甘蔗杆狀病毒啟動子的製作方法

2023-10-10 12:22:29

專利名稱：：甘蔗杆狀病毒啟動子的製作方法植物遺傳工程的一個最主要的目的是獲得具有改良的特性或性狀的植物。這些特性或性狀包括病毒抗性，昆蟲抗性，除草劑抗性，增強的穩定性和改良的營養價值等。遺傳工程的最新進展已經能夠在植物細胞中摻入預選定的基因，以便賦予選擇的植物需要的特性。然後，在再生植物的細胞中表達導入的基因，即「轉化基因」，從而使植物表現出轉化基因編碼的特性或性狀。為了在植物細胞中表達轉化基因，必須存在適當的調節信號並且處於與轉化基因相關的適當位置。這些調節信號通常包括啟動子區域，5』一非翻譯引導序列和3』多聚腺苷酸化序列。啟動子區影響生產轉化基因的RNA產物，和轉化基因產生的蛋白質產物的速度。啟動子活性也可以依賴於其它幾個順式作用的調節元件的存在，這些元件與細胞因子一起決定強度，特異性和轉錄起始位點(綜述參見Zawel和Reinberg，當代細胞生物學評論，4，488(1992))。強啟動子能夠以比弱啟動子更高的速度引導RNA的合成。組成型啟動子在許多或所有細胞類型中引導RNA的產生。花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)在植物中是強的組成型啟動子(Odell等人，自然，313，810(1985)；Jensen等人，自然，321，669(1986)；Jefferson等人，EMBO雜誌，6，3901(1987)；Kay等人，科學，236，1299(1987)；Sanders等人，核酸綜述，4，1543(1987))。通過從轉基因植物的葉子，莖，根和花製備的提取物中檢測報導基因蛋白質或mRNA的高的水平已經表明了這一點。結果，在植物遺傳工程領域廣泛使用了CaMV35S啟動子。雖然CaMV35S啟動子在涉及細胞提取物的測試中似乎是強的組成型啟動子，但是在細胞和組織水平的詳細的報導基因產物的組織學分析顯示出在植物的組織中基因產物的表達具有高度的變化。雖然CaMV35S啟動子在單子葉植物中是強啟動子，CaMV是花椰菜花葉病毒，是一個類逆轉錄病毒(pararetrovirus)的亞類，具有二十面體外殼，並且只感染雙子葉植物。甘蔗杆狀病毒(ScBV)，鴨蹠草黃斑駁病毒(CoYMV)和水稻tungro杆狀病毒(RTBV)是badnaviruses，它們是具有杆狀外殼並且主要感染單子葉植物的雷尼轉錄病毒的一個亞類。從CoYMV分離的啟動子片段具有的表達組織特異性類型不同於CaMV35S啟動子所具有的類型。含有與β-葡糖醛酸糖苷酶報導基因(iGUSi，±uidA)連接的CoYMV啟動子的轉化菸草植物顯示雖然CoMYV啟動子在所有器官中是活性的，β-葡糖醛酸糖苷酶活性主要存在於韌皮，韌皮相關細胞，根，莖，葉子和花的軸薄壁組織(Medberry等人，植物細胞，4，185(1992)；Medberry和Olszewski，植物雜誌，3，619(1993))。相反，CaMV35S啟動子在大多數細胞類型中是活性的(Medberry等人，植物細胞，4，185(1992)；Medberry和Olszewski，植物雜誌，3，619(1993))。另外，與重複的CaMV35S啟動子相比，CoYMV啟動子在菸草懸浮細胞中有30％活性，並且在玉米懸浮細胞中有25％活性(Medberry等人，植物細胞，4，185(1992))。含有與GUS基因連接的RTBV啟動子的轉基因水稻顯示了強的韌皮特異的啟動子活性。這與這一啟動子在水稻原生質體中的表達一致。但是，RTBV啟動子在玉米原生質體中只顯示了弱的活性(Bhattacharyya-Pakrasi等人，植物雜誌，4，71(1993)；Yin等人，植物雜誌，7，969(1995))。相反，對應的CaMV啟動子在原生質體中，和在轉基因植物的差不多所有組織中顯示了強啟動子活性(Hohn和Futterer綜述，Curr.Opin.Genet.Dev.2，90(1992))。所以，需要的是高表達的組成型啟動子，以在可育的轉基因單子葉和雙子葉植物中表達轉化基因。本發明提供了一種分離和純化的DNA分子，它含有預選定的DNA區段，該預選定DNA區段含有一種甘蔗杆狀病毒(ScBV)啟動子，或其生物活性亞單位，它在單子葉和雙子葉植物，植物組織，植物部分或植物細胞中賦予可操縱連接的預選定DNA區段的組成型高水平表達。雖然ScBV的基因組核苷酸序列是已知的(Bouhida等人，病毒遺傳學雜誌，74，1(1993))，即使在ScBV基因組與密切相關的病毒，如CoYMV和RTBV的啟動子序列進行核苷酸序列比較後，對於基因組長度病毒RNA的啟動子的定位仍然沒有明確。令人意外的是，不象對CoMYV和RTBV啟動子觀察到的強的組織特異表達，ScBV啟動子在許多細胞類型中是強的和組成型的啟動子。本發明的優選的實施方案是含有ScBV啟動子的預選定DNA區段，該啟動子含有SEQIDNO3，即對應於ScBV基因組的核苷酸位置5999-7420的預選定DNA區段。如下文所述，ScBV啟動子在A.sativa和A.thaliana中賦予組成型和微管基因表達。所以，ScBV啟動子可以用於在單子葉和雙子葉植物中的組成型或組織特異性植物和非植物基因表達。例如，ScBV啟動子可以連接給予莊稼抵抗在莖攻擊莊稼禾本科植物的害蟲例如攜帶大麥黃矮病毒的蚜蟲的抗性的基因，或給予雙子葉植物宿主組織特異抗性的基因，其中，致病原例如大豆孢囊線蟲靶擊諸如根的器官。本文所用的「ScBVi包括任何能夠系統地感染Saccharum或相關屬的非包被的，杆狀的，含有DNA的badnavirus。Lockhart和Olszewski在病毒學百科全書中，Webster和Granoff編輯，學術出版社，紐約，NY(1994)中敘述了badnaviruses的其它區別性的特徵。本文所用的術語「ScBV啟動子」是指一種核苷酸序列，當該序列與編碼蛋白質，RNA轉錄物，或其混合物的預選定DNA區段可操縱地連接時，導致連接的預選定DNA區段，即編碼的RNA和/或蛋白質的表達。優選的ScBV啟動子與SEQIDNO3，SEQIDNO4或SEQIDNO5至少具有60％，優選地至少約80％，更優選地至少約90％，和甚至更優選地至少約95％的核苷酸同一性。本發明的另一個優選的實施方案是含有啟動RNA轉錄的最小數目的鄰接核苷酸的ScBV啟動子。本文所使用的「生物活性的」指具有至少約0.1％，優選地至少約10％，和更優選地至少約25％，的含有SEQIDNO3，SEQIDNO4或SEQIDNO5的ScBV啟動子的活性。通過本領域已知的方法可以確定啟動子的活性。例如，參見Medberry等人，植物細胞，4，185(1992)；Medberry等人，植物雜誌，3，619(1993)；Sambrook等人，在分子克隆實驗室手冊(1989)；McPherson等人，美國專利號5,164,316。本發明還提供了一種表達盒，包括一種含有在宿主細胞中具有功能的SCBV啟動子的第一個預選定的DNA片段，它與編碼一種蛋白質、RNA轉錄物、或它們的聯合物的第二個預選定的DNA片段可操縱連接。優選的宿主細胞是植物細胞，例如單子葉或雙子葉植物細胞。本發明的另一個優選的實施方案是含有可操縱地連接可選擇標記基因的ScBV啟動子的表達盒。本發明的另一個優選的實施方案是含有包括SEQIDNO3的ScBV啟動子的表達盒。本發明也提供了從轉化植物細胞選擇穩定遺傳轉化體的方法和從所述的轉化的植物細胞生產可育的轉基因植物的方法。生產轉化的植物細胞的方法包括在可再生植物細胞中導入含有第一個預選定的DNA區段的重組DNA區段，以生產轉化細胞，第一個預選定的DNA區段含有可操縱地連接第二個預選定DNA區段的ScBV啟動子。然後，鑑定或選擇轉化細胞系。的轉化方法的例子包括利用微粒轟擊以便在再生單子葉植物細胞中導入可操縱地連接ScBV啟動子的編碼在表現型上可觀察或可檢測的特性的預選定DNA區段。本發明的優選的實施方案是轉化細胞中的重組DNA區段的表達給予轉化細胞表現型特徵如除草劑或抗生素抗性的方法。如本文所用，術語「重組DNA區段」指已經從任何適當的組織來源衍生或分離和從與其它的細胞成分如核酸或蛋白質的結合物分離的核酸，即DNA。隨後在體外可以化學地改變該DNA，使它的序列不是天然存在的，或對應於其定位不同於在沒有轉化外源DNA的基因組中的定位的天然存在的序列，使它們可以被測序，複製和/或表達。優選的分離的重組DNA區段包括一個第一預選的DNA片段，該第一預選的DNA片段含有一種在植物細胞中具有功能的ScBV啟動子，它與第二預選的DNA片段可操縱連接，該第二預選的DNA片段含有一種可選擇標記基因。另一個優選的分離的重組DNA區段包括對應於已經存在於植物基因組的基因，或通常不存在於植物基因組的基因的第二個預選定DNA區段，它給予植物農業上有用的表現型例如昆蟲抗性。如果預選定DNA區段通常存在於植物基因組中，它可能不表達或不高度表達。所以，導入預選定的DNA區段以改變植物細胞中預選定的DNA區段編碼的蛋白質或RNA轉錄物的表達。本發明也提供了生產可育轉基因植物的方法。該方法包括在可再生植物細胞中導入含有第一個預選定DNA區段的重組DNA區段以生產可再生轉化細胞，該第一個預選定DNA區段含有可操縱地連接第二個預選定的DNA區段的ScBV啟動子。選擇或鑑定轉化細胞的群體，並且從中再生可育的轉基因植物。通過所述轉基因植物的完整的有性過程將重組的DNA區段轉移到它的子代，使子代植物表達這一DNA區段。所以，本發明也提供了轉基因植物，和起源於其中的種子，其它植物部分，組織和子代植物。本發明的轉基因植物包括但不限於轉基因T0或R0植物，即從轉化植物細胞再生的第一個植物，轉基因T1或R1植物，即第一代子代植物，和起源於它們的含有和表達重組DNA區段的更加後代的子代植物。微粒轟擊可以用於在再生單子葉植物細胞中導入重組DNA區段，而農桿菌介導的DNA轉移可以用於在可再生雙子葉植物細胞中導入重組DNA。本發明也提供了一種轉化的單子葉植物或雙子葉植物，它們的細胞含有一種重組的DNA區段，該區段含有一種第一預選的DNA片段，該第一預選的DNA片段含有一種與第二個預選定DNA區段有效連接的甘蔗杆狀病毒啟動子。在轉化細胞中，第二個預選定的DNA區段的表達量不同於與轉化細胞的區別僅限於缺乏該重組DNA區段的植物細胞中的表達量。在一些情況中，這樣的細胞可以包括轉化的，或轉基因植物的相同部分的未轉化的細胞。第二個預選定DNA區段的表達使轉化植物或其部分從相應的未轉化植物或其部分中鑑定出來。通過轉化植物的完整的正常的有性過程將重組DNA區段轉移到下一代。本發明也提供了包括從本文敘述的方法獲得可育轉基因植物子代的方法。本文中，對於植物細胞，植物部分(包括種子)，植物組織或植物來說，術語「轉基因的」或「轉化的」是指含有通過「遺傳工程」轉化方法已經在植物細胞，植物部分，植物組織或植物的基因組中導入分離的，純化的預選定DNA區段的植物細胞，植物部分，植物組織或植物。即，轉基因植物細胞，植物部分，植物組織或植物的基因組增加了至少一種預選定的DNA片段。術語「野生型」，「天然」或「非轉基因」指未轉化的植物細胞，植物部分，植物組織或植物，即沒有通過預選定的DNA區段的存在而被改變基因組的植物細胞，植物部分，植物組織或植物。植物分子生物學領域的普通技術人員可以獲得的各種方法中的任何一種均可進行本發明的植物的轉化。這些方法包括但不限於微粒轟擊，微注射，原生質體或含有部分細胞壁的細胞的電穿孔，碳化矽纖維介導的DNA轉移和農桿菌介導的DNA轉移。用於實施本發明的植物包括但不限於，燕麥，小麥，大豆，玉米，菸草，水稻，大麥，土豆，西紅柿，萵筍，油菜，棉花，亞麻，甜菜，高粱，向日葵，苜蓿，小米和黑麥。附圖的簡要說明圖1描述了甘蔗杆狀病毒的推測的胺基酸序列(SEQIDNO1)。圖2描述了甘蔗杆狀病毒的核苷酸序列(SEQIDNO2)。