Dna片段擴增方法,擴增dna片段的反應裝置和製備該反應裝置的方法
2023-10-10 12:45:19
專利名稱：Dna片段擴增方法,擴增dna片段的反應裝置和製備該反應裝置的方法
技術領域：
本發明涉及擴增相對長的DNA片段的反應裝置和及其製備方法。
背景技術：
已知聚合酶鏈反應(PCR)是一種擴增特定DNA片段的方法(見，例如，美國專利號4,683,195)。在普通的PCR過程中，首先將目標DNA熱變性形成單鏈DNA，並且通過退火，引物與獲得的單鏈DNA結合，所述引物具有與所述DNA末端鹼基序列互補的鹼基序列。其後，通過應用DNA聚合酶來進行互補鏈DNA的延伸反應，並且重複這樣的循環來指數地擴增目標DNA。
常規地，出於在不需另外應用電場的延伸條件下使用掃描隧道顯微鏡觀察鏈型聚合物分子諸如DNA的目的，公開了一項技術，其中當DNA的一端與電極接觸時，將溶液加熱並且其另一端垂直地延伸到電極，由此在延伸時將分子結合和固定到基底上(見，例如，日本專利號3,064,001)。
發明內容
但是，在常規PCR中，通過PCR以相對長的DNA片段，例如數十kb或更長的片段作為模板進行擴增是困難的。
考慮到上述情況，本發明的一個目的是提供一項技術從而在甚至使用長DNA片段的模板情況中進行有效擴增。
本發明的發明人已經考慮到不能有效進行相對較長的DNA片段，例如數十kb或更長的片段模板的PCR過程的一個原因是模板的過長DNA片段傾向於被扭曲，並且因為那個原因，中斷了互補鏈DNA的延伸反應，由此導致了本發明的開發。
由於起始模板使用的長DNA片段諸如，例如，染色體DNA，或通過超聲波打斷的DNA片段除擴增目標部分外還包含許多序列，在那裡發生了更大的扭曲，並且因此其將成為擴增DNA的障礙。在這樣的情況中，考慮通過阻止DNA片段這樣的扭曲可以更高效的進行初級互補鏈的延伸反應。
按照本發明，提供了擴增DNA片段的方法，其包括使DNA片段結合於在基底(base)構件的表面上形成的結合部位；在DNA片段與基底構件的表面結合的狀況下，通過將DNA片段用作模板來合成DNA片段的互補鏈。
由於這提供了將用作模板的DNA片段結合併固定於基底構件的表面的條件，當合成DNA片段的互補鏈時，即使是將相對長的DNA片段用作模板，也可以減少DNA片段的扭曲，由此優選地進行互補鏈的合成。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型(configuration)，其中構造結合部位以結合DNA序列，所述DNA序列位於擴增目標DNA片段的擴增目標區的外側。
在此，「外側」指除擴增目標區之外的擴增目標DNA片段的部分。擴增目標DNA片段的擴增目標區的外側都可以與基底構件的表面結合，或僅有其一個外側也可以與基底構件的表面結合。當僅有其一個外側與基底構件的表面結合時，在通過例如，在互補鏈的合成過程中在反應場中產生某種流速來延伸DNA片段的狀況下，進行互補鏈的合成是優選的。因為具有這樣的構型，可以減少DNA片段的扭曲，由此提供互補鏈的更好的合成。
按照本發明的擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，在所述構型中結合部位可以包括用作固定的寡核苷酸，其具有與擴增目標DNA片段的部分互補的序列。
因為具有這樣的構型，擴增目標DNA片段的部分通過氫鍵在結合部位與用於固定的寡核苷酸結合，從而使DNA片段可以與結合部位結合。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，在所述構型中，結合部位包含兩種或更多類型的用於固定的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有與位於擴增目標DNA片段的擴增目標區的兩個外側中的DNA序列互補的序列。
因為具有這樣的構型，擴增目標DNA片段的擴增DNA靶向區的兩個外側通過氫鍵在結合部位都與用於固定的寡核苷酸結合，由此容許DNA片段通過兩點與結合部位結合。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，其中，在其結合過程中，將DNA片段在延伸條件下與基底構件的表面結合。
因為具有這樣的構型，可以減少DNA片段的扭曲，從而可以適當地進行互補鏈的合成。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，其中通過在其結合過程中使用例如，剪切應力，將DNA片段在延伸條件下，與基底構件的表面結合。可以應用在反應場(field)生產中產生流速的方法，或提供反應場旋轉的方法來提供剪切應力。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，其中，在其結合過程中，通過對DNA片段施加低頻電場，將DNA片段在延伸條件下與基底構件的表面結合。在本文，低頻電場可以是，例如，等於或低於100Hz的電場。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，其中在其結合過程中，通過對DNA片段施加高頻電場，將DNA片段在延伸條件下與基底構件的表面結合。在本文，高頻電場可以是，例如，等於或高於500Hz的電場。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，其還包括在結合DNA片段後，伸展基底構件的表面。
因為具有這樣的構型，可以減少DNA片段的扭曲，從而可以適當地進行互補鏈的合成。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，在所述構型中，互補鏈的合成包括模板DNA片段和互補鏈的變性和分離，其中在DNA片段的結合中，將DNA片段固定在結合部位從而使DNA片段在變性和分離中不從結合部位分離出來。
在模板DNA片段和互補鏈的變性和分離中，通常加入大約95℃的加熱步驟。即使在按照本發明擴增DNA片段的方法中加入所述溫度的加熱步驟，優選將DNA片段固定在結合部位從而避免從結合部位分離DNA片段。例如，當結合部位包括上述的用於固定的寡核苷酸時，通過氫鍵提供的DNA片段與結合部位的鍵合將可能不足以在模板DNA片段和互補鏈的變性和分離過程中避免DNA片段與結合部位鍵合的鈍化。為了避免鈍化在本發明這種情況中的DNA片段與結合部位的鍵合，通過，例如共價鍵可以固定DNA片段和結合部位。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，其中擴增目標DNA片段具有等於或長於10kb的長度。
