壓力誘導心肌肥厚細胞模型及其應用的製作方法

2023-10-10 04:42:14 1

壓力誘導心肌肥厚細胞模型及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型及其應用。本發明的壓力誘導心肌肥厚細胞模型，是通過給培養的心肌細胞施加壓力培養獲得，其中所使用的壓力為60mmHg～180mmHg，優選為180mmHg，所述心肌細胞可為大鼠H9c2細胞。本發明發現壓力可以誘導大鼠H9c2心肌細胞肥厚，促進細胞直徑、體積增大和蛋白含量的增加。本發明還公開了所述壓力誘導心肌肥厚細胞模型在心肌肥厚的基礎研究和藥物研究中的應用。
【專利說明】壓力誘導心肌肥厚細胞模型及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞生物學領域，具體涉及一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型及其應用。
【背景技術】
[0002]心肌肥厚是心臟對急、慢性血流動力學超負荷的一種基本的適應性反應。以心肌細胞直徑、體積增大及細胞內蛋白質合成增加為主要特徵，是引起心血管疾病的獨立危險因素，也是心血管疾病常見的一種病理狀態。早期心肌肥厚是心肌細胞對外界刺激的代償性改變，有利於維持心輸出量，對機體起到代償性保護作用，但長期的心肌肥厚將會誘發心力衰竭等心血管疾病，甚至引發猝死。因此，探討心肌肥厚的發生發展機制及其可能的調節機制，尋求防治心肌肥厚新靶點和開發更有效的藥物，對心肌肥厚誘發心衰等心血管疾病的預防和治療具有重要的意義。
[0003]心肌肥厚的發生機制極其複雜至今仍未完全明了，目前認為導致心肌肥厚的原因主要可歸納為:機械性、神經性與體液性。其中機械刺激主要就是指壓力誘導。壓力超負荷使心室壁張力增加，可導致心肌肥厚的產生。長期患有高血壓的患者，可引起左心室的心肌肥厚。壓力負荷一方面直接刺激細胞生長，另一方面可激活心肌細胞膜上的壓力信號開關，進而調節相關蛋白的表達以及各種細胞因子的分泌如去甲腎上腺素、血管緊張素II和甲狀腺素等等。2012年《Nature》雜誌已經報導血管緊張素受體樣受體APJ可能作為一個壓力感受的祀標，參與心肌肥厚的發生(Scimia MC, et al.APJ acts as a dual receptor incardiac hypertrophy.Nature.2012, 16;488(7411):394-8.)。
[0004]壓力負荷即機械性因素在心肌肥厚中的作用最為重要。壓力負荷誘導心肌肥厚在實驗動物上可以通過腹主動脈狹窄來建立，而目前在體外培養的細胞上以前無法實現。壓力負荷可以激活機體產生眾多細胞因子如去甲腎上腺素、血管緊張素II和甲狀腺素的分泌，有報導單獨使用這些細胞因子也能誘導體外培養的心肌細胞肥厚，但處理因素單一，並且無法模擬體內壓力負荷的環境。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型，其特徵在於，其通過給培養的心肌細胞施加壓力培養獲得。
[0006]本發明的另一目的在於提供一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型，其特徵在於，所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
[0007]本發明的另一目的在於提供一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型，其特徵在於，所使用的壓力為優選為180mmHg。
[0008]本發明的另一目的在於提供一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型，其特徵在於，所使用的心肌細胞為大鼠H9c2細胞。
[0009]本發明的另一目的在於提供一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型在心肌肥厚的基礎研究和藥物研究中的應用。
[0010]本發明的另一目的在於提供一種心肌肥厚細胞模型的製備方法，其特徵在於，其通過給培養的心肌細胞施加壓力培養獲得。
[0011]本發明的另一目的在於提供一種心肌肥厚細胞模型的製備方法，其特徵在於，所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
[0012]本發明的另一目的在於提供一種心肌肥厚細胞模型的製備方法，其特徵在於，所使用的壓力為優選為180mmHg。
[0013]本發明的另一目的在於提供一種心肌肥厚細胞模型的製備方法，其特徵在於，所使用的心肌細胞為大鼠H9c2細胞。
[0014]本發明的另一目的在於提供一種心肌肥厚細胞模型的製備方法在心肌肥厚的基礎研究和藥物研究中的應用。
[0015]在本發明中，發明人應用自製的壓力細胞培養箱，可以將心肌細胞置於體外的壓力負荷環境來培養，從而可以在體外實驗中模擬體內的壓力負荷環境。應用壓力培養可以彌補單一因子誘導培養的不足。壓力培養箱的壓力還可以調節，從而可以模擬體內壓力負荷的動態變化。該模型實施的操作便利，在短時間內(通常48小時)即可複製出心肌肥厚細胞模型，重複性很好，與動物實驗也可以做平行研究，具有較好的可比性。