圖3描述了含有用於植物轉化的ScBV啟動子的表達盒。圖4描述了(A)用於測試A.sativa中ScBV啟動子活性的構建體的圖譜。將得到的含有ScBV盒1，2或3的pMON755i衍生物分別命名為pScBV-1，pScBV-2，或pScBV-3；和(B)用於測試A.thaliana中的ScBV-3盒啟動子活性的雙重載體中的報導基因區的圖譜。在pOCA101的SalI和XbaI位點中克隆了ScBV-3盒。克隆的步驟導致除去了SpeI/StuI位點和SalI/XhoI位點。圖5檢測GUS活性的A.sativa和A.thaliana組織染色(A)A.sativa花葯；(B)A.sativa子房；(C)A.thaliana花器官；(D)A.sativa小穗；(E)A.sativa莖；(F)A.sativa葉子；(G)A.thaliana葉子。本發明的詳細說明在植物中導入外源基因(轉化基因)以便提供含有改良的農業特性的可育轉基因植物對於農業在世界範圍內的長期改良和擴展具有潛力。本發明提供轉化基因的組成型和強表達，例如編碼在植物中產生改變的農業或生理特性的物質。這樣的起源於此的轉基因植物和種子可以有性地轉移這一特性到它們的子代。轉基因植物的特性的例子包括增強的抗逆性，昆蟲抗性，疾病抗性(例如，細菌，病毒和真菌)，提高的產量，提高的營養值，和提高的穀粒組成或質量。為了在植物，植物細胞，植物組織或植物部分中提供組成型和強的轉化基因的表達，例如含有SEQIDNO3的甘蔗杆狀病毒啟動子可操縱地連接特定的轉基因，即預選定的DNA區段，並且導入可再生的植物細胞中。得到的再生轉基因植物以高的和均一的水平，優選地在轉化植物的全部組織和細胞中表達由預選定的DNA區段編碼的蛋白質或RNA轉錄物。優選的ScBV啟動子序列定位於ScBV基因組(SEQIDNO2)的核苷酸5999和7420(SEQIDNO3)之間。優選地，5』非翻譯引導序列與啟動子偶聯。引導序列可以是來自ScBV基因組本身或可以不是來自ScBV，例如，玉米乙醇脫氫酶第一個內含子，和來自矮牽牛HSP70(Winter等人，分子遺傳學，211，315(1988)；大豆HSP17.9(Raschke等人，分子生物學雜誌，199，549(1988)；或玉米HSP70(Rochester等人，EMBO雜誌，5，541(1986))的5』非翻譯引導序列。1.受體細胞本發明使用了易於轉化，並且隨後易於再生成穩定的可育植物的受體。對於單子葉植物的轉化，例如，可以利用不成熟的胚，分生組織，配子組織，胚發生懸浮培養物或胚發生愈傷組織作為用於本發明的實踐的受體細胞的來源。燕麥的轉化的優選的受體細胞是從不成熟的胚起源的燕麥愈傷組織培養物。為了提供這樣的受體燕麥細胞的培養物，將燕麥的不成熟的胚去除外殼並滅菌。將這種胚在液體培養基中過夜溫浴，然後切出胚，並將胚麟一側朝下放置於固體培養基產生愈傷組織。產生愈傷組織培養基的優選的固體培養基是MS2D(參見，Torbert等人，植物細胞報導，14，635(1995))。對於雙子葉植物轉化，可以利用器官和組織培養物可被用作受體細胞。所以，雙子葉植物的組織，例如，葉子，種子和根可以提供用於實施本發明的受體細胞的來源。優選在固體支持物上生長培養的敏感受體細胞。以培養基的形式提供培養物的營養物質，並且控制培養物的環境條件。支持再生植物培養物的生長的培養基和環境條件是本領域已知的。II.DNA序列事實上，可以將任何DNA成分投送到受體植物細胞以最終產生本發明的可育轉基因植物。選擇的用於細胞導入的DNA區段或基因通常編碼一種蛋白質並且可以在得到的轉化細胞中表達，以產生可篩選或可選擇的特性和/或給予再生植物改良的表型。選擇的用於細胞導入的DNA區段或基因也可以編碼反義RNA，即在未轉化的植物細胞中表達的預定的RNA分子，或其部分的互補物。反義RNA的轉錄抑制了互補的RNA，例如，編碼不需要的特性的RNA。所以，可以利用以載體和質粒形式、或線狀DNA片段、在某些情況下僅含有有待在植物中表達的DNA元件的預選擇的DNA片段。但是，這並不總是這樣的，本發明也包括摻入非表達轉化基因的轉基因植物。在Weising等人(Ann.Rev.Genet.22，421(1988))，和Lundquist等人(美國專利號5,484,956)(全部引入本文作為參考)的表1，2和3中提供了舉證的DNA序列。在一些實施方案中，人們可能希望在植物轉化中利用能複製的病毒載體，如可以用於作物轉化的那些，以便將預選定的DNA區段轉移進入植物。這樣的載體包括例如小麥矮小病毒(WDV)「穿梭」載體，如pW1-11和PW1-GUS(Ugaki等人，核酸綜述，19，391(1991))。這些載體能夠在作物細胞以及大腸桿菌中自我複製，這樣可以增強檢測遞送到轉基因非作物植物細胞的DNA的敏感性。複製載體也可以用於遞送與來自可轉座元件如Ac，Ds，或Mu的DNA序列側接的基因，因為這些元件將促進需要的DNA的整合，並且因而增強穩定轉化的頻率。可轉座元件也可以用於在細菌中導入缺乏選擇和維持質粒載體所需要的元件的DNA片段，如抗生素抗性基因和DNA複製原點。用於在植物細胞中導入的DNA包括起源於或分離於任何來源的DNA，隨後可以對它們的結構，大小和/或功能進行表徵，進行化學改變，並隨後導入植物。從一個來源「分離」的這樣的DNA的例子將是通過化學手段，例如通過利用限制性內切酶從所述的來源切出或除去的有用的DNA序列，能夠對它進行進一步操作，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)分離或擴增，並且通過遺傳工程的方法用於本發明。從限制酶消化物對給定的DNA片段的回收和分離可以利用聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，並將其遷移率和已知分子量的標記DNA片段進行比較鑑定出需要的片段，切去含有需要的片段的凝膠部分，將DNA於凝膠分離。參見Lawn等人，核酸綜述，9，6103(1981)，和Goeddel等人，核酸綜述，8，4057(1980)。所以，DNA是「分離的」因為它不含有至少一種在天然狀態下通常與該RNA或DNA相結合的汙染的核酸，並且優選基本上不含有其它的哺乳動物的RNA或DNA。短語「不含有至少一種通常與之結合的汙染的核酸」包括核酸被再導入源細胞或天然細胞中，但是在不同的染色體定位，或側接源細胞中通常不存在的核酸序列的情況。「衍生」於一種來源的DNA的例子是一種DNA序列或片段，它在給定的生物體中被認為是有用的片段，並且它是通過化學合成的基本上純淨的形式。所以，「重組或預選定的DNA」包括完全合成的DNA序列，半合成的DNA序列，從生物來源分離的DNA序列，和從RNA衍生的DNA序列，以及它們的混合物。導入的DNA包括，但不限於，來自植物基因的DNA，非植物基因如那些來自細菌，酵母，動物或病毒的那些。另外，從給定的植物基因型分離預選定的DNA片段並且隨後在同樣的基因型中導入多拷貝預選定的DNA區段，例如增強給定的基因產物的生產是在本發明的範圍內的。導入的DNA可以包括修飾的基因，基因的部分，嵌合基因，包括來自同樣或不同植物基因型的基因。將術語「嵌合基因」或「嵌合DNA」定義為至少含有兩個DNA序列或區段的基因或DNA序列或區段，這兩個DNA序列或區段在天然條件下不結合DNA，或該DNA序列或區段的連接和定位的方式通常不存在於未轉化的植物的天然基因組中。本發明中用於轉化的導入的DNA可以是環狀或線性，雙鏈或單鏈。通常，DNA是嵌合DNA的形式，如質粒DNA，也可以含有由調節序列側接的編碼區域，該調節序列促進存在於得到的植物中的重組DNA的表達。通常，導入的DNA是相對較小的，即，小於約30kb，以便使已知的隨著DNA大小的增加而增強的對物理、化學或酶的降解的任何敏感度降低。如上文所述，由被導入植物基因組的DNA分子編碼的蛋白質，RNA轉錄物或它們的混合物的數量最好事先確定，例如被導入的DNA可以形成從一個到約5-10個這樣的產物。A.製備表達盒本發明的表達盒可以含有重組DNA分子，該DNA分子含有可操縱地連接在宿主細胞中，最好是植物細胞中具有功能的ScBV啟動子的預選定DNA區段。表達盒本身最好是嵌合的，即，該表達盒含有來自至少兩個不同種類的DNA，或含有來自相同種類的DNA，它是以「天然」或野生型種類中不存在的方式連接或結合。1.本發明的含有ScBV啟動子的DNA分子啟動子是調節基因表達的DNA區。通常在病毒以及原核生物和真核生物細胞的編碼序列的上遊的側接DNA序列中發現了啟動子區。啟動子序列提供了下遊基因序列的轉錄的調節，並且通常包括從約50到約2,000個核苷酸鹼基對。啟動子序列也可以含有調節序列如可以影響基因表達水平的增強子序列。一些分離的啟動子序列可以提供異源DNA的基因表達，異源DNA是不同於天然或同源DNA的DNA。已知啟動子序列是強的或弱的或可誘導的。強啟動子提供了高水平的基因表達，而弱啟動子提供了非常低水平的基因表達。可誘導啟動子是提供應答外源加入試劑或對環境或發育的刺激的基因表達的啟動和關閉。啟動子也可以提供組織特異或發育的調節。對於異源DNA是強的啟動子的分離的啟動子序列是非常有用的，因為它提供了足夠的基因表達的水平，從而可容易地檢測和選擇轉化細胞，並且當需要時可提供高水平的基因表達。本發明的DNA分子包括含有甘蔗杆狀病毒(ScBV)啟動子的預選定DNA區段。ScBV是一種擬逆轉錄病毒。通常，擬逆轉錄病毒具有引導RNA轉錄物進行轉錄的啟動子，該RNA轉錄物的作用是病毒基因組複製的模板和作為mRNA。在環狀雙鏈病毒DNA複製的過程中，宿主tRNA的3』末端結合在ScBV轉錄物的5』末端附近，以便通過病毒編碼的逆轉錄酶引導DNA合成。所以，通常，ScBV啟動子在病毒基因組中定位於tRNA結合位點的5』端和第三個開放讀碼框架(ORFIII)的5』一半的3』端。通過Bouhida等人(出處同上)敘述的方法，通過純化病毒粒子和/或病毒DNA可以製備來自ScBV分離物的啟動子，並且利用本領域已知的方法克隆啟動子區，例如篩選連接ScBV病毒DNA片段與可篩選的標記基因產生的DNA表達文庫。在替代方案中，利用簡併引物，例如，BADNAT(Lockhart和Olszewski，培育香蕉和車前草用於昆蟲和疾病的INIBAP會議，105-113(1994))和與病毒基因組的保守區例如，tRNA結合位點或編碼病毒複製酶的DNA的引物可以從病毒DNA擴增ScBV啟動子。本發明的優選的實施方案是含有預選定DNA區段的分離的和純化的DNA分子，該DNA區段含有包括SEQIDNO3，SEQIDNO4或SEQIDNO5或其核苷酸序列突變體的ScBV啟動子(參見下面)。同樣優選的是含有抑制或幹擾ScBV啟動子產生的RNA轉錄物，例如，具有高級別的二級結構或編碼潛在的起始(ATG)密碼子的RNA轉錄物的DNA排外序列的ScBV啟動子。通過Sambrook等人，在分子克隆實驗室手冊，冷泉港(1989))中敘述的標準方法，預選定的DNA區段可以結合ScBV啟動子。簡要地說，利用限制酶可以將預選定的DNA區段亞克隆在啟動子的下遊以便保證DNA插入在與啟動子相關的適當方向，使DNA可以表達。一旦預選定的DNA區段可操縱地連接啟動子，可以將這樣形成的表達盒亞克隆進質粒或其它載體。2.本發明的DNA分子的變異體通過本領域已知的各種方法可以製備編碼含有SEQIDNO3，SEQIDNO4或SEQIDNO5的ScBV啟動子的核苷酸序列變異體的核酸分子。這些方法包括但不限於從天然來源分離(在天然存在的核苷酸序列變異體的情況中，例如來自ScBV的其它分離物，從感染的植物物質分離)或通過低聚核苷酸介導的(位點特異)誘變製備，PCR誘變，和較早製備的ScBV啟動子的變異體或非變異體的表達盒誘變。低聚核苷酸介導的誘變是製備ScBV啟動子的核苷酸替換變異體的優選的方法。這一技術如Adelman等人，DNA，2，183(1983)敘述是本領域已知的。