雖然在常規擴增方法中，當使用這種相對長的DNA片段作為模板時可能會發生DNA片段的扭曲，按照本發明的擴增DNA片段的方法，即使在使用相對長的DNA片段作為模板時，也可以抑制DNA片段的扭曲從而提供更好的擴增反應。
按照本發明擴增DNA片段的方法可以具有一種構型，在所述構型中，使結合部位具有一定形式從而與擴增目標DNA片段的擴增目標DNA區的部分結合，並且所述方法還包括，在互補鏈的合成中，鈍化(deactivating)DNA片段與結合部位的鍵合。作為鈍化DNA片段與結合部位的鍵合的方法，可以加入大約75℃-85℃的加熱步驟。當對模板DNA片段和互補鏈進行變性和分離時，雖然加入大約90℃的加熱，如上所述，與DNA片段與互補鏈的鍵合比較，在結合部位與DNA片段的鍵合中，結合在其上的DNA的鹼基數目非常少。與DNA中具有更大數目的鹼基的情況相比，結合在其上的DNA中的較小數目的鹼基在雙鏈間提供較弱的鍵合強度，並且因此，當加入大約75℃-85℃的加熱步驟時，儘管模板DNA在延伸狀態中沒有從互補鏈中分離出來，仍可以鈍化結合部位與DNA片段的鍵合。在模板DNA片段的互補鏈延伸到某一程度的階段中，通過從結合部位分離模板DNA片段也可以合成其結合部位的互補序列。由於這提供了包括在合成的互補鏈中的結合部位，可以將互補鏈固定在基底構件的表面，由此以提高的效率獲得相對長的DNA片段的擴增。
按照本發明的另一個方面，提供了進行DNA片段擴增反應裝置，其包括基底構件的表面；在基底構件的表面上形成的和能夠結合以擴增目標DNA片段的結合部位。
由於通過將擴增目標DNA片段引入由此構建的反應裝置來使DNA片段結合和固定在結合部位上，即使將相對長的DNA片段用作模板，也抑制了DNA片段的扭曲從而提供DNA片段的更好的擴增。
按照本發明的反應裝置可以具有一種構型，其中在多個區域上形成結合部位，在所述區域之間具有一定距離。在此，優選各個區域之間的距離可以是與擴增目標DNA片段的擴增目標部分的長度大致相同的長度。因為具有這樣的構型，通過提供將位於DNA片段的擴增目標部分的外側的DNA序列與結合位點的結合，可以在將所述DNA片段延伸到一定程度的狀況下，將其固定到基底構件的表面，並且因此可以減少DNA片段的扭曲。
按照本發明的反應裝置可以具有一種構型，其中結合部位可以包括在基底構件表面上形成的多個突出部分。在此，突出部分可以是通過精細加工形成的柱狀構件。優選地，突出部分之間的距離可以是與擴增目標DNA片段的擴增目標部分的長度大致相同的長度。因為具有這樣的構型，通過提供將位於DNA片段的擴增目標部分的外側的DNA序列與結合位點的結合，可以在DNA片段延伸到一定程度的狀況下，將所述DNA片段固定到基底構件的表面，並且因此可以減少DNA片段的扭曲。而且，通過向結合部位提供突出部位，可以在突出部分上捕獲DNA片段以促進固定。
按照本發明的反應裝置可以具有一種構型，其中結合部位與擴增目標DNA片段的兩個外側結合。因為具有這樣的構型，在將DNA片段延伸到一定程度的狀況下，可以將DNA片段固定在基底構件的表面，並且因此可以減少DNA片段的扭曲。
按照本發明的反應裝置可以具有一種構型，其中結合部位包括用於固定的寡核苷酸，其具有與擴增目標DNA片段的部分互補的序列。
按照本發明的反應裝置可以具有一種構型，其中基底構件由能夠伸展的材料組成。例如，基底構件可以由橡膠或塑料材料組成。
而且，按照本發明的反應裝置還可以包括一種組件(unit)，所述組件可以用於在延伸條件下固定DNA片段。這樣的組件的典型實例可以包括施加低頻電場和高頻電場的電場施加組件，以及將剪切應力施加到反應場的剪切應力施加組件。例示的剪切應力施加組件可以包括例如，在反應場中產生流速的攪拌構件，提供反應容器的旋轉的旋轉組件或類似物。
按照本發明的另外一方面，提供了生產反應裝置進行DNA片段擴增的方法，其包括形成結合部位，所述結合部位在基底構件的表面與擴增目標DNA片段結合；以及將擴增目標DNA片段與結合位點結合。
按照本發明生產反應裝置的方法可以具有一種構型，其中，在結合部位的形成中，將用於固定的寡核苷酸固定在基底構件的表面，所述寡核苷酸具有與擴增目標DNA片段的部分互補的序列。
按照本發明生產反應裝置的方法可以具有一種構型，其中在結合DNA片段的過程中，在延伸條件下，DNA片段與基底構件的表面結合。
按照本發明生產反應裝置的方法還可以包括在結合DNA片段後，拉伸基底構件的表面。
按照本發明，即使將相對長的DNA片段用作模板，也可以獲得更好的DNA的擴增。
附圖簡述本發明的上述和其它目標、優勢和特點將通過隨後優選的實施方案與附圖的描述而更加清楚。
圖1是流程圖，其顯示在本發明實施方案中的PCR的程序。
圖2包括透視圖，其舉例說明了在本發明實施方案中一種生產反應裝置的方法。
圖3包括簡圖，其舉例說明了在本發明的實施方案中使用的起始模板DNA的實例。
圖4包括簡圖，其舉例說明了在本發明的實施方案中一種形成反應裝置的柱狀構件的方法。
圖5包括簡圖，其舉例說明了在本發明的實施方案中一種形成反應裝置的柱狀構件的方法。
圖6包括簡圖，其舉例說明了在本發明的實施方案中一種形成反應裝置的柱狀構件的方法。
圖7包括簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中一種生產反應裝置的方法。
圖8包括簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中反應裝置的結構。
圖9包括簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中一種生產反應裝置的方法。
圖10包括簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中，一種固定起始模板DNA的方法。
圖11包括簡圖，其舉例說明在本發明實施方案中的反應裝置。
圖12包括簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中的另一個反應裝置。
圖13包括簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中一種擴增起始模板DNA的方法。
圖14是一個概念簡圖，其舉例說明了在本發明的實施方案中一種固定DNA鏈的方法。
圖15包括方法簡圖，其舉例說明了在本發明實施方案中一種製備基底的方法。
實施本發明的最佳方式圖1是流程圖，其顯示了在本發明實施方案中的PCR的程序。
