mL,N，N，N』，N』，-四甲基二乙胺(TEMED)0.1mL，0.5×TBE94mL。固定液：100mL冰醋酸，加水定容至1L。染色液：硝酸銀1g，去離子水1L，攪拌均勻備用。顯影液：溶液A：無水碳酸鈉60g，去離子水1L，4℃保存；溶液B：濃度為10g/L的硫代硫酸鈉溶液；溶液C為質量百分比為37％的甲醛水溶液；使用時在1L溶液A中加入200μL溶液B和1.5mL溶液C。終止液：100mL冰醋酸，加水定容至1L。實施例1、用SSR分子標記技術獲取白靈菇的DNA指紋圖譜一、白靈菇DNA的提取挑取試管斜面內米粒大小的白靈菇菌塊接種於9mm的PDA平皿上，25℃培養5-6d，再取培養後的菌絲邊緣處米粒大小的白靈菇菌塊接種於新的9mm的PDA平皿上，25℃繼續培養6-7d。白靈菇DNA的提取採用DNA抽提試劑盒DNeasyPlantMiniKit進行，具體操作步驟參見說明書，分別獲得20種白靈菇菌株的DNA基因組原液，20種白靈菇菌株的名稱及菌株編號見表1。取4μL白靈菇菌株的DNA基因組原液，加入196μL的ddH2O，渦旋震蕩混勻，採用分光光度計測定OD260/OD280的值，當OD260/OD280的值在1.8-2.0時，說明基因組中的DNA的濃度較純，可以用於下一步的實驗。白靈菇菌株的DNA基因組原液中DNA的濃度計算公式如下：DNA的濃度(ng/μL)＝50×OD260×稀釋倍數。將白靈菇菌株的DNA基因組原液採用ddH2O進行稀釋，使得稀釋液中DNA的終濃度為25ng/μL，分別分裝至1.5mL的離心管中，貯存於-20℃的冰箱中保存。表1、白靈菇菌株的名稱及菌株編號菌株編號菌株名稱菌株編號菌株名稱3白313白134白414白145白515白10×白126白630白工廠1號7白731白工廠2號8白832白工廠3號9白936白順10白1038白焦作11白1152阿魏菇12白1264中農一號二、白靈菇的DNA指紋圖譜的獲得分別以步驟一獲得的20種白靈菇菌株的DNA作為模板，以表2中的20種引物對中的每種引物對單獨進行PCR擴增，表2中SEQIDNo.1所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF89，SEQIDNo.2所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR89，SEQIDNo.3所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF150，SEQIDNo.4所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR150，SEQIDNo.5所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF90，SEQIDNo.6所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR90，SEQIDNo.7所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF189，SEQIDNo.8所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR189，SEQIDNo.9所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF162，SEQIDNo.10所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR162，SEQIDNo.11所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF108，SEQIDNo.12所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR108，SEQIDNo.13所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF118，SEQIDNo.14所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR118，SEQIDNo.15所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF122，SEQIDNo.16所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR122，SEQIDNo.17所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF143，SEQIDNo.18所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR143，SEQIDNo.19所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF87，SEQIDNo.20所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR87，SEQIDNo.21所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF91，SEQIDNo.22所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR91，SEQIDNo.23所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF195，SEQIDNo.24所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR195，SEQIDNo.25所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF93，SEQIDNo.26所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR93，SEQIDNo.27所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF83，SEQIDNo.28所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR83，SEQIDNo.29所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF98，SEQIDNo.30 