簡要地說，通過將編碼需要的突變的低聚核苷酸與DNA模板雜交來改變ScBV啟動子DNA，其中模板是含有未改變的或天然的ScBV啟動子的DNA序列的質粒或噬菌體的單鏈形式。在雜交後，利用DNA聚合酶合成模板的整個第二個互補鏈，從而摻入低聚核苷酸引物，並且編碼ScBV啟動子中的選定的變化。通常使用至少25個核苷酸長度的低聚核苷酸。最佳的低聚核苷酸具有12到15個與模板在編碼突變的核苷酸的兩側完全互補的核苷酸。這保證了低聚核苷酸將適當地與單鏈DNA模板分子雜交。利用本領域已知的技術如Crea等人，美國科學院院刊755765(1978)所述可容易地合成低聚核苷酸。通過那些起源於噬菌體M13載體的載體(可使用可通過商業途徑獲得的M13mp18和M13mp19載體)或如Viera等人，酶學方法，153，3(1987)所述含有單鏈噬菌體複製原點的那些載體，可以產生DNA模板。所以，可以在這些載體中的一個中插入突變的DNA以便產生單鏈模板。在Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(冷泉港實驗室出版，N.Y1989)中敘述了單鏈模板的生產。或者，利用標準技術通過變性雙鏈質粒(或其它)DNA可以產生單鏈DNA模板。為了改變天然DNA序列，將低聚核苷酸在適當的雜交條件下與單鏈模板雜交。然後加入DNA聚合酶，通常的DNA聚合酶I的Klenow片段以便利用低聚核苷酸作為合成的引物合成模板的互補鏈。這樣形成了雜合雙鏈分子，DNA的一個鏈編碼ScBV啟動子的突變形式，並且其它鏈(原始模板)編碼天然的，未改變的ScBV啟動子的序列。然後，在適當的宿主細胞，通常原核生物如大腸桿菌JM101中轉化該雜合雙螺旋分子。在細胞生長後，將它們塗布在瓊脂糖平板上，並且利用32磷酸放射性標記的低聚核苷酸引物篩選，鑑定出含有突變DNA的細菌克隆。然後除去突變區，並將其放置於適當的載體進行蛋白質的生產，通常使用這種類型的表達載體轉化適當的宿主。可以對上述的方法進行修改，以產生同源雙鏈分子，其中質粒的兩條鏈含有突變。對該方法的修改如下將單鏈低聚核苷酸與如上所述的單鏈模板退火。三個脫氧核糖核苷酸，脫氧核糖腺苷(dATP)，脫氧核糖鳥苷(dGTP)，和脫氧核糖胸苷(dTTP)的混合物與修飾的硫代脫氧胞苷稱為(dCTP-(aS)(可以從Amersham公司得到)組合。在模板低聚核苷酸混合物中加入這一混合物。在這一混合物中加入DNA聚合酶後，產生了與模板除了突變的鹼基以外相同的DNA鏈。另外，這一新的DNA鏈將含有d(CTP-(aS)而不是dCTP，其作用是保護它不受限制性內切酶的消化。在利用適當的限制性酶對該雙鏈異源雙鏈的模板鏈產生缺口後，利用ExoIII核酸酶或另一個適當的核酸酶，在含有待誘變的位點的區域之後消化模板鏈。然後，終止反應，留下只是部分單鏈的分子。然後，在存在所有四個脫氧核糖核苷酸三磷酸，ATP和DNA連接酶時，利用DNA聚合酶形成完全的雙鏈DNA同源雙鏈。然後，可以將這一同源雙鏈分子轉化進入適當的宿主細胞如大腸桿菌JM101。本發明的實施方案包括含有預選定的DNA區段的分離的和純化的DNA分子，該預選定DNA區段含有包括SEQIDNO3，或沒有減少啟動子的生物學活性的SEQIDNO3的核苷酸序列的變異體的ScBV啟動子。3.優選的預選定DNA區段本發明的優選的實施方案提供了當在植物中從ScBV啟動子表達預選定的DNA區段時，在可育植物中導入預選定DNA區段給予植物需要的農業特性的方法。例如，在Lundquist等人(美國專利號，5,484,956)，Lundquist等人(美國專利號，5,508,468)，Dobres(國際申請PCT/US95/11231)和通過K.Weising等人(Ann，.Rev.Genet.22，421(1988)，參見表1，2和3)，所有引入本文作為參考中公開了這樣的DNA區段或「基因」。但是，本發明沒有限制編碼需要的農業特性的預選定DNA區段範圍，因為許多其它編碼給予植物需要的特徵的蛋白質或RNA轉錄物的預選定DNA區段是在本發明的範圍內的。預選定DNA區段編碼的優選的農業特性包括但不限於，昆蟲抗性或耐性，除草劑抗性或耐性，疾病抗性或耐性(例如對病毒或真菌致病原的抗性)，壓力耐性(增強的鹽耐受性)，增強的食物含量或增加的產量。例如，遺傳研究已經表明，對於抵抗特別植物致病原感染的植物，植物必須具有與存在於致病原基因組中的單無毒(avr)基因直接或間接反應的抗性基因(R)。所以，在缺乏R基因的植物中導入含有R基因的預選定DNA區段可以給予植物表達對應的avr基因的致病原的抗性。通過在植物中導入編碼病理相關(PR)的蛋白質的預選定DNA區段可以獲得增強的真菌感染的抗性。PR蛋白質是穀類應答一些致病原真菌的感染合成的蛋白質(Scott，AustralasianPlantPath，23，154(1994))。通過在植物中導入編碼病毒包衣蛋白質的預選定DNA區段可以獲得增強的病毒感染的抗性。例如，Nelson等人(生物/技術。6，403(1988))公開了在西紅柿植物中菸草花葉病毒(TMV)的病毒給予植物對TMV和對西紅柿花葉病毒(ToMV)，與TMV相關的病毒的抗性。Clark等人(國際申請PCT/EP92/03001)公開了當與病毒接觸時在玉米中表達玉米矮化花葉病毒包衣蛋白質導致了展示減弱的疾病症狀。Vaeck等人(自然，328，33(1987))公開了在菸草中Bacillusthurigenesis(Bt)內毒素基因的表達給予那些植物對昆蟲感染更大的耐性。Lundquist等人(美國專利號5484,956)公開了編碼Bt內毒素的基因的表達可以給予轉基因玉米的昆蟲抗性。另外，可以想像在植物中可以導入不止一個預選定DNA區段。例如，在可再生植物細胞中可以導入含有可選擇標記基因(參見下面)和給予特定的病毒如大麥黃矮病毒抗性的基因的質粒。4.在表達盒中的可任意選擇的序列表達盒可以非強制性地含有其它DNA序列。a.標記基因為了提高鑑定轉化體的能力，除了可表達預選定DNA區段外還具有可選擇或可篩選標記基因。「標記基因」是給予表達標記基因的細胞明顯不同的表現型，並且所以允許這樣的轉化細胞區別於沒有標記的細胞的基因。根據是否標記給予可通過化學手段「選擇」即，通過利用選擇試劑(如除草劑，抗生素，或諸如此類)的特性，或是否它可簡單地通過觀察或測試即通過「篩選」(例如，β-葡萄糖苷酶)鑑定特徵，這樣的基因可以編碼可選擇或可篩選的標記。當然，許多適當標記基因的例子是本領域已知的，並且可以用於本發明的實踐中。包括在可選擇或可篩選標記基因的術語中的也有編碼其分泌可以檢測為鑑定或選擇轉化細胞的手段的「可分泌標記」的基因。例子包括編碼可以通過抗體相互反應鑑定的可分泌抗原，或甚至可以通過它們的催化活性檢測的可分泌酶的標記。可分泌蛋白質有許多類別，包括，小的，例如通過ELISA可檢測的可擴散蛋白質，在細胞外溶液中可檢測的小的活性酶(例如，α-澱粉酶，β-內醯胺酶，膦絲菌素，乙醯轉移酶)；和插入或陷入細胞壁的蛋白質(例如，包括引導序列的蛋白質如在擴展的表達單位或菸草PR-S中發現的)。本發明公開的元件通過使用特定的標記基因進行詳細舉證，但是在本公開物中，除了下面闡述的一個，本領域的技術人員將明了許多其它的可能的可選擇和/或可篩選的標記基因。所以，能夠理解的是下面的討論是例證而不是詳盡的說明。在本領域已知的本文公開的技術和常用的重組技術中，本發明給予在受體細胞中導入任何基因，包括標記基因以便生成轉化的單子葉植物的可能性。1.可選擇標記用於本發明的關係中的可能的可選擇標記包括但不限於，編碼卡那黴素抗性並且可以利用卡那黴素G418和諸如此類選擇的neo基因(Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199，183(1985))；編碼巴龍黴素抗性的nptII基因；編碼潮黴素B抗性的hyg基因；編碼bialapho抗性的bar基因；編碼改變的EPSP合成酶蛋白質(Hinchee等人，生物技術，6，915(1988))所以給予glyphosate抗性的基因；給予bromoxynil抗性(Stalker等人，科學，242，419(1988))的腈水解酶基因如來自Klebsiellaozaenae的腈水解酶基因；給予咪唑啉，磺醯脲類，或其它ALS抑制化學物(歐洲專利申請，154,204，1985)的突變體乙醯乳酸合成酶基因(ALS)；氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等人，生物化學雜誌，263，12500(1988))；給予除草劑茅草枯抗性的茅草枯脫滷酶基因；或給予5-甲基色氨酸抗性的突變的鄰氨基苯甲酸合成酶基因。當利用突變EPSP合成酶基因時，通過摻入適當的葉綠體轉移肽，CTP可以明了其它優點(歐洲專利申請，0,218,571，1987)。同時參見Lundquist等人的表1(美國專利號，5,484,956)。能夠用於選擇轉化體的可選擇標記基因的說明性實施方案是編碼膦絲菌素乙醯轉移酶，如bar基因(參見Somers等人，出處同上，(1992))的酶的基因。膦絲菌素乙醯轉移酶(PAT)在除草劑bialaphos，膦絲菌素(PPT)中失活活性成分。PPT抑制穀氨酸合成酶(Murakami等人，Mol.Gen.Genet.205，42(1986)；Twell等人，植物生理學，91，1270(1989))引起氨的快速積累和細胞死亡。2.可篩選標記可以利用的可篩選標記包括但不限於編碼各種色原底物是已知的酶的β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)；編碼在植物組織中調節花青苷色素(紅色)的生產的產物(Dellaporta等人，在染色體結構和功能，263-282(1988))；編碼各種色原底物已知的酶的β內醯胺酶基因(Sutcliffe，PNASUSA，75，3737(1978))；編碼可以轉化色原兒茶酚的兒茶酚過氧化物酶的xylE基因(Zukowsky等人，PNSAUSA，80，1101(1983))；α-澱粉酶基因(Ikuta等人，生物技術，8，241(1990))；編碼能夠氧化酪氨酸成DOPA和依次濃縮形成容易檢測的化合物黑素的多巴醌的酶的酪氨酸酶基因(Katz等人，微生物學遺傳雜誌，129，2703(1983))；編碼存在色原底物的酶的β-半乳糖苷酶基因；允許生物螢光檢測的螢光素酶(lux)基因(Ow等人，科學，234，856(1986))；或甚至可以用於鈣敏感生物螢光檢測的水母發光蛋白基因(Prasher等人，Biochem.Biophys，Res.Comm.126，1259(1985))，或綠螢光蛋白質基因(Niedz等人，植物細胞報導，14，403(1995))。可用於本發明的其它可篩選標記是lux基因編碼的火螢光酶。利用例如，X射線膠片，閃爍計數，螢光光譜學，低光攝像機，光子計數照相機或多孔螢光計可以檢測轉化細胞中lux基因的存在。也可以想像可以開發這一系統用於生物螢光的群體篩選，如在組織培養平板上，甚至篩選整個植物。b.其它序列轉錄增強子或增強子的增倍可以用於從特定的啟動子增強表達。這樣的增強子的例子包括但不限於來自CaMV35S啟動子和章魚氨酸合成酶基因的元件(Last等人，美國專利號，5,290,924，1994年3月1日公開)。建議當用於植物轉化時，利用增強子元件如ocs元件，特定的多拷貝元件，將是增強從鄰接啟動子的轉錄。由於在轉錄起始位點或編碼序列的起始位點即未翻譯的引導序列之間插入的DNA序列可以影響基因表達，也可以利用特定的引導序列。優選的引導序列包括含有選擇指導附著基因的最佳表達的序列的那些，即包括可以增強或維持mRNA穩定性和預防不恰當的翻譯的起始的優選的同感引導序列(Joshi，核酸綜述，15，6643(1987))。