首先，通過超聲波打斷具有擴增目標部分的染色體DNA以獲得包含起始模板DNA(S10)的片段。雖然在這個場合下，染色體DNA是被隨機打斷的，進行的斷裂使片段包括擴增目標部分和位於擴增目標部分的兩個外側中的用於固定的部分。這些片段的功能是作為起始模板DNA。在本實施方案中，將起始模板DNA用作模板來合成起始模板DNA的擴增目標部分的初級互補鏈，隨後，將合成的互補鏈用作模板來繼續合成相應的互補鏈。由於起始模板DNA是通過隨機打斷獲得的，其包括除擴增目標部分之外的鹼基序列並且因此具有更長的結構。因此，按照原樣使用起始模板DNA作為模板是困難的。在本實施方案中，將起始模板DNA固定以合成互補鏈後，獲得的互補鏈僅由擴增目標部分組成，並且因此可以不需要另外的固定而有效合成相應的互補鏈。因為具有這個程序，起始模板DNA的擴增目標部分可以亞-指數地進行擴增。
接下來，通過使用鹼或加熱使起始模板DNA片段變性從而修飾雙鏈-起始模板DNA片段形成單鏈產物(S12)。另一方面，形成了固定起始模板DNA片段的固定表面(S14)。將用於與起始模板DNA形成化學鍵的用於固定的寡核苷酸固定在固定表面上。用於固定的寡核苷酸具有與在起始模板DNA中用於固定的部分互補的序列。形成固定表面的方法隨後將在各自的實施方案中進行描述。
隨後，已經被修飾成單鏈的起始模板DNA片段通過化學鍵(S18)粘附於固定表面的用於固定的寡核苷酸。
由於在此情況中，用於固定的寡核苷酸具有與起始模板DNA片段的用於固定部分互補的序列，起始模板DNA片段和用於固定的寡核苷酸形成氫鍵。然後，將起始模板DNA片段固定於固定表面，從而當在隨後的PCR過程(S20)中加入加熱步驟時，避免了起始模板DNA片段與用於固定的寡核苷酸之間鍵的斷裂。在此，通過使用例如，交聯劑，諸如補骨脂素可以通過共價鍵將起始模板DNA片段與用於固定的寡核苷酸結合。
在此情況中，起始模板DNA可以在延伸條件(S16)下與用於固定的寡核苷酸粘附，或可以在固定於用於固定的寡核苷酸以獲得起始模板DNA延伸的條件後延伸起始模板DNA，並且在這些條件下進行隨後的PCR過程。
首先，將固定表面引入反應容器中進行PCR。然後，通過混合特定量的PCR緩衝溶液、引物(有義引物，反義引物)、耐熱的DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP:dATP(2』-脫氧腺苷5』-三磷酸)，dGTP(2』-脫氧鳥苷5』-三磷酸)，dCTP(2』-脫氧胞苷5』-三磷酸)和dTTP(2』-脫氧胸苷5』-三磷酸的混合物)製備反應溶液，並且將其引入反應容器中。隨後，取決於引物的寡核苷酸的熔解溫度，例如，加入大約50℃-70℃的加熱步驟，通過退火(S22)使起始模板DNA片段與引物結合。然後，取決於所用的耐熱DNA聚合酶的最適反應溫度，反應在，例如大約70℃進行以通過使用耐熱的DNA聚合酶(S24)合成起始模板DNA的片段的互補鏈DNA。
然後，例如，加入大約95℃的加熱步驟使合成的起始模板DNA片段和互補鏈DNA變性以獲得單鏈，並且接著重複普通PCR過程，其包括退火、互補鏈延伸和變性。此外，取決於使用的耐熱DNA聚合酶的特性，還可以使用雙-溫度反應系統。
由於在本發明的實施方案中，在延伸條件下將起始模板DNA片段固定在固定表面上來進行PCR過程，減少了DNA片段的扭曲，因此即使起始模板DNA片段較長，也可提供DNA的更好的擴增。
第一個實施方案圖2是透視圖，其舉例說明了生產本實施方案反應裝置10的方法。
反應裝置10包括基底12和多個在基底12上形成的柱狀構件14(圖2(a))。雖然基底12圖解為平面，可以使具有在基底12上形成的柱狀構件14的區域形成凹的部分，從而使其具有一定形式能夠將各種類型的試劑引入基底12。此外，還可以在將基底12引入反應容器的條件下，將各種類型的試劑引入反應容器。
當柱狀構件14顯示為圓筒時，可以使用任何類型的幾何形狀來提供形成突出部分，在其上可以固定起始模板DNA片段，諸如準-圓筒幾何形狀諸如圓柱形；錐狀物諸如圓錐、橢圓錐狀物、三角角錐和四角角錐；矩形柱諸如三角柱和正方柱；以及另外地條紋狀突出物或類似物。各個柱狀構件14的距離d可以等於在延伸起始模板DNA的條件下，在起始模板DNA的擴增目標部分的兩個外側上提供的用於固定的部分之間的距離，或稍短於用於固定的部分之間的距離。起始模板DNA的長度可以是，例如2-100kb。1bp的DNA長度約是0.33nm，因此各個柱狀構件14的距離d可以是，例如約600nm-35μm。
基底12可以由彈性材料，諸如矽、玻璃、石英、各種類型的塑料材料、橡膠等組成。至於塑料材料，優選地使用具有較好加工性能的那些，並且典型塑料材料可以包括，例如，熱塑性樹脂諸如聚(異丁烯酸甲酯)(PMMA)、聚乙烯對苯二酸酯(PET)、聚碳酸酯(PC)等，或熱固性樹脂諸如環氧樹脂。可以用金屬諸如金(Au)或類似物塗布基底12和柱狀構件14的表面。基底12和柱狀構件14的表面保持清潔是優選的。當基底12由矽組成時，基底12和柱狀構件14的表面可以在用氧化矽(SiO2)薄膜塗布的環境中。
將用於固定的寡核苷酸16粘附於因此具有一定形式的基底12和柱狀構件14的表面(圖2(b))，所述寡核苷酸16具有與起始模板DNA中用於固定的部分互補的序列。當基底12由玻璃組成時，或當用氧化矽薄膜，或金屬塗布基底12和柱狀構件14的表面時，通過保持基底12和柱狀構件14的表面清潔，用於固定的寡核苷酸16可以吸附於基底12和柱狀構件14的表面。
如下描述關於使用由矽組成的基底12的情況。在此情況中，可用的用於固定的寡核苷酸16可以是，例如，在引物5末端(5』末端)包含硫羥基團。在此情況中，將能夠結合硫醇的化學化合物，預先固定在基底12和柱狀構件14的表面。將描述固定這些化學化合物的方法。首先，將基底12浸在，例如1∶1混合比率的conc.HCl∶CH3OH的混合溶液中約30分鐘，然後用蒸餾水漂洗，其後浸於conc.H2SO4約30分鐘，然後用蒸餾水漂洗，其後用去離子水煮沸幾分鐘。隨後，將氨基矽烷，諸如，例如，1％的蒸餾的三甲氧基甲矽烷基丙基二亞乙基三胺(DETA)溶液或N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基矽烷(EDA)(在1mM乙酸水溶液中)等引入基底12，並且在室溫進行其反應約20分鐘。
這提供了將DETA或EDA固定於基底12的表面。其後，通過用蒸餾水漂洗去除殘餘物，並且通過在惰性氣體氣氛下於約120℃加熱3-4分鐘來進行乾燥。隨後，用1％的間，對-(氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基矽烷(PEDA)溶液(在95∶5比率的CH3OH∶1mM乙酸水溶液的混合物中)於室溫將基底12處理約20分鐘，然後用CH3OH漂洗。其後，在惰性氣體氣氛中，通過於約120℃加熱3-4分鐘來進行乾燥。