所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR98，SEQIDNo.31所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF86，SEQIDNo.32所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR86，SEQIDNo.33所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF164，SEQIDNo.34所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR164，SEQIDNo.35所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF53，SEQIDNo.36所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR53，SEQIDNo.37所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF62，SEQIDNo.38所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR62，SEQIDNo.39所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRF41，SEQIDNo.40所示的單鏈DNA引物的名稱為baiSSRR41。每25μLPCR擴增反應體系中含有1μL模板DNA(25ng/μL)、1μL正向引物(10μM)、1μL反向引物(10μM)、12.5μL2×TaqPCRMix，其餘為無菌雙蒸餾水。表2、20種SSR引物對序列註：「SSRF」代表正向引物，「SSRR」代表反向引物。採用baiSSRF189/baiSSRR189引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。採用baiSSRF86/baiSSRR86引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。採用baiSSRF89/baiSSRR89引物對、baiSSRF108/baiSSRR108引物對、baiSSRF118/baiSSRR118引物對、baiSSRF122/baiSSRR122引物對、baiSSRF143/baiSSRR143引物對、baiSSRF87/baiSSRR87引物對、baiSSRF91/baiSSRR91引物對、baiSSRF150/baiSSRR150引物對、baiSSRF93/baiSSRR93引物對、baiSSRF83/baiSSRR83引物對、baiSSRF98/baiSSRR98引物對、baiSSRF90/baiSSRR90引物對、baiSSRF164/baiSSRR164引物對和baiSSRF53/baiSSRR53引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序均如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。採用baiSSRF162/baiSSRR162引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。採用baiSSRF195/baiSSRR195引物對、baiSSRF62/baiSSRR62引物對和baiSSRF41/baiSSRR41引物對進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序均如下：94℃預變性10min，然後進行如下36個循環：94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；最後72℃延伸7min，4℃保存。將表2中每一種引物對的20種白靈菇菌株的DNA的PCR擴增產物進行濃度為8％(質量百分含量)的聚丙烯醯胺凝膠電泳，電泳液為0.5×TBE，電壓為120v，電泳時間為3h。電泳結束後，採用固定液對電泳後的聚丙烯醯胺凝膠進行固定20min，固定結束後採用去離子水清洗10min，獲得固定後的聚丙烯醯胺凝膠。將固定後的聚丙烯醯胺凝膠放入染色液中，用TS2000A脫色搖床適當轉速染色30min，染色結束後用去離子水衝洗膠板約5min，獲得染色後的聚丙烯醯胺凝膠。將染色後的聚丙烯醯胺凝膠放入顯影液中，在脫色搖床上顯影，待條帶出現到清晰時，將聚丙烯醯胺凝膠放入終止液中5s，終止顯影，並用去離子水將聚丙烯醯胺凝膠衝洗2-3min，得到表2中每一種引物對的20種白靈菇菌株的DNA指紋圖譜。用相機對於表2中每一種引物對的20種白靈菇菌株的DNA指紋圖譜進行拍照存圖。多態性條帶統計時，採用二維矩陣方法，同一水平上將擴增出的強帶或可分辨性好的弱帶，均視為擴增陽性賦值「1」，未擴增出條帶視為擴增陰性賦值「0」，用NTSYSpc2.10軟體進行聚類分析。結果如表3所示，表2中20種SSR分子標記的引物對中每一種引物對均可以在表1的20種白靈菇菌株的基因組DNA中擴增出多態性條帶，多態性條帶統計顯示20種SSR分子標記的引物對共擴增出119條DNA片段，其中多態性條帶為85個，不同引物擴增出的DNA條帶數不等，其分子量範圍為50-300bp，其中包含了豐富的DNA多態信息,baiSSRF89/baiSSRR89引物對進行PCR擴增的多態性比例為100％，多態性條帶為9條。根據20種SSR分子標記的引物對在供試材料(20種白靈菇菌株的基因組DNA)上擴增的基因型數據，對20種白靈菇菌株進行了遺傳多樣性分析(圖3)，供試材料的遺傳相似係數平均值為0.80，最大值為0.95(32號與30)，最小值為0.60(52號與6號)；當遺傳相似係數為0.77時，可將供試菌株分成3大類。第一類為64號(中農一號)，第三類為52號(阿魏菇)，其餘菌株歸為第二類。20種SSR分子標記的引物對的PCR擴增鑑定結果與傳統的分類學鑑定方法結果一致，阿魏菇和中農一號與其它菌株親緣關係較遠，用此方法能夠準確的區分。表3、20種SSR分子標記的引物對的多態性結果表4中選取的5種SSR分子標記的引物對共擴增出44條DNA片段，其中多態性條帶為37條。根據5種SSR分子標記的引物對在供試材料(20種白靈菇菌株的基因組DNA)上擴增的基因型數據，對20份白靈菇菌株進行了遺傳多樣性分析(圖4)，供試材料的遺傳相似係數平均值為0.81，最大值為1(9號與10)，最小值為0.48(52號與6號)；當遺傳相似係數為0.73時，可將供試菌株分成3大類。第一類為64號(中農一號)，第三類為52號(阿魏菇)，其餘菌株歸為第二類。5種SSR分子標記的引物對的PCR擴增鑑定結果與傳統的分類學鑑定方法結果一致，阿魏菇和中農一號與其它菌株親緣關係較遠，用此方法能夠準確的區分。同時，用5種SSR分子標記的引物對獲得的結果與20種SSR分子標記的引物對的結果基本一致，說明應用SSR分子標記鑑定白靈菇菌種的遺傳多樣性和親緣關係是可行的。表4、5種SSR分子標記的引物對的多態性結果當前第1頁1 2 3