這樣的序列是本領域技術人員已知的。但是，一些引導序列，例如RTBV的引導序列，具有預期降低mRNA穩定性和/或降低mRNA的翻譯的高度的次級結構。所以，不具有高度次級結構或具有不抑制mRNA穩定性和/或降低翻譯的高度次級結構的引導序列，或起源於在植物中高度表達的基因的引導序列將是最優選的。當需要時，也可以包括調節元件如Adh內含子1(Callis等人，基因發展，1，1183(1987))，蔗糖合成酶內含子(Vasil等人，植物生理學，91，5175(1989))或TMVΩ元件(Gallie等人，植物細胞，1，301(1989))。其它用於本發明的實踐的這樣的調節元件是本領域技術人員已知的。另外，可以構建表達盒，並且用於將預選定的DNA區段的基因產物靶擊到植物細胞內的細胞內部分，或指導蛋白質到細胞外環境。通常通過連接編碼轉移或信號肽序列的DNA序列與預選定的DNA區段的編碼序列可以完成。得到的轉移或信號肽將運輸蛋白質到特定的細胞內，或細胞外目的地，並且然後可以翻譯後除去。轉移或運輸肽通過簡化蛋白質運輸通過細胞內膜，例如，液泡，泡囊，質體和線粒體膜起作用，而信號肽指導蛋白質通過細胞內膜。通過簡化蛋白質運輸進入細胞的內部或外部的部分，這些序列可以增強基因產物的積累。可以指導預選定DNA區段編碼的轉移或信號肽到特定的細胞器，如葉綠體而不是細胞質。所以，表達盒可以進一步含有編碼在ScBV啟動子和預選定DNA區段之間可操縱地連接的葉綠體轉移肽編碼DNA序列(綜述看質體靶擊肽，參見HeiJne等人，當前生物化學雜誌，180，535(1989)；Keegstra等人，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，40，471(1989))。例子有利用特異地靶擊蛋白質到質體的rbcS(RuBISCO)轉移肽。例如，參見Glassman等人，美國專利號，5,258,300。在細胞內靶擊DNA本身可能是有用的。例如，靶擊導入的預選定DNA到核可能是有用的，因為這可以增強轉化的頻率。在核本身內，為了獲得位點特異整合，靶擊基因可能是有用的。例如，使通過轉化導入的基因取代細胞內現存的基因將是有用的。當將表達盒導入植物細胞中時，表達盒也可以非強制性地包括作為信號作用於終止轉錄和允許得到的mRNA多聚腺苷酸化的3』非翻譯植物調節DNA序列。3』非翻譯調節DNA序列優選地包括300到1,000核苷酸鹼基對，並且含有植物轉錄和翻譯終止序列。優選的3』元件起源於來自土壤農桿菌的胭脂鹼合成酶基因(Bevan等人，核酸綜述，11，369(1983))，T轉錄物的終止子起源於土壤農桿菌的章魚氨酸合成酶基因，並且蛋白酶抑制劑I或II基因的3』末端起源於土豆和西紅柿，雖然本領域已知的其它3』元件也可以利用。如酶學方法，153，292(1987)中所述可以獲得3』未翻譯調節序列，並且已經存在於從商業來源，如Clontech，PaloAlto，加裡弗尼亞獲得的質粒中。3』未翻譯調節序列可以可操縱地連接預選定的DNA區段的3』末端。可以將表達盒導入表達載體，如質粒中。質粒載體包括了在原核生物和真核生物細胞中容易選擇擴增，轉化表達盒的其它DNA序列，如pUC起源的載體，pSK起源的載體，pGEM起源的載體，pSP起源的載體，或pBS起源的載體。所以，其它DNA序列包括提供載體自我複製的複製原點，優選地編碼抗生素或除草劑抗性的可選擇標記基因，提供表達盒中編碼的插入DNA序列或基因的多倍位點的多克隆位點，和增強原核生物和真核生物細胞轉化的序列。用於植物和原核生物細胞中表達的另一個載體是如載體pGA582舉證的雙重Ti質粒(正如Schilperoort等人，美國專利號4,940,838，1990年7月10日公開)。An已經在前面鑑定了這一雙重Ti質粒載體，並且從An博士處得到(參見酶學方法，153，292(1987))。在原核細菌如大腸桿菌和農桿菌中可以複製這一雙重Ti載體。可以利用農桿菌質粒載體將表達盒轉移到植物細胞。雙重Ti載體優選地包括胭脂鹼TDNA右和左邊界，提供了有效地植物細胞轉化，可選擇標記基因，在T邊界區的獨特的多倍克隆位點，colE1複製原點和廣譜宿主範圍的複製子。可以利用攜帶本發明的表達盒的雙重Ti載體轉化原核生物和真核生物細胞，但優選地用於轉化植物細胞。III.DNA遞送然後，將表達盒或載體導入受體細胞產生轉化細胞。為了在植物細胞中導入表達盒，確認接受DNA的植物細胞的出現頻率是低的，另外，最有可能的是並非所有接受DNA區段或序列的受體細胞將產生DNA穩定整合進植物基因組和/或表達的轉化細胞。一些可能只顯示初始和短暫的基因表達。但是，真正來自任何植物的一些細胞都可以穩定地轉化，並且這些細胞再生了轉基因植物。通過目前可得的方法，包括，但不限於原生質體轉化，鎢絲(Coffee等人，美國專利號5,302,523，1994年3月12日公開)，直接利用含有感染的質粒，感染的病毒的微生物，利用脂質體，利用機械或雷射束微注射方法，利用整個染色體或染色體片段，電穿孔，碳化矽纖維，和微粒轟擊，在植物細胞或組織，或原核生物或真核非植物細胞中可以遞送預選定的DNA區段。本發明的優先實施方案完成了利用包括但不限於微粒轟擊的特別有效的單子葉植物轉化的方法，在單子葉細胞中導入預選定的DNA區段(參見Lundquist等人，美國專利號，5,538,877)。在雙子葉(寬葉)植物如菸草，土豆和苜蓿中導入和表達外源基因已經表明利用土壤農桿菌的腫瘤誘導(Ti)質粒的T-DNA是可能的(參見，例如，Umbeck，美國專利號5,004,863，和國際申請PCT/US93/02480)。利用重組DNA技術和細菌遺傳學，可以將各種外源DNA插入到農桿菌的T-DNA中。在利用含有重組Ti質粒的細菌感染後，將外源DNA插入到宿主植物染色體，這樣產生了遺傳工程細胞，並且最終產生了遺傳工程植物。第二條途徑是導入作為基因載體的根誘導(Ri)質粒。雙子葉植物對農桿菌的轉化是敏感的。最近，單子葉的水稻和玉米顯示了也對農桿菌的轉化敏感。但是，其它許多重要的單子葉農作物包括小麥，大麥，燕麥，高粱，小米，和黑麥還沒有成功地利用農桿菌轉化。但是，在將來，作為載體，Ti質粒可以在上述其它單子葉植物中進行操作。另外，利用Ti質粒作為模型系統，人工構建這些植物的轉化載體是可能的。利用人工方法如微注射，或單子葉原生質體和含有然後可以整合進入植物核DNA的T區的細菌原生質球之間的融合也可以將Ti質粒導入單子葉植物。雙子葉植物的其它轉化方法包括Horsch等人的葉盤方法(科學，227，1229(1985))和Fry等人採用的用於Brassicanapus的(植物細胞報導，6，321(1987))。IV.生產和鑑定穩定的轉基因植物在利用如上所述的任何方法將預選定的DNA區段遞送到受體細胞後，通常本發明的下一步驟包括鑑定用於進一步培養和再生植物的轉化細胞。如上所述，為了提高鑑定轉化體的能力，可以利用如或除了可表達的預選定DNA區段的可選擇或可篩選的標記基因。在這種情況中，然後，通常利用細胞與選擇的試劑或各種試劑接觸測試潛在的轉化細胞群體，或者將可以篩選細胞的需要的標記基因特徵。A.選擇鑑定轉化細胞的方法的例證實施方案包括將目標培養物與選擇的試劑，如代謝抑制劑，抗生素，除草劑或如上所述的諸如此類接觸。在培養中，已經轉化和已經穩定整合給予利用的選擇試劑抗性的標記基因的細胞將生長和分裂。敏感細胞將不能經受進一步的培養。還可以看到，可篩選和可選擇標記的聯合將可用於轉化細胞的鑑定。在一些細胞或組織類型中，選擇試劑如抗生素卡那黴素或G418可能不提供足夠的選擇性殺死以便明顯地鑑定轉化細胞，或引起轉化體和非轉化體的真正非選擇性抑制，從而導致選擇技術失敗。因此，建議利用生長抑制化合物，如抗生素，濃度低於導致100％抑制的選擇，接著篩選表達可篩選的標記基因，如gus(β-葡糖醛酸酶)或lux(螢光酶)的生長組織將允許人們從經受不住單獨的選擇的細胞或組織類型恢復轉化體。所以，選擇和篩選的聯合可以在各種細胞和組織類型鑑定轉化體。B.再生和種子生產在支持植物再生的培養基中可以培養接觸選擇試劑中生存的細胞，或在篩選測試中得分陽性的細胞。然後允許選擇或篩選鑑定並且在支持再生的適當培養基中培養的轉化細胞以便再生成成熟的植物。在植物已經達到莖和根發育時期，可以將它們轉移到溫室進一步生長和測試。然後，從鑑定為表達預選定的DNA區段的細胞系獲得成熟植物。如果可能，再生植物是自花授粉的。另外，將從再生植物獲得的花粉雜交播種到具有重要農業植物表現型的生長植物上。在一些情況中，利用來自這些基因型的植物的花粉對再生植物授粉。首先評估特徵的分離，再評估產生的子代遺傳性地鑑定這一特徵。如果將商業利用這些特徵，在組織培養中選定的特徵在植物中的遺傳率和表達是特別重要的。為了在其它植物的基因組中漸漸摻入預選定的DNA區段，再生植物可以重複地與其它植物基因型雜交。這一過程稱為回交轉換。當為了生產與再現親本除了存在導入的預選定DNA區段基本等基因的回交過程的產物，已經完成了再現親本的足夠次數的雜交時，為了生產含有預選定的DNA區段的純合回交轉換植物，至少自花授粉植物一次。這些植物的子代是真正的繁殖育種。可取代地，在田間生長來自從轉化的組織培養再生的轉化植物的種子，並且自花授粉產生真正的育種植物。來自這些植物的子代成為真正的育種系。一旦選擇了最初的育種系，進行測試雜交，並且產生雜交種子。在田間，在幾個不同的排列種植測試雜交品種和育種群體。一個評估方案是在許多不同的位置生長含有預選定的DNA區段的雜交植物的群體，並且在那些不同位置測量植物的表象。產生了田間信息以及植物健康，優勢和生活力的其它量值。將關於這些雜種的特性以及非轉化雜種的特性的情況進行了比較。在鑑定了轉基因植物的優越特性後，通過傳統的育種技術改進了親本選擇並且產生了近交系。在商業測試和評估程序中測試了具有含有預選定DNA區段的一個或多個親本的雜交植物並且記錄特性。這一測試包括在廣泛的地理區域進行的特性的評估，以及利用擁有的特徵表明特性優勢和因此的值。表達預選定DNA區段的其它優點是生產雜種中親本系的優越特性。C.鑑定為了證實再生植物中預選定DNA區段或「轉基因」的存在，可以進行各種測試。這樣的測試包括本領域技術人員已知的「分子生物學」測試，如Southern和Northern影印和PCR；「生物化學」測試，如利用免疫學手段(ELISA和Western影印)或酶功能檢測蛋白質產物的存在；利用分析整個再生植物的表現型的植物部分測試如葉或根測試等等。1.DNA整合，RNA表達和遺傳特徵利用本領域技術人員已知的技術，從愈傷細胞系或任何植物部分可以分離基因組DNA以便確定預選定的DNA區段的存在。注意到，假定由於細胞中序列的重排或缺失，並不總存在完整的序列。利用聚合酶鏈式反應(PCR)可以確定利用本發明的方法導入的DNA元件的存在。利用這一技術，擴增了DNA的分離的片段，並且利用凝膠電泳檢測。這一類型的分析允許人們確定是否穩定的轉化體中存在預選定的DNA區段，但並不證明在宿主細胞基因組中整合了導入的預選定DNA區段。另外，利用PCR技術確定是否轉化體具有在基因組中的不同位點導入的外源基因，即是否轉化體是獨立起源的是可能的。注意到，利用PCR技術，克隆宿主基因組DNA鄰接到導入的預選定DNA區段是可能的。利用Southern雜交技術可以確定在宿主基因組中整合了DNA的陽性證據和轉化體的獨立特性。利用這一技術，可以鑑定導入宿主基因組和側接宿主DNA序列的特異的DNA序列。所以，給定轉化體的Southern雜交圖譜的作用是鑑定該轉化體的特徵。另外，利用Southern雜交證實導入的預選定DNA區段以高分子量DNA存在，即證實導入的預選定DNA區段已經整合進入宿主細胞基因組。Southern雜交的技術提供了利用PCR獲得的信息，例如，預選定DNA的存在，但也證實了在基因組中的穩定整合，並且鑑定了各個單獨的轉化體。