一種用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基的製作方法
2023-10-10 06:57:54
專利名稱：一種用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及芽孢桿菌檢測領域，具體涉及一種用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基。
背景技術：
隨著養殖環境的惡化，養殖過程中水質問題日益突出。目前芽孢桿菌製劑作為主 要水質改良產品，廣泛應用於水產養殖行業。在養殖池塘中芽孢桿菌的生長繁殖是芽孢杆 菌發揮作用的前提條件。同時池塘中芽孢桿菌的數量變化情況是確定產品使用頻率的依 據。因此跟蹤檢測池塘中芽孢桿菌的數量變化至關重要。但是由於池塘中細菌種類繁多， 而且芽孢桿菌在水體中往往不屬於優勢種群，芽孢桿菌的數量往往都在104CFU/ml以下，目 前常規的檢測方法都存在一定的缺陷。目前常見的芽孢桿菌計數方法有平板計數法，最大或然數法和定量PCR法等。由 於其他細菌的幹擾，常規的平板計數法和最大豁然數法不能選擇性的檢測芽孢桿菌數量。 目前檢測水體中芽孢桿菌的方法為先將樣品80°C水浴處理20min後進行平板計數，該方法 的缺陷在於不能檢測芽孢桿菌的總數，而是僅僅檢測芽孢桿菌中處於休眠狀態的芽孢桿菌 數量。該方法得到的數據不能用於跟蹤芽孢桿菌在水體中的繁殖情況。常用的螢光定量PCR 的方法可以水體中特定菌株的含量，但該方法需要昂貴的儀器設備，工序複雜，且檢測費用 大。同時其他細菌會干擾引物和探針的特異性，水體中存在的有機和無機懸浮物會影響RNA 的提取，進而降低螢光定量PCR方法的可重複性。中國專利申請(200510U6211.0)公開了 一種微生物肥料中的芽孢桿菌數量的檢測方法，該方法主要是將待測樣品稀釋液先進行高 溫處理，這樣可以打破產品中成熟芽孢的休眠，使之很快萌發形成菌落，同時殺死樣品中未 能形成芽孢的菌體，使之提前死亡，但該申請中所用到的培養基是傳統的營養瓊脂培養基， 並未作出改進。專利申請(200910196640. 3)公開了一種芽孢桿菌活菌數量的檢測方法，主 要是將樣品中加入營養肉湯萌發劑培養，然後再塗板、計數。這種方法主要是通過高溫處理 刺激成熟芽孢萌發，再經過萌發劑培養，讓芽孢復甦，從而使檢測的準確度提高。但該申請 中所用到的培養基依然是傳統的營養瓊脂培養基，並未作出改進。
發明內容
本發明的目的在於根據現有的芽孢桿菌定量檢測中存在的準確度低、無法檢測芽 孢桿菌總數以及使用螢光定量PCR時帶來的成本高的問題，提供一種成本低、準確度高的 用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基。本發明另一目的在於提供上述選擇性培養基的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
一種選擇性培養基，每升該選擇性培養基由如下組分組成葡萄糖廣10g，酵母膏 廣5g，蛋白腖5 10g，氯化鈣0. 2 2g，硫酸鎂0.廣lg，瓊脂15 20g和抑菌劑100 500 IU0作為一種優選方案，每升上述選擇性培養基由如下組分組成葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白腖10g，氯化鈣lg，硫酸鎂0. 5g和抑菌劑200 IU0更進一步地，上述蛋白腖優選為胰蛋白腖，所述抑菌劑為多粘菌素，其中，以硫酸 多粘菌素B為最佳。本發明選擇性培養基可以用於定量檢測芽孢桿菌。檢測方法是以選擇性培養基 製備平板，將待測樣品稀釋後塗布於平板上，培養，培養完畢後進行計數(待測樣品的前處 理、平板的製備及塗布方法均根據GB4789. 2-94《中華人民共和國國家標準食品微生物學 檢驗菌落總數測定》的規定實施)。作為一種優選方案，上述檢測方法中，所述培養時間為2(T3^!。培養為變溫培養， 前6 12h為恆溫4(T55°C培養，後12 3 為恆溫3(T40°C培養。可否詳細說明採用變溫培 養的原因，以及通過變溫培養可以帶來怎樣的有益效果？
作為一種最優選方案，所述培養的前1 為恆溫45°C培養，後12h為恆溫37°C培養。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明通過使用特定配方及用量組分組成的選擇性培養基，使用變溫培養的方法，可 以提高常規平板計數法對芽孢桿菌的選擇性，消除待測樣品中其它微生物或雜質的影響， 達到快速準確定量檢測芽孢桿菌的目的。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1檢測半鹹水養蝦塘中芽孢桿菌菌數