隨後，製備雙官能的交聯劑諸如1mM的琥珀醯亞胺基4-[馬來醯亞胺苯基]丁酸酯(SMPB)溶液等，然後將其溶解在少量的二甲亞碸(DMSO)中，其後用N，N-二甲基甲醯胺(DMF)、DMSO或溶劑混合諸如DMSO和C2H5OH的組合，或DMSO和CH3OH的組合對其進行稀釋。於室溫，將基底12浸於這樣的稀釋溶液中約2小時，並且在用稀釋溶劑漂洗後，在惰性氣體氣氛中進行乾燥。
因為具有這樣的程序，SMPB中的酯基團與EDA或其類似物中的氨基基團反應以提供一種情形，其中馬來醯亞胺暴露在基底12和柱狀構件14的表面上。在這樣的情形中，當將具有硫羥基團的用於固定的寡核苷酸16引入反應裝置10時，用於固定的寡核苷酸16中的硫羥基團與基底12和柱狀14的表面上的馬來醯亞胺反應，從而將固定16的寡核苷酸固定在基底12和柱狀構件14的表面上(見，例如，Chrisey等，Nucleic AcidsResearch，1996，24卷，15期，3031-3039頁)。這容許提供用於固定的寡核苷酸16在基底12和柱狀構件14的表面上的固定。
其後，在延伸起始模板DNA 18的條件下，將起始模板DNA 18粘附於基底12和柱狀構件14的表面上(圖2(c))。可以通過與如上所述的製備普通PCR的起始模板DNA的技術相似的技術來製備所述起始模板DNA18。當使用巨大的DNA諸如染色體DNA時，例如，首先通過超聲波將其打斷以提供DNA片段，隨後通過鹼或加熱變性來獲得單鏈。當將因而形成單鏈的DNA片段處理到基底12和柱狀構件14的表面上時，因為用於固定寡核苷酸16被固定於基底12和柱狀構件14的表面中，起始模板DNA18的用於固定的部分形成與用於固定的寡核苷酸16互補的鍵。如在這種場合中顯示的，儘管起始模板DNA 18可以在收縮條件或捲曲條件中被粘附，如果將其至少一個部分粘附於多個柱狀構件14上時，通過使用起始模板DNA 18作為模板，可以順利進行隨後的PCR。
為了延伸起始模板DNA 18，在例如將低頻電場施加到基底12上的條件下，將起始模板DNA 18引入基底12。在此，低頻電場可以是例如，等於或低於100Hz的電場。這容許延伸無規捲曲的起始模板DNA 18。或者，為了延伸起始模板DNA 18，在例如將高頻電場施加到基底12上的條件下，將起始模板DNA 18引入基底12。在此，高頻電場可以是，例如等於或高於500Hz的電場。其產生了一種介電電泳，由此提供起始模板DNA 18的延伸。
此外，為了延伸起始模板DNA 18，還可以使用剪切應力。例如，可以使用噴射起始模板DNA 18由此將其粘附在基底12和柱狀構件14的表面上的方法，或在反應場中產生流速然後在那裡將起始模板DNA 18粘附於基底12和柱狀構件14的表面上的方法，或類似方法。產生流速的方法可以是，例如，在旋轉基底12的同時，將起始模板DNA 18引入反應場，由此粘附在基底12和柱狀構件14的表面上。
隨後，將起始模板DNA 18固定在用於固定的寡核苷酸16上(圖2(d))。例如，使用補骨脂素20諸如4，5』，8-三甲基補骨脂素來將起始模板DNA18固定在用於固定的寡核苷酸16上。將補骨脂素20嵌入DNA的雙鏈序列之間，並且通過照射約320nm-400nm上的光，使其與鄰近的嘧啶鹼基結合，由此提供了雙鏈之間的強烈結合。在此過程後，例如，可以用緩衝液漂洗來將沒有被固定在基底12和柱狀構件14的表面上的殘餘的起始模板DNA 18去除。
將反應溶液引入起始模板DNA 18被固定在基底12和柱狀構件14的表面上的反應裝置10中，通過混合特定量的PCR緩衝溶液、引物(有義引物、反義引物)，耐熱的DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP:dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)製備所述反應溶液。
其後，適當控制反應場的溫度來進行引物在起始模板DNA 18上的退火併且用耐熱DNA聚合酶延伸與起始模板DNA 18互補的互補鏈DNA。在起始模板DNA 18的互補鏈形成後，通過將這次的這些互補鏈用作模板來重複進行包括變性、退火和互補鏈延伸的普通PCR過程。通過使用起始模板DNA 18作為模板形成的互補鏈具有一定長度，所述長度能夠提供不需進行固定而作為模板的功能，然後可以高效進行互補鏈的延伸。其提供了亞指數地擴增起始模板DNA 18的互補鏈。
圖3包括簡圖，其圖解說明了使用在本實施方案中的起始模板DNA的實例。
如圖3(a)所顯示的，通過熔解包含起始模板DNA 18a和起始模板DNA18b的雙鏈來獲得起始模板DNA，所述起始模板DNA 18a具有從5』末端側起的DNA序列A』、D』、B』，所述起始模板DNA 18b具有從5』末端側起的DNA序列B、C』、A。在此，DNA序列A』、B』、A和B的功能是作為用於固定的部分。此外，DNA序列D』和C』的功能是作為擴增目標部分和引物結合部分的起始點。在此，A表示與A』互補的序列，B表示與B』互補的序列，C表示與C』互補的序列，以及D表示與D』互補的序列。
圖3(b)是一個簡圖，其顯示粘附於基底12的固定16a和16b的寡核苷酸。出於將起始模板DNA 18a粘附於基底12的目的，用於固定的寡核苷酸16a具有DNA序列A和B，它們分別與起始模板DNA 18a中的用於固定部分的DNA序列A』和B』互補。出於將起始模板DNA 18b粘附於基底12的目的，用於固定的寡核苷酸16b具有DNA序列A』和B』，它們分別與起始模板DNA 18b中的用於固定部分的DNA序列A和B互補。
圖3(c)顯示將起始模板DNA 18a粘附於用於固定的寡核苷酸16a的情形。然後，如圖3(d)所示，用補骨脂素20強化使起始模板DNA 18a固定在用於固定的寡核苷酸16a上。隨後，如圖3(e)所示，引入引物來開始PCR，所述引物具有與起始模板DNA 18a的DNA序列D』互補的DNA序列D。如圖3(f)所示，關於具有與起始模板DNA 18a互補的序列的起始模板DNA 18b，可以通過引入引物開始PCR，所述引物被固定在用於固定的寡核苷酸16b上並且具有與DNA序列C』互補的序列C。
接著，將描述在基底12上形成柱狀構件14的方法。首先，參考圖4，圖5和圖6，將描述在基底12由矽組成的情況中形成柱狀構件14的方法。當可以通過將基底12蝕刻成某種模式的幾何形狀來進行柱狀構件14在基底12上的形成時，不特別限制其形成的方法。
在此，在每個圖中，中心簡圖是平視圖，並且右邊和左邊的簡圖是截面視圖。在這個方法中，通過利用應用光刻膠的平板印刷術技術來形成柱狀構件14。