注意到，利用Southern雜交技術的修飾技術，點或片影印雜交的技術，可以獲得源自PCR的相同信息，例如預選定的DNA區段的存在。可以利用PCR和Southern雜交技術證實預選定DNA區段轉移到子代了。在大多數情況中，給定轉化體的鑑定性的Southern雜交圖譜將在子代中作為一個或多個Mendelian基因分開(Spencer等人，植物分子生物學，18，201(1992)；Laursen等人，植物分子生物學，24，51(1994))表明了基因穩定地遺傳了。當利用從植物的任何部分分離的DNA進行DNA分析技術時，在特定的細胞或組織類型中只能表達RNA，並且所以必須製備從這些組織製備用於分析的RNA。PCR技術也可以用於檢測和定量從導入的預選定DNA區段產生的RNA。在PCR的這一申請中，首先必須利用如逆轉錄酶逆轉錄RNA成DNA，然後利用常規PCR技術擴增DNA。在大多數情況中，PCR技術，當利用時，將不證實RNA產物的整合。通過Northern影印可以獲得關於RNA產物的特性的其它信息。這一技術將證明RNA種類的存在，並且給出關於那個完整的RNA的信息。利用點或片影印Northern雜交也可以證明RNA種類的存在或缺乏。這些技術是Northern影印的修飾，並且將只證明RNA種類的存在或缺乏。2.基因表達當可以利用Southern影印和PCR檢測爭論的預選定DNA區段，它們沒有提供關於是否預選定的DNA區段正在表達的信息。通過特定地鑑定導入的預選定DNA區段的蛋白質產物或評估它們的表達產生的表現型變化可以評估表達。生產和鑑定特異的蛋白質的測試可以利用蛋白質的物理化學，結構，功能或其它特性。獨特的物理化學或結構特性允許利用電泳方法，如天然或變性凝膠電泳或等電點聚焦，或利用色譜技術如離子交換或凝膠排除層析分離和鑑定蛋白質。可以利用特異的抗體通過格式如ELISA測試檢測蛋白質的獨特結構，例如檢測nptII。可以利用各途徑的聯合獲得甚至更高的特異性，如Western影印，其中利用抗體結合已經利用電泳技術分離的個別基因產物。可以利用其它技術絕對地證明需要的產物的特徵。如在純化之後利用胺基酸測序評估。雖然這些方法是最通常利用的。另外可以利用其它方法。通過它們的功能性，特別是催化參與特異底物和產物的特異化學反應的酶的能力，也可以利用測試方法鑑定蛋白質的表達。這些反應可以接著提供和定量底物的損失，或物理或化學方法產生反應的產物。通過評估它的表達的表現型結果經常可以確定基因產物的表達。這些測試也可以採取許多形式包括但不限於分析植物的化學組合物，形態學，或生理特性的變化。通過表達影響植物部分的色素的預選定DNA區段編碼蛋白質可以改變和在表現型上或利用當表達預選定的DNA區段編碼的蛋白質時，可以利用高效液相色譜或ELISA可以分析的增加的產物(例如nptII)可以檢測化學組合物。D.在其它植物種類中確立導入的DNA為了在需要的系或種類中摻入預選定的DNA區段，然後可以在常規植物育種過程中利用轉基因植物。通常，如果在許多不同的雜種聯合中可以導入預選定的DNA區段，本文產生的轉化植物的商業價值將是最大的。根據成熟性，穩定性，和其它農業特性中的差異，農民通常種植幾種雜種。同樣，根據他或她的地理位置，農民必須選擇雜種，因為由於這樣的特性如成熟性，疾病，乾旱和昆蟲抗性中的不同，適於一個區域的雜種通常不適於另一區域。因為如此，必須在大量的親本系中摻入基因，以致可以生產含有預選定DNA區段的許多雜種聯合。從一個系或種類到另一個之間轉移基因需要的植物育種和技術是本領域技術人員已知的。所以，優選地以重組DNA的形式，在任何其它系或種類中導入預選定的DNA區段可以利用這些育種方法完成。E.利用轉基因植物期望本文產生的轉基因植物可用於各種商業和研究目的。可以產生轉基因植物用於傳統農業上，以便具有有益於種植者(例如，農業特性如水缺乏的抗性，昆蟲抗性，除草劑抗性或增加的產量)，有益於從植物收穫的穀粒的消費者(例如，在人食物或動物食物中增高的營養含量)的特性。在這樣的用途中，通常在人或動物食物中為了它們的穀粒的用途生長植物。但是，植物的其它部分包括軸，外皮，蔬菜部分和諸如此類也可以具有用途，包括用作動物箐飼料部分或用於裝飾目的。經常，為了工業用途提取作物的化學組成，可以產生已經增強或改變這樣的成分的水平的轉基因植物。也可以發現轉基因植物用於蛋白質或其它化合物的商業製造，其中從植物部分，種子和諸如此類提取或純化需要的化合物。也可以培養，體外生長，或發酵來自這些植物的細胞或組織以便製造這樣的分子。轉基因植物也可以用於商業育種程序，或可以與相關作物種類的植物雜交或育種。例如，通過原生質體的融合，預選定DNA區段的改進可以例如從一個植物種類的細胞轉移到另一個植物種類的細胞。在研究或育種中轉基因植物可以具有許多用途，包括為了鑑定可以利用傳統突變和選擇後來產生的有益的突變，通過插入誘變產生新的突變植物。例子有導入可以用於生產遺傳變異的編碼轉座元件的重組的DNA序列。本發明的方法也可以用於生產具有可以用於鑑定專有系或種類的獨特的「署名序列」或其它標記序列。通過下面的實施例將進一步敘述本發明。實施例I植物轉化的表達盒為了製備含有ScBV啟動子的表達盒，利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增了三個ScBV基因組的區域。這些區域是開放讀碼框架的上遊，推測的tRNA結合位點的上遊，並且不包括AUG密碼子。PCR中使用了BamHI線性化的pScBV-20作為模板(Bouhida等人，J.Gen.Virol.，74，1(1993))。表l顯示了PCR中利用的引物對。擴增反應使ScBV的下列區域得到擴增核苷酸位點5999到7205(利用引物SCBV-PROFORW-5999，SEQIDNO6，引物SCBV-PROREV-7205，SEQIDNO7擴增)，5999-7299(利用引物SCBV-PROFORW-5999，SEQIDNO6和引物SCBV-PROREV-7299，SEQIDNO8擴增)，和5999到7420(利用引物SCBV-PROFOPW-5999；SEQIDNO6和引物SCBV-PROREV-7420，SEQIDNO9擴增)(根據Bouhida等人的編號系統，出處同上)。合成的SCBV-PROFORW-5999包括PstI位點。合成的SCBV-PROREV-7205，SCBV-PROREV-7299和SCBV-PROREV-7420包括StuI位點。在擴增後，用PstI和StuI消化PCR產物，然後凝膠純化。為了製備單子葉表達載體，將凝膠分離的片段連接到pMON755I(Medberry和Olszewski，植物雜誌，3，619(1993))，該質粒已經利用PstI和StuI消化，除去了CaMV35S啟動子片段。pMON755i是通過在GUS基因的5』端插入修飾的玉米乙醇脫氫酶第一個內含子區段從pMON755衍生的(Medberry等人，植物細胞，4，185(1992))。將得到的質粒命名為ScBV-1(5999-7205)，ScBV-2(5999-7299)和ScBV-3(5999-7420)。表1引物名稱序列5』-3』SCBV-PROFORW5999CTCTAGCTGCAGGAAGTTGAAGACAAAAGAAG(SEQIDNO6)SCBV-PROREV-7205GTACGTAGGCCTCACTGAATGGGCCCAGTAC(SEQIDNO7)SCBV-PROREV-7299TACGATAGGCCTTGGCAGACAAGGAATAAAG(SEQIDNO8)SCBV-PROREV-7420GCACGAAGGCCTTGGTGAACTACCGATGATC(SEQIDNO9)MAP-SCBV-GUSCAGGACGGACCATGGATATATCTCC(SEQIDNO10)為了製備用於農桿菌介導的轉化的表達載體，構建一種雙重表達載體。利用PstI和StuI消化ScBV-3，將1.4kb的含有ScBV的片段連接到已經利用SpeI消化，利用Klenow片段填平了突出末端，然後利用PstI消化的pBluscriptKS+(Stratagene，LaJolla，CA)。從得到的構建體，分離Xho-XbaI片段並且連接到已經利用SalI和XbaI消化的pOCA101。pOCA101是其中含有GUS基因的HindIII-EcoRI片段替代了多接頭的pOCA28的衍生物(Medberry等人，核酸綜述，18，5505(1990))。pOCA28(Olszewski等人，核酸綜述，16，10765(1988))具有來自pHP45omega的Smr/Spcr基因(Prenti和Kritsch，基因，28，303(1984))，它取代了含有四環素抗性基因的BgIII/SmaI片段。為了定位ScBV啟動子的轉錄起始位點，在引物延伸反應和/或S1核酸酶反應中利用了標記引物或DNA片段或從ScBV啟動子產生的RNA。表1顯示了用於定位ScBV啟動子的轉錄起始位點的引物(MAP-SCBV-GUSSEQIDNO10)。實施例II利用ScBV啟動子構建體轉化單子葉植物(燕麥)在玉米中的短暫表達分析(利用黑墨西哥甜細胞，「BMS」細胞)和燕麥懸浮培養顯示ScBV-3具有最高水平的表達。具體地說，在BMC細胞中，ScBV-3具有的表達比ScBV-2或pScBV給予的表達產生約25-800倍更獨立的生產GUS表達細胞的事件。利用不成熟的燕麥胚(AvenasativaL.種類GP-1)啟動愈傷組織。利用低倍顯微鏡肉眼選擇易碎的胚愈傷組織(6.6×)並且在含有MS鹽的MS2D培養基上亞培養2星期(Torbert等人，出處同上)。在如Vain等人描述的微粒轟擊之前4小時(植物細胞報導，12，84(1993))，在含有0.2摩爾/升山梨醇和0.2摩爾/升的甘露醇作為等滲滲透的固體MS2D培養基上塗布來源於愈傷組織的組織。通常，可以利用鎢(1.1微米，M-17；Biorad實驗室，Hercules，CA)或金(1.0微米，M-17；Biorad實驗室，Herculis，CA)顆粒微粒轟擊。將約60毫克幹的鎢或金顆粒放置於微管中的1毫升100％的乙醇中。高速旋轉管子1-2分鐘，或利用標準尖頭在低功率下超聲波處理30秒。旋轉重複3次。然後將微管在10000rpm離心1分鐘。除去上清液，加入1毫升無菌蒸餾水，再懸浮顆粒，離心或除去上清液。重複這一過程1次。然後在1毫升無菌蒸餾水中再懸浮顆粒。在旋轉的同時，將足夠4-8次轟炸的50微升在微管中等分。將鎢或金等分試樣儲藏在-20℃。在連續攪拌後，在單個的50微升顆粒等分試樣中，以下面的順序加入下面物質5微升DNA(1微克/微升)，50微升，2.5摩爾/升CaCl2和20微升0.1摩爾/升精胺(游離鹼，組織培養級，西格瑪化學公司)。旋轉混合物3分鐘，在10000rpm進行離心10秒，除去上清液。利用250微升100％的乙醇旋轉洗滌DNA包衣顆粒，然後進行離心，除去上清液。然後在60微升100％乙醇中再懸浮顆粒。然後在大的運載器的中心加入5-10微升懸浮液。將懸浮液在低潮溼度和無振動環境中乾燥1分鐘。將約800毫克組織放置於培養皿的中央。在制動平板下5釐米放置平板，根據製造商的說明，利用BiolisticPDS-1000/He顆粒遞送系統(BioRad實驗室，Hercules，CA)利用pScBV-3和含有連接CaMV35S啟動子的nptII植物可選擇標記的質粒包衣的金顆粒轟炸組織(pH2.4，參見Torbert等人，出處同上)(0.6微克/轟炸)。組織保留在等滲培養基(MS2D加0.4摩爾/升滲透劑)上過夜，並且轉移到黑暗中20℃的MS2D保持培養基上7天。將轉化組織轉移到含有50毫克/升巴龍黴素，利用0.35％低EEOI型瓊脂固體化的選擇培養基(西格瑪化學公司)，並且亞培養2星期(Torbert等人，出處同上)。在約6-8星期分離生長的菌落，並且使其再生長約4星期。