將芽孢桿菌含量為20X 108CFU/g的產品使用到南美白對蝦池塘中，使用劑量為lppm， 1天後採樣檢測池塘水體中芽孢桿菌數量。具體檢測方法如下
(1)樣品預處理
取水樣進行梯度稀釋，變溫培養組取1X，10X，100X三個稀釋梯度的稀釋液備用； 恆溫培養組取100X，1000X，10000X三個稀釋梯度的稀釋液備用。
(2)選擇性培養基平板的製備
按照以下配方配製固體培養葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、胰蛋白腖10g/L、氯化鈣1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸多粘菌素200IU/L和瓊脂15 g/L，調節PH為7. 2，121°C滅菌 20min。待培養基冷卻到45°C後，將約15ml培養基傾入無菌培養皿中，凝固後備用；
(3)塗布和培養
變溫培養組取1X，10X，100X三個稀釋梯度的稀釋液備用；恆溫培養組取100X， 1000 Χ, 10000X三個稀釋梯度的稀釋液進行塗布，每個平板添加稀釋液0. 1ml，每個梯度 採用3個重複；然後將變溫組的培養皿45°C恆溫培養箱，培養12小時，然後將培養皿轉移 到37°C恆溫培養箱培養12小時；同時將恆溫組的培養皿放入37°C，培養M小時。培養完 畢後即可進行計數統計。具體數據
表1變溫培養後菌落計數數據
權利要求
1.一種用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基，其特徵在於每升所述選擇性培養基由 如下組分組成葡萄糖riOg，酵母膏廣5g，蛋白腖5 10g，氯化鈣0. 2 2g，硫酸鎂0.廣lg， 瓊脂15 20g和抑菌劑100 500 IU0
2.根據權利要求1所述的用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基，其特徵在於每升 所述選擇性培養基由如下組分組成葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白腖10g，氯化鈣lg，硫酸鎂 0. 5g和抑菌劑200 IU0
3.根據權利要求2所述的用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基，其特徵在於所述蛋 白腖為胰蛋白腖。
4.根據權利要求2所述的用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基，其特徵在於所述抑 菌劑為多粘菌素。
5.根據權利要求4所述的用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基，其特徵在於所述多 粘菌素為硫酸多粘菌素B。
6.權利要求廣5中任意一條權利要求所述的選擇性培養基在定量檢測芽孢桿菌中的應用。
7.根據權利要求6所述選擇性培養基的應用，其特徵在於所述檢測方法如下以選擇 性培養基製備平板，將待測樣品稀釋後塗布於平板上，培養，培養完畢後進行計數。
8.根據權利要求7所述選擇性培養基的應用，其特徵在於所述培養時間為2(T3^!。
9.根據權利要求8所述選擇性培養基的應用，其特徵在於所述培養為變溫培養，前 6 12h為恆溫40 55°C培養，後12 35h為恆溫3(T40°C培養。
10.根據權利要求9所述選擇性培養基的應用，其特徵在於所述培養的前1 為恆溫 45°C培養，後1 !為恆溫37°C培養。
全文摘要
本發明公開了一種用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基。每升本發明選擇性培養基由如下組分組成葡萄糖1~10g，酵母膏1~5g，胰蛋白腖5~10g，氯化鈣0.2~2g，硫酸鎂0.1~1g，瓊脂15~20g和抑菌劑100~500IU。本發明用於定量檢測芽孢桿菌的選擇性培養基通過變溫培養，可以提高常規平板計數法對芽孢桿菌的選擇性，消除待測樣品中其它微生物或雜質的影響，達到快速定量檢測芽孢桿菌的目的。
文檔編號C12R1/07GK102127518SQ20101061719
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者張家學 申請人:廣州市容川飼料有限公司