在該情況中，對於基底12，使用具有平取向的矽基底(100)。如在圖4(a)中所顯示的，在這個順序中，首先在基底12上形成了氧化矽薄膜185和「sumiregist NEB」183(由Sumitomo Chemical Co.，Ltd生產)。氧化矽薄膜185和「sumiregist NEB」183的薄膜厚度分別是300nm和400nm。接著，將柱狀構件14的區域暴露於光。通過使用二甲苯進行顯色法，並且用異丙醇進行漂洗。如圖4(b)所顯示，該方法提供了「sumiregist NEB」183的模式。
隨後將正光刻膠155塗布到其整個表面上(圖4(c))。將其薄膜厚度調整到1.8μm。其後，進行遮蔽-暴露從而將區域暴露於反應容器112，然後進行顯色(圖5(a))。
然後，通過使用CF4和CHF3的氣體混合物，進行氧化矽薄膜185的反應性離子蝕刻。
將蝕刻的薄膜的厚度設定為300nm(圖5(b))。通過使用丙酮、乙醇和水的混合溶液進行有機洗滌來剝去「sumiregist NEB」183，然後進行氧化的等離子體處理(圖5(c))。隨後，通過使用HBr氣體對基底12進行電子迴旋共振(ECR)蝕刻。將蝕刻的矽基底的間隔(或柱狀構件的高度)設定為3μm(圖6(a))。隨後，通過使用緩衝的氫氟酸(BHF)進行溼式蝕刻過程以去除氧化矽薄膜(圖6(b))。通過上述方法，在基底12上形成柱狀構件14。
在此，當將塑料材料用於基底12時，可以通過已知方法進行柱狀構件14的形成，所述方法適合於基底12的材料的類型，諸如蝕刻、使用金屬塑模的壓縮模塑諸如壓花模塑、注射成型、光硬化模塑等。
當基底12是由塑料材料組成時，通過機制或蝕刻來製備標準樣品，並且使用通過經過電鑄型的標準樣品模式的反向轉移製備的金屬塑模進行注射成型或注射壓縮模塑以形成具有在其上形成的柱狀構件14的基底12。或者，還可以通過應用金屬塑模的壓縮方法來形成柱狀14。此外，還可以通過應用光聚合樹脂的雷射束平版印刷術來形成具有在其上形成的柱狀構件14的基底12。
第二個實施方案圖7包括簡圖，其舉例說明了在本發明第二個實施方案中製備反應裝置10的方法。在本實施方案中，將起始模板DNA 18引入基底12後，把基底12壓縮地進行拉伸以進一步延伸粘附於柱狀構件14的起始模板DNA18。在本實施方案中，基底12由彈性材料諸如各種類型的可伸展材料，橡膠等組成。這樣的材料包括，例如，聚二甲基矽氧烷(PDMS)。
如上所述，即使起始模板DNA 18在延伸條件下，粘附和固定於基底12和柱狀構件14的表面上，起始模板DNA 18的部分可以經常仍舊在如圖7(a)所示的收縮狀態。為了進一步高效延伸其進行PCR，在本實施方案中，如圖7(b)所顯示的，通過使用加壓構件22如圖7(c)所示的延伸基底12，來從基底12背面一側向基底12加壓。因為具有這樣的程序，增加了構件14之間的距離，並且起始模板DNA也在延伸的狀態，所述起始模板DNA一個末端和另一個末端都分別固定於鄰近的柱狀構件14。
此外，在本實施方案中，如圖8所示，可以提供給基底12以凹的部分，並且在凹部分中形成柱狀構件14(圖8(a))的條件下將起始模板DNA 18引入，並且然後，在引入起始模板DNA 18後(圖18(b))，可以翻轉基底12的凹的部分來獲得基底12的表面的延伸，所述基底12具有在其上形成的柱狀構件14。
第三個實施方案圖9包括簡圖，其舉例說明在本發明實施方案中製備反應裝置的方法。在不提供形成於基底12上的柱狀構件14這一方面，本實施方案不同於第一個和第二個實施方案。
首先，用於固定的寡核苷酸16粘附於基底12的表面上(圖9(a))。將用於固定的寡核苷酸16粘附於基底12的表面的方法類似於在第一個實施方案中使用的方法。隨後，將起始模板DNA 18固定於基底12(圖9(b))。相似地，如在第一個實施方案中，通過諸如，例如施加低頻、施加高頻電場、使用剪切應力等方法，在延伸條件下將起始模板DNA 18粘附在基底12的表面上。相似地，如在第一個實施方案中所述的，通過交聯劑將起始模板DNA 18固定於用於固定的寡核苷酸16。儘管在本實施方案中，在這種條件下可以進行PCR，相似地，如在第一個實施方案中，還可以在如下伸展基底12後進行PCR。
如在圖9(c)中所顯示的，對基底12的每一側施加均勻力量來拉伸基底12。這伸展了基底12，並且固定在基底12上的起始模板DNA 18也被延伸了(圖9(d))。當基底12以這種方式延伸時，基底12優選地由一種材料組成，所述材料能夠被均勻延伸並且在延伸後沒有收縮能力。例如，可以應用作為這種類型的材料的PDMS。
因為具有這樣的構型，可以在延伸起始模板DNA 18的條件下，以簡單的方法進行PCR。
第四個實施方案在用於固定的寡核苷酸16粘附於表面珠子，而不是基底12的表面上這一點中，本實施方案不同於第一到第三個實施方案，將起始模板DNA 18固定於用於固定的寡核苷酸16後，然後通過移動珠子可以延伸起始模板DNA 18。在本實施方案中，將Optical Tweezers用作移動珠子的計量裝置。
圖10是一個簡圖，其舉例說明在本實施方案中固定起始模板DNA 18的方法。首先，將具有固定在那裡用於固定的寡核苷酸16a(DNA序列A和B)的標記珠子30引入反應裝置10(圖10(a))。可獲得的標記珠子30可以包括，例如，聚苯乙烯珠、膠態金、膠乳珠、二氧化矽或類似物的微細顆粒。
隨後，將起始模板DNA 18a引入標記珠子30上。由於具有這樣的程序，在標記珠子30上固定的用於固定的寡核苷酸16a和在起始模板DNA18a中用於固定的部分(DNA序列A』和B』)形成互補鍵(圖10(b))。其後，相似地，如第一個實施方案中所描述的，將用於固定的寡核苷酸16a固定於起始模板DNA 18a中的進行固定的部分。在這個場合下，如在簡圖中所示，將至少一些引入的起始模板DNA 18a結合在兩個標記珠子30上。
隨後，用光鉗32來移動標記珠子30(圖10(c))。光鉗是一種以非接觸和非侵襲的方式通過由具有更大光圈的透鏡凝聚的雷射束在水中捕獲微細材料的方法。因此，對於上述標記珠子30使用透明微粒是優選的，所述透明微粒具有比水的波長更大的直徑和具有比水更大的折射率。此外，還可以將具有比水更短的波長的金屬微細微粒用於標記的珠子30。這容許用雷射束捕獲標記的珠子30。通過使用光學顯微鏡可以觀察這些標記珠子30，並且可以移動這些標記珠子30從而使標記珠子30之間的距離是，例如略短於起始模板DNA 18的擴增目標部分的長度。由於具有這種構型，可以延伸結合在兩個標記珠子30上的起始模板DNA 18a(圖10(d))。
第五個實施方案圖11是一個簡圖，其顯示在本發明第五個實施方案中的反應裝置10。在此，將試管34用作反應裝置10，所述試管34其中包含用於固定的寡核苷酸(未顯示)。例如，將緩衝液引入試管34並且旋轉試管34，同時保持其條件，將通過把起始模板DNA 18溶解在緩衝液中製備的溶液引入試管34(圖11(a))中。在此，由於試管34的旋轉，將剪切應力施加到引入的起始模板DNA 18上，並且因此，使起始模板DNA 18在延伸條件下粘附於試管34的側壁上(圖11B)。其後，通過真空去除方法或類似方法來去除緩衝液以獲得具有固定在試管34側壁上的起始模板DNA 18的反應裝置10(圖11(c))。