在莖再生培養基(MS鹽家鹽酸硫氨素，20克/升蔗糖，2毫克/升NAA，0.2毫克/升BAP，50毫克/升巴龍黴素，pH5.8，利用0.35％低EEOI型瓊脂固體化)中再生莖。在根再生培養基(MS鹽加鹽酸硫胺素，利用0.35％低EEOI型瓊脂固體化)上再生根。然後將植物放置於土壤中，並且生長至成熟。表21可檢測表達的相對水平，用(+)號表示(+)，(++)，和(+++)分別對應於低-中等，中等-高，和高-非常高的相對的組織化學染色2基於23個穩定轉化的獨立系的ScBV啟動子的一般化的表達方式·包括可檢測表達的系的數目，#檢測的系的數目*微管表達在穩定轉化的A.sativa組織中，在蔬菜器官中ScBV-3給予組成型GUS表達，最明顯的是莖(圖5E)。但是，在葉子中，ScBV給予幾乎是，但不絕對地限制於微管組織的表達方式(圖5F)。ScBV-3也在花器官如託苞，鞘膜和子房中組成型地GUS表達(圖5D和圖5B)。篩選再生植物(T0代)的GUS活性。得到56個植物，在一些情況下，從同樣的愈傷組織得到幾個植物。將起源於相同的愈傷組織的植物定義為一個系。因為起源於相同的愈傷組織的植物可以潛在地表示為單獨的事件，歸結從單個愈傷組織恢復的植物的數據。從含有花器官和綠色蔬菜組織的植物手切下燕麥組織。分析23個穩定轉化的獨立細胞系的GUS表達。在存在1∶5000(v/v)稀釋度的去垢劑SilwetL-77(OSISpecialties，Charleston，WV)時，利用GUS組織化學染色緩衝液染色植物組織，並且進行抽真空20分鐘。在室溫染色組織8-48小時，脫色24小時，在70％乙醇中儲藏用於分析。在解剖顯微鏡下評估GUS表達。表2顯示了GUS分析的結果。在幾乎所有的測試的A.sativa器官中檢測GUS活性，在一個器官中含有GUS活性的系趨向於在所有測試的器官中具有活性。莖，託苞，鞘膜和子房具有最高的表達水平。另外，在測試的23個獨立的系中，80％以上在葉子，莖，花梗，葉軸，潁片，小花軸，託苞，鞘膜，花葯和子房中具有可檢測的GUS表達水平。也如Torbert等人(出處同上)所述，利用NPTIIELISA測試(5』-3』，Boulder，CO)確定植物細胞，部分或組織中的NptII水平。在表達GUS的所有系中檢測NptII。從成熟的植物收集A.sativa小花(沒有植物組織)。通過T0植物的自花授粉產生T1種子。將這些種子去殼，然後首先在95％的乙醇中浸泡，然後在2.5％的漂白劑和1-2滴Tween-20/100毫升浸泡5分鐘滅菌，然後用無菌水洗滌3次。在缺乏激素的MS培養基上的品紅盒中萌發種子，生長10-20天，轉移到土壤中。在轉移到土壤之前，對如上所述的T1植物的切下的根的GUS基因表達進行染色。進行分析A.sativa子代(T1)植物，和T1幼苗的GUS基因表達。表3在A.sativaT1幼苗中GUS基因表達1表達的相對水平用+的個數表示(+)，(++)，和(+++)對應於低—中等，中等—高，和高—非常高的組織化學染色。2基於9個穩定轉化的獨立系的ScBV基因組區的一般化的表達類型。*含有可檢測的表達的系的數目/#檢測的系的數目微管表達^在T1代中得到來自9個系的幼苗種子和T1植物顯示了GUS活性，因此證明了GUS基因是可遺傳的。表4顯示了T1植物的GUS分析的結果。相對於T0植物，在大多數器官中T1中的表達水平似乎是減弱了(表2和表4)。這一結果表明表達在子代中減弱了。表4.在成熟的A.sativaT1植物中GUS基因的表達1表達的相對水平用+的個數表示(+)，(++)，和(+++)對應於低—中等，中等—高，和高—非常高的組織化學染色。2基於9個穩定轉化的獨立系的ScBV基因組區的一般化的表達類型。*含有可檢測的表達的系的數目/#檢測的系的數目微管表達^9個T1系中的7個系的植物生長到成熟。實施例III利用ScBV啟動子構建體轉化雙子葉植物(Arabidopsis)利用基本上如vanHoof和Green，植物雜誌，10，41591996)；Bechtold等人，C.rAcad.Sci.，316，1194(1993)所述的真空滲濾方法，將含有連接到GUS基因的ScBV啟動子的表達載體轉化進Arabidopsisthaliana(Columbiaecotype)中，對該方法的修改如下在滲濾溶液中利用200微升/升的SilwetL-33，並且利用土壤農桿菌菌株C58C1(pMP90)作為表達載體的非真核宿主。如Feldmann所述(在「Arabidopsis研究中的方法」(C.Koncz，N.H.Chua，和J.Schell，編輯，世界科學出版社，新加坡，271-289(1992)))，在含有卡那黴素的平板上播種來自進行真空滲濾方法(命名為T1種子)的植物的種子。將攜帶卡那黴素標記的基因的單個植物(T1植物)轉移到土壤中。如上文中對A.sativa組織的描述對這些植物組織進行GUA活性染色，只是對SilwetL-77去垢劑的稀釋度為1∶10000(v/v)，並且將組織進行真空處理5分鐘將染色的溶液真空滲濾到組織中。收集T1植物(T2植物)的種子，同樣染色子代植物(T2植物)的GUS活性。表5和6顯示了在T1和T2A.thaliana植物中表達ScBV啟動子的一般化類型。檢測起源於7個滲濾植物的29個T1植物。將所有起源於單一滲濾植物的轉化的幼苗歸結為一個系。在A.thaliana花中，表達方式大多數是微管的，在一些花中的雄蕊仍然展示了組成型的GUS基因表達(圖5C)。當染色A.sativa的根時，在檢測的44％的系中檢測到了GUS表達，而對於A.thaliana根，在86％的檢測的系中發現了組成型的GUS基因表達。表5.在A.thalianaT1植物中的GUS基因的表達1表達的相對水平用+的個數表示(+)，(++)，和(+++)對應於低—中等，中等—高，和高—非常高的組織化學染色。2基於7個穩定轉化的獨立系的ScBV基因組區的一般化的表達類型。*含有可檢測的表達的系的數目/#檢測的系的數目微管表達表6.在A.thalianaT1植物的GUS基因表達1表達的相對水平用+的個數表示(+)，(++)，和(+++)對應於低—中等，中等—高，和高—非常高的組織化學染色。2基於7個穩定轉化的獨立系的ScBV基因組區的一般化的表達類型。*含有可檢測的表達的系的數目/#檢測的系的數目微管表達@T3種子實施例IV在大豆細胞中ScBV啟動子構建體的導入，轉化R0植物的再生和子代生產大豆外植體起源於從不成熟的種子的胚軸切下的分生組織。在轉化之前，在含有高細胞分裂素的培養基中預溫育分生組織外植體(Barwhale等人，植物學，176，473(1986))。利用1％水瓊脂填充60毫米的培養皿的底部。將胚進行表面滅菌，並植入培養皿的瓊脂中。將一定量的1-3微米金小珠(Alfa化學公司)通過在0.02％聚賴氨酸中漂洗進行聚賴氨酸預包衣，並空氣乾燥。製備含有ScBV啟動子序列的線性表達載體，例如含有ScBV啟動子序列的線性表達載體，例如可操縱地連接預選定的DNA區段的SEQIDNO3。優選地，表達載體進一步含有標記基因，如neo基因(APT3』II)。在35毫克包衣的金小珠中加入水溶液中的225微克表達載體，然後順序加入在N2中乾燥時形成精微沉澱的22微升10毫摩爾/升Na2HPO4和22微升10毫摩爾/升CaCl2。通常，製備了每毫克金小珠1.0到0.001毫克DNA。然後，在100％乙醇中再懸浮乾燥沉澱包衣的小珠，並沉澱在長11毫米寬9毫米的2.0微米塑料包衣的鋁化聚酯薄膜片上。將包衣的小珠放置在聚酯薄膜承載片，最終密度為0.2毫克/釐米2。通常，以每平方釐米0.05-40毫克將小珠加載到承載片上。應用500毫米汞柱的真空。通過電極從2微法的電容器產生一個24千伏的放電，加速大豆胚中的顆粒。從靶表面除去被轟擊的胚，塗布在平板上以便產生器官。例如，參見Barwhale等人，植物學，176，473(1986))。按照Barwhale等人改良的方法(出處同上)，在MS基本培養基上在暗中塗布外植體。在暗中溫育1到2星期後，將組織轉移到含有低水平的細胞分裂素的相同的基本培養基(1.7微摩爾)，以便促進莖延長。在0.5到1.0釐米高度時收穫莖。在2-4個月每個外植體回收3到8個莖。在莖達到0.5-1.0釐米高度後，將它們嫁接到萌發約10天的老大豆幼苗的根上。在嫁接之前，它們在1/2MS培養基上硬化1星期。當獲得足夠的植物組織後立即測試組織中標記基因的存在。例如，如果將neo基因用作標記基因，在植物組織中測試APH3』II活性。通過Southern印跡分析檢測例如編碼病毒包衣蛋白質的所必需的預選定DNA分子的存在。利用適當的限制酶消化來自植物組織的10微克基因組DNA。然後，酚氯仿提取DNA，並利用乙酸銨和乙醇沉澱。在瓊脂糖凝膠上通過電泳分級分離消化的DNA。利用對應於所必需的DNA分子的至少一部分的32P標記探針。在洗滌濾紙後，通過放射自顯影觀察雜交的DNA片段。這樣，植物顯示了攜帶所必需的DNA分子。將其組織已被證實具有標記基因的酶活性或Southern影印分析需要的DNA分子或標記基因是陽性的植物生長到成熟。自花授粉植物，回收種子。利用幼苗生長植物，測試植物的葉子的標記基因相關的酶活性，或通過Southern影印分析需要的DNA分子。實施例V在菸草細胞中導入ScBV啟動子構建體，再生轉化的R0植物和產生子代從表面滅菌的菸草葉子取直徑約6毫米的菸草(Nicotianitabacumvar.samsun)的葉子盤。將這些培養在MS104瓊脂培養基上兩天促進在受傷的表面形成部分細胞壁。然後，在含有具有可操縱地連接預選定DNA區段例如編碼GUS的質粒和另一個編碼卡那黴素抗性的表達盒和pMP90RK輔助質粒的土壤農桿菌細胞的培養物中將它們浸沒。在Luria培養液中過夜生長28℃，溫和振搖。從細菌懸浮液中除去細胞，影印乾燥，如Horsch所述，在菸草細胞的「護士」培養基上放置的濾紙上上面朝下溫育(體外，16，103(1980))。在2或3天後，將葉盤轉移到含有500微克/毫升羧苄青黴素，沒有護士培養基的MS培養基的培養皿上。利用含有輔助質粒pMP90RK的土壤農桿菌細胞和含有包括NOS/NPTII/NOS卡那黴素抗性基因和可選擇標記基因的T-DNA區的不同的植物轉化載體，pMON505的土壤農桿菌細胞產生對照組織。在轉移到MS培養基上10天後，活性生長愈傷組織在對照和轉化平板上似乎是在所有葉盤的周邊。然後，利用Horsch等人所述的過程，從如上所述的轉化的葉盤再生生產轉化的菸草植物(科學，227，1229(1985))。獲得的轉化植物含有包括與β-葡糖醛酸酶基因融合的ScBV啟動子的表達盒。利用同樣的方法獲得含有與相同的預選定DNA區段即，GUS融合的CaMV35S啟動子的轉化的菸草。利用組織學染色方法測試含有ScBV啟動子或CaMV35S啟動子驅動GUS基因的轉化的植物以便確定轉化細胞中GUS活性。將對利用ScBV/GUS/NOS轉化的植物的這些測試的結果與對利用CaMV35S/GUS/NOS轉化的植物進行相同的測試的結果比較。含有ScBV/GUS/NOS和CaMV35S/GUS/NOS構建體的菸草植物的組織化學測試包括檢測轉化植物的植物器官和/或組織切片以便確定GUS活性。利用剃刀刀片徒手切片植物組織製備轉化植物的組織或器官切片成小於0.5毫米厚度的切片。然後，將切片放置於過量的X-gluc溶液中以致完全覆蓋切片。在切片上抽真空可以輔助X-gluc溶液滲透。利用合併25毫升0.2摩爾/升NaPO4緩衝液pH7.9，24.0毫升dH2O，0.25毫升0.1摩爾/升K3[Fe(CN)6]，0.25毫升0.1摩爾/升K4[Fe(CN)6]和0.5毫升1摩爾/升EDTA，pH7.0製備50毫升X-gluc溶液。在這一溶液中，加入來自ResearchOrganics(Cleveland，Ohio)的50毫克X-gluc(5溴-4氯-3idilyl-β-葡糖苷酸)，攪拌直到溶解。