[0016]在本發明中，發明人將普通細胞培養箱改裝成壓力細胞培養箱，通過這種壓力細胞培養箱，給培養的心肌細胞施加壓力。發明人的研究結果發現壓力可以誘導大鼠H9c2心肌細胞肥厚，促進細胞直徑、體積增大和蛋白含量的增加，並且細胞內血管緊張素受體樣受體APJ表達的增加。
[0017]發明人進一步設計`併合成小分子RNA用於幹擾APJ的表達，結果發現幹擾APJ後可以逆轉壓力誘導的心肌細胞直徑、體積增大和蛋白含量的增加。整個實驗結果可通過如圖1所述的信號通路圖來描述說明:壓力刺激細胞膜上的壓力感受器一APJ受體，使APJ受體表達增加，然後誘導心肌細胞肥厚；而1?^幹擾抑制APJ的表達後能逆轉壓力誘導的心肌細胞肥厚(如圖1)。此外，使用磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑LY294002和細胞自噬抑制劑3-Methyladenine兩種工具藥也可以逆轉壓力誘導的心肌細胞肥厚。
[0018]綜上所述，本發明發現了用發明人自製的壓力細胞培養箱可以誘導H9c2心肌肥厚細胞模型，深入研究後發現APJ介導壓力誘導的心肌細胞肥厚。本發明為壓力如何誘導心肌細胞肥厚提供了實驗的證據。這一心肌細胞模型及其製備方法在心肌肥厚的基礎研究和藥物研究中都有重要的意義和廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1信號通路圖，顯示壓力刺激細胞膜上的壓力感受器一APJ受體，使APJ受體表達增加，然後誘導心肌細胞肥厚；而1?嫩幹擾抑制APJ的表達後能逆轉壓力誘導的心肌細胞肥厚。
[0020]圖2本發明自製的壓力細胞培養箱實物照片。
[0021]圖3Western Blot結果圖，顯示壓力誘導大鼠H9c2心肌細胞中APJ的表達顯著增加( T 士s，n=6 )。[0022]圖4shRNA 幹擾 APJ 的結果圖(無士S，11=6 )。
[0023]圖5本發明自製的壓力細胞培養箱外部結構圖，I為壓力控制器，2為放氣閥，3為溫度計，4為壓力表，5為溫控開關，6為氣瓶。
[0024]圖6本發明自製的壓力細胞培養箱內部結構圖，I為壓力控制器，2為放氣閥，3為溫度計，4為壓力表，5為溫控開關，6為氣瓶，7為高壓箱體。氣體流通路徑:6氣瓶一4壓力表一 I壓力控制器一7高壓箱體。
[0025]圖7本發明自製的壓力細胞培養箱內置高壓小箱體二維圖，I為內六角螺栓，2為密封墊圈，3為高壓箱體門。
【具體實施方式】
[0026]建立壓力誘導心肌肥厚細胞模型的實驗方法如以下實施例所示。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0027]實施例1大鼠H9c2心肌細胞培養
[0028]大鼠H9c2心肌細胞(市售可得，可從例如中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫或其它公司獲得)是源於B DlX大鼠胚胎心臟組織的亞克隆細胞株，用含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(1.5g/LNaHC03，4.5g/L C6H12O6,4mM L-穀氨醯胺)培養；每2411 換一次培養液，換液前用 0.01M PBS (稱取 8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HP04 和 0.24g KH2P04，溶於 800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L)洗3遍後再加入新鮮培養液；當細胞生長到約70%融合時可傳代，用0.25%胰酶細胞消化液消化，顯微鏡下觀察到貼壁細胞從長梭形變為圓形時停止消化，加入新鮮培養基吹打均勻後分瓶培養。在倒置顯微鏡下觀察，大鼠H9c2心肌細胞呈長梭形、帶狀三角形，細胞間有突起相連，未見心肌搏動。取生長狀態良好的細胞用於後續實驗。
[0029]實施例2壓力培養箱培養大鼠H9c2心肌細胞
[0030]將生長狀態良好的大鼠H9c2心肌細胞放入自製的壓力細胞培養箱繼續培養。靠注入5%C02混合氣體(即95%的空氣和5%的CO2),可以調節壓力培養箱中的壓力。
[0031]本發明自製的壓力細胞培養箱實物照片參見圖2。
[0032]實施例3大鼠H9c2心肌細胞肥厚的檢測
[0033]1.大鼠H9c2心肌細胞直徑和體積測定
[0034]收集培養後的大鼠H9c2心肌細胞，用0.01M PBS洗3次，加入0.25%胰酶細胞消化液，充分消化後吹打均勻製成細胞懸液，離心棄掉上清，再加入0.5ml PBS重懸細胞，使其呈單個懸浮液，並且用PBS調節細胞密度在5X 104-5X 105/ml，取200 μ I裝於2ml的EP管中；用Scepterf.0手持式細胞計數器(Millipore公司，美國)測量細胞直徑和體積，直徑單位:μ m/cell,體積單位:μ m3/cell。