圖12是一個簡圖，其顯示本實施方案中反應裝置10的另一個實例。在此，可以將起始模板DNA 18引入在基底12上形成的孔36(圖12(a))。圖12(b)是沿直線A-A』的圖12(a)的截面圖。在此情況中，在旋轉基底12的同時，將起始模板DNA溶液引入孔36。因為具有這種構型，可以獲得具有固定在孔36的側壁上的起始模板DNA 18的反應裝置10。
第六個實施方案當在構型中，起始模板DNA 18包含擴增目標部分和位於擴增目標部分外側的進行固定的部分，並且在上述的第一個到第五個實施方案中固定用於固定的部分的條件下，通過使用擴增目標部分作為模板合成了互補鏈時，還可以通過將起始模板DNA 18中用於固定的部分用作擴增目標來合成互補鏈。因為具有這樣的構型，通過將起始模板DNA 18用作模板合成的互補鏈還具有用於固定的部分，並且因此可以將合成的互補鏈固定於基底12的表面，由此提供更長的DNA鏈的有效擴增。
圖13包括簡圖，其舉例說明了在本實施方案中擴增起始模板DNA 18的方法。如在圖13(a)中所示，起始模板DNA 18包括序列a』a』a』和序列b』b』b』。在基底12上，固定了用於固定的寡核苷酸16，所述寡核苷酸具有互補於起始模板DNA 18中的序列a』a』a』的序列aaa。在此，序列a』a』a』和序列b』b』b』位於起始模板DNA 18的擴增目標部分的各個末端。在這種條件下，將包含互補於序列b』b』b』的序列bbb的引物引入來啟動PCR。
如圖13B所顯示的，具有序列bbb的引物與在起始模板DNA 18中的序列b』b』b』產生氫鍵，並且通過PCR合成了與起始模板DNA 18互補的互補鏈。例如，在約70℃，通過PCR進行了互補鏈的合成。隨後，在PCR過程進行到一定程度的一個階段中，將反應容器中的溫度增加到約75-85℃，從而將具有序列aaa的用於固定的寡核苷酸16與在起始模板DNA 18中的序列a』a』a』的鍵合鈍化，並且還合成了與在起始模板DNA18中的序列a』a』a』互補的鏈，由此獲得了次級模板DNA 18』，其是起始模板DNA 18的互補鏈(圖13(c))。
當起始模板DNA 18和次級模板DNA 18』是等於或高於幾kb的更長DNA鏈時，與起始模板DNA 18的長度比較，用於固定的寡核苷酸16是大約幾十到幾百b的非常短的DNA鏈。由於與更長的DNA鏈相比，較短的DNA鏈在雙鏈之間具有較弱的結合強度，雙鏈之間的鍵易於為加熱時產生的分子能量所影響而被鈍化。因此，在本實施方案中，在PCR過程中從起始模板DNA 18分離合成的次級模板DNA 18』的變性過程前，加入比變性過程中設定的溫度更低的溫度的加熱步驟來從用於固定的寡核苷酸16分離起始模板DNA 18，同時在結合起始模板DNA 18和次級模板DNA 18』的條件下延伸次級模板DNA 18』，從而可以合成次級模板DNA 18』。
隨後，將反應容器中的溫度增加到約90-98℃來使起始模板DNA 18和次級模板DNA 18』變性，由此形成了單鏈(圖13(d))。在此，如在第一個實施方案中所述，通過使用施加低頻電場和高頻電場的電場施加組件和將剪切應力施加到反應場的剪切應力施加組件，來進行起始模板DNA 18和次級模板DNA 18』的延伸。
如圖13(e)所示，由於合成了次級模板DNA 18』從而將互補於序列a』a』a』的序列aaa包含在起始模板DNA 18中，可以在延伸條件下，通過將具有序列a』a』a』的用於固定的寡核苷酸16固定在基底12上，來將合成的次級模板DNA 18』固定在基底12上。隨後，通過分別將起始模板DNA 18和次級模板DNA 18』用作模板，來將具有序列bbb的引物和具有序列b』b』b』的引物引入合成各個互補鏈。
重複上述過程來繼續擴增起始模板DNA 18。由於在本實施方案中，將合成的DNA鏈固定於基底12上，可以高效指數級地擴增相對較長的DNA鏈。
第七個實施方案還可以將上述實施方案所述的延伸模板DNA的方法和將其固定在基底上的方法應用於在特定位點斷裂DNA鏈的技術。將在本實施方案中描述將DNA鏈固定在基底上從而使DNA鏈斷裂的預期位點與脫氧核糖酶(DNase)接觸以提高特異性斷裂該位點的可能性的方法。
圖14是概念簡圖，其舉例說明在本實施方案中固定DNA鏈的方法。在此，如所示，待斷裂的斷裂目標DNA 48包括用於固定部分的序列a』a』a』和序列b』b』b』。將包含序列aaa的用於固定的寡核苷酸42和包含序列bbb的用於固定的寡核苷酸44固定到基底40上。所述序列aaa與序列a』a』a』互補，並且所述序列bbb與序列b』b』b』互補。在基底40上，介於用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44之間，當在延伸條件下將待斷裂的斷裂目標DNA 48固定到用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44上時，將切口酶46固定於與待斷裂的DNA48的待斷裂的位點C相應的位置上。通過以這種方式構建基底40，當將待斷裂的DNA48固定於基底40上時，待斷裂位點c與切口酶46接觸的可能性增加，因而其斷裂能夠在特定的位點有效地進行。所述切口酶46是DNA酶。
圖15包括流程圖，其舉例說明了一種在本實施方案中製造基底12的方法。
首先，如圖15(a)中所示，將用於固定的寡核苷酸42粘附在基質40上的長條中。隨後，如圖15(b)中所示，將用於固定的寡核苷酸44粘附其上於長條中，與用於固定的寡核苷酸42間隔一定的距離。在用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44之間的間隔優選可以與待斷裂的DNAs 48的用於固定的部分之間的距離相等或較其稍短。其後，如圖15(c)中所示，當待斷裂的DNA 48被延伸並固定到用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44上時，將切口酶46附於長條之內定位到待斷裂位點的一個位置上。將由此形成的待斷裂的DNA 48引入到基底40中以便將DNA 48中的用於固定的部分與用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44結合，由此將待斷裂的DNA48固定到基底40上。
在此情況下，由於待斷裂的DNA 48的待斷裂位點被布置在基底40上的切口酶46附近，待斷裂的DNA 48的待斷裂位點被切口酶46有效地斷裂。