然後，通過過濾優選地滅菌溶液。然後將X-gluc溶液中的切片放置於37℃2-4小時。小心防止溶液蒸發。在溫育期後，利用磷酸緩衝液或蒸餾H2O漂洗切片，利用解剖範圍或化合物顯微鏡立即檢測切片。如果存在來自色素的幹擾，可以在FAA溶液(85毫升50％乙醇，5毫升冰乙酸和10毫升福馬林)固定組織24小時。剛剛在染色之前，在染色溶液中加入偏亞硫酸氫鈉到20毫摩爾/升可以緩和酚的問題。出現在測試植物切片的組織中的藍色表明存在GUS活性的陽性測試。在利用CaMV35S啟動子或ScBV啟動子驅動的β-葡糖醛酸酶基因轉化的切片上進行組織學染色測試。由於在單個轉基因植物中，在一些組織染色和在其它組織沒有染色，對CaMV35S啟動子驅動的GUS基因觀察到的典型的染色圖譜。但是，來自利用GUS基因驅動的ScBV啟動子轉化的植物的組織顯示轉化的植物展示了公平的，優選地比利用CaMV35S/GUS轉化的植物中的組織觀察到的更高的GUS表達水平，和更均一的整個組織和細胞的表達方式。整個切片佔主要的藍色說明了這一點。當比較CaMV/GUS植物時，表達的分布和獲得的許多高表達轉基因植物顯示ScBV啟動子在組織分布和表達的均一性中佔優勢。含有轉化植物的90％以上的ScBV/GUS顯示了相當大的，優選地非常強的GUS表達，並且來自植物到植物和組織到組織的染色是均一的。在CaMV/GUS植物中，這一染色始終與含有ScBV的植物一樣好。為了提供ScBV啟動子是強的和組成型表達的啟動子的其它證據，在提取的葉子，花，莖和根中，利用Jefferson等人(EMBOJ.6，3901(1987))的螢光測試測試含有構建體的轉基因Nicotianatabacum植物的GUS活性。在37℃進行溫育15分鐘。切出1克第四個節間葉，花，4釐米長莖切片或根。在液氮中冷凍提取選擇的組織，利用研缽和研杵研磨，再懸浮於0.1摩爾/升K3PO4pH7.8，EDTA，10毫摩爾/升DT，0.8好摩爾/升PMSF，和5％甘油。在2毫摩爾/升4-甲基-umbelliferylglucuromide進行螢光反應。利用HoechstDNA螢光計(TKO100型)測量螢光。通過Bradford測試確定植物提取物的蛋白質濃度。對分析的每種組織，任意地給出CaMV35S啟動子的表達水平為「1」，然後確定ScBV啟動子的相對表達水平。發現ScBV啟動子獲得的GUS表達比利用CaMV35S啟動子獲得的佔優勢。本發明不限於所詳細描述的內容，應當理解，可以對其進行許多變化和修飾而不脫離權利要求所限定的本發明的精神和範圍。序列表(1)總信息(i)申請人明尼蘇達大學校董事會(ii)發明名稱甘蔗杆狀病毒啟動子(iii)序列數目10(iv)通信地址(A)收信人Schwegman，Lundberg，WoessnerKluth，P.A.(B)街道P.O.Box2938(C)城市Minneapolis(D)州MN(E)國家USA(F)郵編55402(V)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容(C)作業系統DOS(D)軟體FastSEQVersion2.0(Vi)目前申請資料(A)申請號PCT/IB97/01338(B)申請日1997年8月13日(C)分類號(Vii)在先申請資料(A)申請號08/694869(B)申請日1996年8月9日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Woessner，WarrenD(B)登記號30440(C)案號600.369WO1(ix)通訊號碼(A)電話612-373-6900(B)傳真612-339-3061(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特徵(A)長度1871胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQIDNO1MetThrGlnArgValArgGlyThrGlySerSerThrIleThrGluAsp151015GlyAlaLeuLeuAspHisGlnIleArgAspTyrArgArgAlaGlnHis202530AlaLysHisGluAlaGlnArgIleAlaGlyGlnAlaLeuAlaPheLeu354045ArgValThrSerAspAspProArgGluLysThrLeuGluMetLeuMet505560GlnProAspValGluLeuThrArgSerMetLysLysArgAlaArgAla65707580PheProAlaGluValLeuTyrGlyProArgSerAspAspIleHisHis859095LysValPheGlnGlySerSerSerGlnAspIleLeuLeuIleAspAsp100105110AsnGlnLeuAspMetThrPheIleLysGluGluThrPheGluGlnLeu115120125GluGlnAlaGlyLeuArgTyrIleHisProGlyIleLeuAlaValArg130135140IleGlnProLeuHisProAspTrpSerGlyLysLeuValPheIleVal145150155160PheArgAspIleArgAspAsnProProArgValLeuGlyAlaMetGlu165170175IleAspLeuSerLysGlyProGlnMetValTyrValIleAsnSerPhe180185190MetThrThrIleLysAspPhePheHisGlyIleGlnLeuThrValLys195200205ValLysGlyTyrGluGlyTrpGlnGlyGluAlaAsnLeuHisIleGlu210215220ArgLeuIleThrAlaArgLeuSerAsnThrThrAsnValTyrPheLys225230235240TyrLysValGluGlyValAlaSerPheIleLysThrLysGlyIleLys245250255AlaIleGluAlaThrLysLysSerValLysGlyIleArgGlyGlyGlu260265270TrpAsnIleLeuProSerLysLeuGluValValMetGlnProThrLys275280285ValGlnThrThrGluAsnTyrAspGlyThrThrSerPheArgPheThr290295300AsnTyrGluGlyAlaSerSerSerLysProValGluHisAsnSerAsp305310315320AspGluAlaTyrMetAlaLeuPheGluGluGluGluGluGluAspAsp325330335IleThrPheLeuAsnArgIleLeuSerLysTyrSerThrGlnGlnLys340345350ValValGlyGluGluGluPheSerProGluGluAspGlnIleIleSer355360365AspPheLeuGlyLysThrGluGluAlaTyrProAlaGluIleGluGlu370375380GluTyrProAlaLeuArgArgLeuGluGlnLeuMetLysThrLysVal385390395400ValValGlnGluIleGluGluProSerGlnProValGluAlaLysMet405410415SerThrSerThrGlySerSerAlaMetIleProAlaAsnMetAspMet420425430AspGlyAsnMetProGlyTyrAlaProAlaGlnGluAlaArgGlyTrp435440445AspSerGlyGluThrSerArgArgAsnTyrGlyGlyHisSerArgLys450455460TrpLysAspGluSerGlnPhePheAsnLeuProSerAlaMetAlaThr465470475480SerGlyAlaMetLeuValLeuThrMetGlyAsnTyrAlaLysGluPhe485490495AspArgTrpGlnSerIleAsnThrAsnLeuLeuAlaSerGlnThrPhe500505510GluAsnAlaGluAspLysIleThrArgIleGluAsnLeuLeuGlyGlu515520525ThrGluLysLeuMetPheGlnThrTrpArgMetAlaPheProThrAla530535540PheGluAlaMetLysThrGlnAlaThrGlyThrAsnGlyThrGlnAsn545550555560ValPheSerGlnMetLysArgIleLeuLeuGlyGluValProGluGln565570575GlyThrThrAsnThrGlnAspAlaAlaTyrLysArgIleLysSerLeu580585590Va1CysGlnGluMetThrTyrProAlaIleMetArgTyrLeuValGly595600605TyrArgAsnLeuAlaAlaArgSerGlyArgAlaTrpValAsnAsnGlu610615620LeuThrAspGluPhePheThrLysLeuProGlyLysLeuGlyAspArg625630635640ValLysGluAlaPheLysLysLysTyrProGlyValGluArgHisVal645650655ProAlaAlaThrArgPheThrTyrAspTyrLeuGluGluIleCysThr660665670GluAsnAsnPheGlnLysGlnLeuArgSerLeuAsnPheCysLysGly675680685PheProValValAsnProValGlyThrArgLysTyrGlyLysLysTyr690695700GlyThrArgLysAlaArgSerTyrArgGlyLysProHisLysSerHis705710715720ValArgIleGluLysLysLysTyrLeuGlnGlnArgGluLysLysCys725730735ArgCysTyrValCysGlySerProAspHisLeuMetLysAspCysLys740745750SerProMetLysArgGlnGluArgValAsnLeuAlaAsnGluLeuAsp755760765IleProAspGlyTyrAspLeuValSerValGlyTyrAspGluSerAsp770775780IleAspGluIleTyrSerValSerGluAsnGluGluCysGlnAlaHis785790795800LeuGlyLeuAsnGluAspGluGlnLeuProLysValProGlnThrPhe805810815GluGluTrpGluGluTyrTyrLysAspGluPheIleMetMetAlaAsp820825830IleGluGluSerGluAsnSerAspGluGluLysGlyProPheLeuVal835840845GlyProLysGlyGlyPheArgHisGlnMetGluValSerTyrLysGln850855860TyrLysCysGluHisAspTrpAspPheThrArgThrArgValLysPro865870875880CysLysArgCysLeuLysThrValThrLysGlyGlnTyrIleTyrCys885890895ArgThrCysLysIleThrValCysHisGluCysSerGluPheCysTyr900905910AsnIleLysIleGluGlyAlaGluAlaValLysProProGluLysLys915920925SerAsnTyrGluLeuLeuAlaLysGlnLeuLeuIleGluAsnSerLys930935940LeuLysMetGluLysGluIleLeuIleGluGluLeuAsnLysGluIle945950955960LysAlaHisGlnGluThrLysLysGlyLysGluLeuTyrIleGluGlu965970975AlaSerThrGluValGluAsnGluIleGluThrTrpLysSerArgAla980985990GluLeuPheGluA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TCAAAGCCAAATTAGCTCAGAATGAACCAACGGAAGAGATGATCCTGCTTACACA660AGCCATAAGGGAAGTAATTCCTTATCCAGATCATCCATACACTGAGCAACTCAGAGAATG720GGGAAACAAAATTCTGGATCCATTCCCCACATTCAAGAAGGACATGTTCGAAAGAACAGA780GCAAGCTTTTATGCTAACAGAGGAACCAGTTCTACTCTGTGCATGCAGGAAGCCTGCAAT840TCAGTTAGTGTCCAGAACATCTGCCAACCCAGGAAGGAAATTCTTCAAGTGCGCAATGAA900CAAATGCCATTGCTGGTACTGGGCAGATCTCATTGAAGAACACATTCAAGACAGAATTGA960TGAATTTCTCAAGAATCTTGAAGTTCTGAAGACCGGTGGCGTGCAAACAATGGAGGAGGA1020ACTTATGAAGGAAGTCACCAAGCTGAAGATAGAAGAGCAGGAGTTCGAGGAATACCAGGC1080CACACCAAGGGCTATGTCGCCAGTAGCCGCAGAAGATGTGCTAGATCTCCAAGACGTAAG1140CAATGACGATTGAGGAGGCATTGACGTCAGGGATGACCGCAGCGGAGAGTACTGGGCCCA1200TTCAGTGGATGCTCCACTGAGTTGTATTATTGTGTGCTTTTCGGACAAGTGTGCTGTCCA1260CTTTCTTTTGGCACCTGTGCCACTTTATTCCTTGTCTGCCACGATGCCTTTGCTTAGCTT1320GTAAGCAAGGATCGCAGTGCGTGTGTGACACCACCCCCCTTCCGACGCTCTGCCTATATA1380AGGCACCGTCTGTAAGCTCTTACGATCATCGGTAGTTCACCA1422(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(Xi)序列描述SEQIDNO6CTCTAGCTGCAGGAAGTTGAAGACAAAAGAAG32(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特徵(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性GTACGTAGGCCTCACTGAATGGGCCCAGTAC31(ii)分子類型cDNA(Xi)序列描述SEQIDNO7(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特徵(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(Xi)序列描述SEQIDNO8TACGATAGGCCTTGGCAGACAAGGAATAAAG31(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特徵(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(Xi)序列描述SEQIDNO9GCACGAAGGCCTTGGTGAACTACCGATGATC31(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特徵(A)長度25鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(Xi)序列描述SEQIDNO10CAGGACGGACCATGGATATATCTCC2權利要求1.一種分離和純化的DNA分子，它含有預選定的DNA區段，該預選定的DNA區段含有甘蔗杆狀病毒啟動子，或其生物學活性亞單位。2.根據權利要求1所述的DNA分子，其中該預選定的DNA區段含有SEQIDNO3。3.根據權利要求1所述的DNA分子，其中該預選定的DNA區段含有SEQIDNO4。4.根據權利要求1所述的DNA分子，其中該預選定的DNA區段含有SEQIDNO5。5.一種表達盒，含有第一預選定的DNA區段，該第一預選定的DNA區段含有一種在宿主細胞中具有功能的甘蔗杆狀病毒啟動子或其生物活性亞單位，它與一種第二預選定的DNA區段可操縱連接，該第二預選定的DNA區段編碼一種蛋白質，RNA轉錄物，或它們的組合。6.根據權利要求5所述的表達盒，還含有一個第三預選定的DNA區段，該第三預選定的DNA區段編碼一種氨基末端葉綠體瞬間肽，它與該第二預選定DNA區段可操縱連接。7.根據權利要求5所述的表達盒，其中該第一預選定的DNA區段含有SEQIDNO3。8.根據權利要求5所述的表達盒，其中該第一預選定的DNA區段含有SEQIDNO4。9.根據權利要求5所述的表達盒，其中該第一預選定的DNA區段含有SEQIDNO5。10.根據權利要求5所述的表達盒，還含有一種增強子元件。11.根據權利要求5所述的表達盒，其中該第二預選定DNA區段含有一種可選擇標記基因或報導基因。12.根據權利要求5所述的表達盒，其中該啟動子在宿主中是組成型表達的。13.根據權利要求5所述的表達盒，其中該宿主細胞是植物細胞。14.根據權利要求13所述的表達盒，其中該宿主細胞是雙子葉植物細胞。15.根據權利要求13所述的表達盒，其中該宿主細胞是單子葉植物細胞。16.一種生產轉化植物細胞的方法，包括(I)向可再生植物細胞中導入一種重組DNA片段，該重組DNA片段含有一種第一預選定DNA片段，該第一預選定的DNA片段含有一種甘蔗杆狀病毒啟動子，它與一種第二預選定的DNA片段可操縱連接，從而產生轉化的細胞，和(ii)識別並選擇轉化的細胞系。17.一種生產可育的轉基因植物的方法，包括(I)向可再生植物細胞中導入一種重組DNA片段，該重組DNA片段含有一種第一預選定DNA片段，該第一預選定的DNA片段含有一種甘蔗杆狀病毒啟動子，它與一種第二預選定的DNA片段可操縱連接，從而產生轉化的細胞，(ii)識別或選擇轉化的細胞的群體，和(iii)從中再生可育的轉基因植物，其中所說的重組DNA片段通過所述轉基因植物的完整的有性繁殖循環被傳遞到它的子代。18.根據權利要求16或17的方法，其中可再生植物細胞是單子葉植物細胞。19.根據權利要求16或17所述的方法，其中可再生植物細胞是雙子葉植物細胞。20.根據權利要求16或17所述的方法，其中該重組DNA分子是通過選自下組的方法被導入植物細胞中的農桿菌介導的DNA轉移，電穿孔，原生質體轉化，和微粒轟擊。21.根據權利要求16或17所述的方法，其中該第一預選定的DNA含有SEQIDNO3。22.根據權利要求16或17所述的方法，其中該第一預選定的DNA區段含有SEQIDNO4。23.根據權利要求16或17所述的方法，其中該第一預選定的DNA區段含有SEQIDNO5。24.根據權利要求16或17所述的方法，其中該重組NDA區段被表達，從而給予轉化細胞一種表型特徵。25.根據權利要求17所述的方法，其中該重組DNA片段在該可育轉基因植物中被表達，從而給予該植物一種表型特徵。26.根據權利要求16或17所述的方法，其中該第二預選定的DNA區段含有可選擇的標記基因或報導基因。27.一種包括從權利要求17的方法得到的、含有所說的重組DNA的可育轉基因植物獲得子代的方法。28.根據權利要求27所述的方法，其中所說的子代是通過將所述的可育轉基因植物與相同種類的植物雜交獲得的。29.根據權利要求27所述的方法，包括從所述的子代獲得種子和從所述的種子獲得含有所述的重組DNA的後續的子代植物。30.根據權利要求29所述的方法，其中將獲得的子代與相同種類的植物回交，以便獲得含有所述的重組DNA的後續的子代。31.根據權利要求30所述的方法，其中從所述的後續的子代植物獲得種子，並且從所述的種子產生含有所述的重組DNA的植物。32.根據權利要求30所述的方法，其中將所述的後續的子代與相同種類的植物回交，獲得含有所述的重組DNA的子代。33.從權利要求16的方法獲得的轉化植物細胞再生的轉化植物。34.權利要求33所述的轉化植物的轉化種子。35.含有所述的重組DNA區段的、根據權利要求17所述的方法生產的T0轉基因植物。36.含有所述的重組DNA區段的、根據權利要求35所述的轉基因T0植物生產的種子。37.來自權利要求35所述的植物的T1轉基因植物，其中所述的T1植物含有所述的重組DNA區段。38.來自權利要求37所述的植物的子代轉基因植物，其中所述的子代植物含有所述的重組DNA區段。39.根據權利要求35，37或38所述的植物，其中該重組DNA區段被表達，從而使該轉基因植物表現出一種表性特徵，使該轉基因植物可以從相應的非轉化的植物中識別出來。40.一種轉化的單子葉植物，其細胞含有一種重組DNA片段，該重組DNA片段含有一種第一預選定DNA片段，該第一預選定的DNA片段含有一種甘蔗杆狀病毒啟動子，它與一種第二預選定的DNA片段可操縱連接，其中，該第二預選定的DNA片段被表達，從而使該轉化的植物可以從對應的非轉化植物中識別出來。41.一種轉化的單子葉植物，其細胞含有一種重組DNA片段，該重組DNA片段含有一種第一預選定DNA片段，該第一預選定的DNA片段含有一種甘蔗杆狀病毒啟動子，它與一種第二預選定的DNA片段可操縱連接，其中，該第二預選定的DNA片段被表達，從而使該轉化的植物可以從對應的非轉化植物中識別出來。42.一種可育的轉基因植物，它含有一種重組DNA片段，該重組DNA區段含有一種第一預選定的DNA區段，該第一預選定的DAN區段含一種甘蔗杆狀病毒啟動子，它與一種第二預選定的DNA片段可操縱連接，其中該第二預選定的DNA區段在轉基因植物的細胞中的表達量不同於與轉基因植物的細胞的區別僅在於不存在重組DNA區段的植物細胞中的表達量，並且其中該重組DNA片段通過該轉基因植物的完整的正常的有性生殖循環被傳遞到下一代。43.由權利要求40，41，或42的植物生產的種子。44.來自權利要求43所述的種子的子代植物。45.起源於權利要求40，41，或42所述的植物的子代種子。46.權利要求42所述的可育轉基因植物，它是單子葉植物。47.權利要求42所述的可育轉基因植物，它是雙子葉植物。48.根據權利要求40，41或42所述的植物，其中該第一預選定DNA區段含有SEQIDNO3。49.根據權利要求40，41，或42所述的植物，其中該第一預選定DNA區段含有SEQIDNO4。50.根據權利要求40，41或42所述的植物，其中該第一預選定DNA區段含有SEQIDNO5。全文摘要本發明提供了含有甘蔗杆狀病毒啟動子和含有所述啟動子的表達盒的分離和純化的DNA分子。同時提供的是在轉基因植物中利用甘蔗杆狀表達啟動子表達蛋白質,RNA轉錄物,或它們的混合物的方法。文檔編號C12N15/82GK1276014SQ97182383公開日2000年12月6日申請日期1997年8月13日優先權日1996年8月9日發明者尼爾·奧爾謝夫斯基,艾麗斯·查夫裡爾,大衛·A·索默斯,班漢姆·洛克哈特,金伯利·A·託伯特申請人:明尼蘇達大學校董事會