[0035]2.大鼠H9c2心肌細胞蛋白含量測定
[0036]收集培養後的大鼠H9c2心肌細胞，對各組心肌細胞進行細胞計數。進一步離心沉澱細胞後加入5倍體積的含90%RIPA裂解液和10%苯甲基磺醯氟(PMSF)的細胞裂解液，裂解大鼠H9c2心肌細胞的細胞膜，4°C 12000rpm離心30min後吸取上清，用BCA蛋白定量分析試劑盒(Pierce公司，美國)測定H9c2大鼠心肌細胞的蛋白含量,單位:pg/cell。
[0037]實施例4蛋白質印跡Western Blot[0038]取培養後的大鼠H9c2心肌細胞，棄去培養液，PBS洗3次，濾紙吸去多餘液體，加入含90%RIPA裂解液和10%苯甲基磺醯氟(PMSF)的細胞裂解液50-70 μ 1，冰上裂解20min，用細胞刮匙刮取蛋白收集於1.5ml EP管中，4°C 12000rpm離心15min，收集上清後用BCA蛋白定量分析試劑盒進行蛋白定量。加入25%蛋白樣品體積的4X上樣緩衝液並混勻，煮沸lOmin，取30μ g蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，於電泳緩衝液中80V恆壓電泳30min，待樣品進入分離膠後改用120V恆壓電泳，直至樣品電泳至分離膠底部。然後轉膜，於轉膜液中250mA恆流溼法電轉2.5h使蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉液搖床室溫封閉PVDF膜2h後加APJ (兔抗)一抗(1:1000)，4°C搖床孵育過夜。次日，用TBST洗膜4次，IOmin/次，加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔)(1:3000)室溫下搖床孵育lh, TBST洗膜4次，15min/次，然後將PVDF膜放入發光劑(Millipore公司，美國)中孵育2分鐘，隨後將膜放置於Tanon-6200化學發光成像系統的平臺上，曝光，拍照。應用軟體Alphalmager2200 (FORM公司，美國)進行圖像分析，統計灰度掃描值 。
[0039]實施例5針對APJ的RNA幹擾可以逆轉壓力誘導的心肌細胞肥厚
[0040]shRNAs在上海吉瑪公司設計和合成的，共合成了四條APJ幹擾鏈(分別為pGPU6/Neo-APJ-rat-53I, pGPU6/Neo-APJ-rat-399, pGPU6/Neo-APJ-rat-107I 和 pGPU6/Neo-APJ-rat-759)。以pGPU6/Neo_shNC並連接一段與目的基因APJ無同源性的siRNA作為對照。細胞待長到70%左右的時候，進行轉染。轉染的時候，先將質粒2μ I(含l.0ygDNA)溶於100 μ I無血清培養基中，轉染試劑Attractene (Qiagen公司，德國)4.5 μ I溶於100 μ I無血清培養基中，然後兩者混合後常溫下靜置30分鐘，再加入六孔板培養的H9c2細胞中，同時加入2ml培養基進行培養，6個小時後，進行一次換液。24小時後提取蛋白，檢測APJ的表達。
[0041]實施例6結果分析
[0042](一)壓力誘導心肌細胞肥厚
[0043]分別使用壓力(60mmHg、90mmHg、120mmHg、150mmHg和 180mmHg)來處理大鼠 H9c2細胞48小時，並檢測細胞的直徑、體積和蛋白含量的變化。結果顯示:與Control組比較，用120mmHg、150mmHg和180mmHg的壓力培養大鼠H9c2心肌細胞，心肌細胞直徑、體積明顯
增大，蛋白含量顯著增加(表1)。
[0044]表1壓力培養對大鼠H9c2心肌細胞直徑、體積和蛋白含量的影響
[0045]
【權利要求】
1.一種壓力誘導心肌肥厚細胞模型，其特徵在於，其通過給培養的心肌細胞施加壓力培養獲得。
2.權利要求1所述的細胞模型，其特徵在於，所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
3.權利要求2所述的細胞模型，其特徵在於，所使用的壓力優選為ISOmmHg。
4.權利要求1~3任一項所述的細胞模型，其特徵在於，所述心肌細胞為大鼠H9c2細胞。
5.權利要求1~4任一項所述的細胞模型在心肌肥厚的基礎研究和藥物研究中的應用。
6.一種心肌肥厚細胞模型的製備方法，其特徵在於，其通過給培養的心肌細胞施加壓力培養獲得。
7.權利要求6所述的方法,其特徵在於,所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
8.權利要求7所述的方法，其特徵在於，所使用的壓力優選為ISOmmHg。
9.權利要求6~8任一項所述的方法，其特徵在於，所述心肌細胞為大鼠H9c2細胞。
10.權利要求6~9任一項所述 的方法在心肌肥厚的基礎研究和藥物研究中的應用。
【文檔編號】C12N5/071GK103525754SQ201310472471
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】李蘭芳, 謝鳳, 柳威, 呂德官, 陳臨溪, 陳冠峰 申請人:李蘭芳