儘管可以多種方式將用於固定的寡核苷酸42、用於固定的寡核苷酸44和切口酶46固定於基底40上，仍要舉例說明一些示範性的方法。作為一個例子，當基底40由矽組成時，能夠通過矽烷偶聯試劑將用於固定的寡核苷酸42、用於固定的寡核苷酸44和切口酶46固定於基底40上，所述偶聯試劑與在第一個實施方案中所述的諸如氨基矽烷等相似。首先，將矽烷偶聯試劑選擇性地引入到基底40表面上的位置上，並通過矽烷偶聯試劑將用於固定的寡核苷酸42固定到基底40上，在所述位置用於固定的寡核苷酸42會被固定。接下來，將類似的矽烷偶聯試劑選擇性地引入到基底40表面上的位置上，並通過矽烷偶聯試劑將用於固定的寡核苷酸44固定於基底40，在所述位置用於固定的寡核苷酸44會被固定。隨後，將類似的矽烷偶聯試劑選擇性地引入到基底40表面上的位置上，並通過矽烷偶聯試劑將切口酶46固定到基底40上，在所述位置切口酶46會被固定。
或者，作為另一個例子，在基底40的表面上形成疏水區域，隨後將用於固定的寡核苷酸42、用於固定的寡核苷酸44和切口酶46按順序粘附於所述疏水區域之外的其它區域上。在此情況中，基底40由，例如，玻璃組成，或者用氧化矽薄膜塗布基底40的表面，或者用金屬塗布。在這種狀態下，對基底40的表面提供清潔的條件，隨後向除了基底40的所述區域之外的區域提供疏水性，將用於固定的寡核苷酸42固定到所述基底40的區域上。可以通過採用諸如印模或噴墨式印刷的印刷技術來進行向基底40的表面提供疏水性的過程。在利用印模的方法中，採用聚二甲基矽氧烷(PDMS)樹脂。通過使矽氧烷油聚合來處理PDMS樹脂，並在樹脂化之後保持在分子內空間之中包含充滿的矽氧烷油的條件。因此，當PDMS樹脂與疏水表面，如，例如，玻璃表面接觸時，接觸部分需要較強的疏水性並且因而排斥水。通過利用這種特性，採用具有凹入部分的PDMS模塊作為衝壓印並與疏水性基底40接觸以提供對於除了形成用於固定的寡核苷酸42區域的區域的疏水性，所述凹入部分相應於形成用於固定的寡核苷酸42的區域。
在利用噴墨式印刷的方法中，採用一種具有較低粘性的矽氧烷油類型作為噴墨式印刷的墨水，以這樣一種模式進行印刷，即，使得矽氧烷附於除了形成用於固定的寡核苷酸42區域的基底40表面中的區域。
在將用於固定的寡核苷酸42附於基底40的表面上之後，使用一種有機溶劑將應用在基底40表面上的矽氧烷油或其類似物洗去，隨後通過與將用於固定的寡核苷酸42附於基底40的表面上相同的方法，將用於固定的寡核苷酸44附於基底40的表面上。其後，通過利用一種有機溶劑再次將應用在基底40表面上的矽氧烷油或類似物洗去。
隨後，通過採用一種包括切口酶46的溶液作為噴墨式印刷的墨水，將切口酶46附於基底40表面上的相關位置。
在此，通過分別利用包括用於固定的寡核苷酸42的溶液和包括用於固定的寡核苷酸44的溶液作為墨水，可以將用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44等同地附於基底40的表面上。噴墨式印刷法的墨水可以優選包括一種防腐劑，用以防止切口酶46、用於固定的寡核苷酸42和用於固定的寡核苷酸44或類似物的變性。
此外，在本實施方案中，可以形成突出部分諸如柱狀構件以提供一種構型，其中類似於第一個實施方案中所述的，將待斷裂的DNA 48固定到所述突出部分上。
此外，在第一個實施方案中，可以類似於第七個實施方案中所述的，等同地採用噴墨式印刷法的技術，以提供一種固定的寡核苷酸以某種距離排列的模式，而非形成柱狀構件14。此外，在上述第一到第七個實施方案中，可以通過利用多種類型的已知技術來進行，如光刻蝕術等，以及上面陳述的方法進行用於固定到基底上的寡核苷酸的固定。
實施例將參考如下的實施例對本發明進行描述，但是本發明並不受限於此。
在本實施例中，採用秀麗小杆線蟲(C.elegans)的基因組DNA作為模板DNA 18。該線蟲具有16,000到19,000個基因，在本實施例中，對這些基因的一個50kb的區域(在圖3(a)中90k到140k左右)進行擴增，所述區域包括第四染色體中的基因tpa-1到daf-1。在此情況中，選擇80k左右和150k左右的兩個位置作為在起始模板DNA 18中用於固定的部分。
在本實施例中，採用下列序列A和B作為用於固定的寡核苷酸16。此外，採用下列序列C和D作為引物(有義引物，反義引物)。
A5』-SH-agcttacgacaaaatgcacaaattcacaaaattt-3』(序列號1)；B5』-SH-gcgtcattattctgatggttatctttttgagaggt-3』(序列號2)；C5』-actttcccacacttgataaatatcctcg-3』(序列號3)；和D5』-ataatcgttttcaaccgcaaaattacag-3』(序列號4)。
實施例1通過在第一個實施方案中所述的方法製備在基底12表面上形成的具有柱狀構件14的反應裝置10。在此情況中，基底12由矽基底所組成，所述矽基底具有(100)平板作為主平面。通過在圖4到圖6中所述的方法形成柱狀構件14。在此情況中，形成柱狀構件14以提供大約20μm的間距d。隨後，將EDA固定到基底12和柱狀構件14的表面上，並且隨後，通過在第一個實施方案中所述的方法將SMPB固定到EDA上。其後，將在上述序列A和B中的用於固定的寡核苷酸引入以便將在序列A和B中的用於固定的寡核苷酸固定到基底12和柱狀構件14上。
在對基底12施加大約10Hz低頻電場的條件下，將起始模板DNA 18引入到基底12和柱狀構件14上。
接下來，將TEN緩衝液(10mM tris(pH7.6)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和50mM NaCl)引入反應裝置10中，隨後將4，5』，8-三甲基補骨脂素的乙醇溶液引入到反應裝置10中，並在其嵌入大約2分鐘之後，通過利用紫外線(UV)裝置(UVP生產)照射大約365nm的光大約20分鐘。其後，用緩衝溶液清潔基底12的表面以去除起始模板DNA，其未被固定到基底12的表面或柱狀構件14的表面上。
接下來，通過TaKaRa LA PCRTM方法進行PCR反應。如上面所描述的，將合適數目的具有起始模板DNA固定於其上的大約3mm2的反應裝置轉移到精細的離心容器中。
將10μl的10×LAPCR緩衝液II(不含Mg2+)，10μl的25mM MgCl2，16μl的dNTP混合物(每種組分2.5mM)，各自1μl(100pmol/μl)的引物(有義引物，反應引物)和1μl的TaKaRa LA Taq加入其中，隨後向其中加入滅菌蒸餾水以獲得100μl的總體積。其後，通過利用熱循環儀在94℃進行變性反應1分鐘，隨後進行14個循環的反應循環，其包括於98℃變性20秒和於68℃引物退火與延伸互補鏈DNA 20分鐘；以及16個循環的反應循環，其包括於98℃變性20秒和於68℃引物退火和延伸互補鏈DNA20分鐘和15秒；最後將混合物在72℃反應10分鐘。
將通過上述反應獲得的產物在0.4％，高強度類型的瓊脂糖凝膠中進行電泳，並且觀察到了50kbp的擴增片段。
實施例2通過第三個實施方案中描述的方法生產反應裝置10。在不具有形成於基底12的表面上的柱狀構件14這一方面，這種情況不同於實施例1。相似於實施例1，基底12由具有(100)平面的主平面的矽基底組成。相似地，如在實施例1中，當將起始模板DNA固定於基底12的表面上時，進行PCR。結果，通過上述反應獲得的產物也在本實施例中的0.4％，高強度類型的瓊脂糖凝膠中進行電泳，並且也觀察到了約50kbp的擴增片段。
序列表110日本電氣株式會社120DNA片段擴增方法和擴增DNA片段的裝置130341037541604210121134212DNA213人工序列220
223misc結合4001agcttacgac aaaatgcaca aattcacaaa attt 34210221135212DNA213人工序列220
223misc結合4002gcgtcattat tctgatggtt atctttttga gaggt 35210321128212DNA213人工序列
220
223引物4003actttcccac acttgataaa tatcctcg 28210421128212DNA213人工序列220
223引物4004ataatcgttt tcaaccgcaa aattacag 28
權利要求
1.一種擴增DNA片段的方法，其包括將所述DNA片段結合於在基底構件表面上形成的結合部位；並且在所述DNA片段與所述基底構件的表面結合的狀況下，通過將所述DNA片段用作模板來合成所述DNA片段的互補鏈。
2.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中構造所述結合部位以與DNA序列結合，所述DNA序列位於擴增目標DNA片段的擴增目標區域的外側。
3.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中所述結合部位包含兩種或更多類型的用於固定的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有與位於擴增目標DNA片段的擴增目標區域的兩個外側中的DNA序列互補的序列。
4.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中所述合成互補鏈包括將所述模板DNA片段和所述互補鏈進行變性和分離，並且其中在所述結合所述DNA片段中，所述DNA片段被固定在所述結合部位從而使所述DNA片段在所述變性和分離中不從所述結合部位中分離出來。
5.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中構造所述結合部位以與擴增目標DNA片段的擴增目標區域的一部分結合，並且所述方法還包括，在所述合成互補鏈中，鈍化所述DNA片段與所述結合部位的鍵合。
6.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中所述結合部位包括用於固定的寡核苷酸，其具有與擴增目標DNA片段的一部分互補的序列。
7.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中在所述結合所述DNA片段中的延伸條件下，所述DNA片段與所述基底構件的表面結合。
8.按照權利要求7的擴增DNA片段的方法，其中通過在所述結合所述DNA片段中將低頻電場施加到所述DNA片段上，在延伸條件下，將所述DNA片段與所述基底構件的表面結合。
9.按照權利要求7的擴增DNA片段的方法，其中通過在所述結合所述DNA片段中將高頻電場施加到所述DNA片段上，在延伸條件下，將所述DNA片段與所述基底構件的表面結合。
10.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其還包括在所述結合所述DNA片段後，伸展所述基底構件的表面。
11.按照權利要求1的擴增DNA片段的方法，其中所述擴增目標DNA片段具有等於或大於10kb的長度。
12.一種進行DNA片段擴增的反應裝置，其包括基底構件的表面；和結合部位，其在所述基底構件的所述表面上形成並且能夠被結合以擴增目標DNA片段。
13.按照權利要求12的反應裝置，其中所述結合部位形成於在其間具有一定距離的多個區域上。
14.按照權利要求12的反應裝置，其中所述結合部位包括多個形成於所述基底構件表面上的突出部分。
15.按照權利要求12的反應裝置，其中所述結合部位包括用於固定的寡核苷酸，其具有與擴增目標DNA片段的部分互補的序列。
16.按照權利要求12的反應裝置，其中構造所述結合部位以結合DNA序列，所述DNA序列位於擴增目標DNA片段的擴增目標區域的兩側中。
17.按照權利要求12的反應裝置，所述基底構件由能夠被伸展的材料組成。
18.一種生產反應裝置的方法，所述裝置用於進行DNA片段的擴增，該方法包括在基底構件的表面上形成與擴增目標DNA片段結合的結合部位；和使所述擴增目標DNA片段與所述結合部位結合。
19.按照權利要求18的生產反應裝置的方法，其中在所述形成所述結合部位中，將用於固定的寡核苷酸固定在所述基底構件的表面上，所述寡核苷酸具有與擴增目標DNA片段的部分互補的序列。
20.按照權利要求19的生產反應裝置的方法，其中在所述結合所述DNA片段中，在延伸條件下，將所述DNA片段與所述基底構件的表面結合。
21.按照權利要求19的生產反應裝置的方法，其還包括在所述結合所述DNA片段後，拉伸所述基底構件的表面。
全文摘要
一種反應裝置(10)包括基底(12)和多個在基底(12)上形成的柱狀構件(14)。將用於固定的寡核苷酸(16)粘附於基底(12)和柱狀構件(14)的表面上，所述寡核苷酸(16)具有與起始模板DNA(18)的兩個末端的序列互補的序列。在延伸條件下，通過引入起始模板DNA(18)，可以將起始模板DNA(18)固定在鄰近的柱狀構件(14)上。在這種條件中進行PCR。
文檔編號G01N33/53GK1761748SQ200480007420
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月17日 優先權日2003年3月18日
發明者佐野亨, 馬場雅和, 飯田一浩, 川浦久雄, 井口憲幸, 服部涉, 染谷浩子 申請人:日本電氣株式會社