一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用的製作方法

2023-10-10 03:08:09

專利名稱：：一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用，屬於遺傳工程領域。
背景技術：
：迄今為止，酶製劑已被廣泛地應用於製革、食品、發酵和紡織等行業。酶在製革工業中的應用，最早僅限於酶脫毛和酶軟化。隨著科學技術的不斷發展和進步，酶製劑在製革行業中的應用範圍也不斷拓展、擴大，逐漸應用於製革準備工段乃至整個製革過程。種種跡象表明，基於酶製劑的製革工藝方法的研究與開發，必將催生具有生態概念的製革新技術——生物製革。其中在製革工業中應用較為廣泛且應用時間較長的是胰酶，胰酶是一類廣泛應用於醫藥、食品、化工及製革等工業的混合酶製劑。胰酶最早是通過新鮮動物胰臟來製備，通過絞碎，配料，磨漿，消化，過濾，乾燥，球磨等工藝製備成為胰酶原粉，隨後加填充劑稀釋成為不同酶活力標準的胰酶成品。動物源胰酶成分複雜，其中具有主要作用的是胰蛋白酶(EC3.4.21.4)，雖然胰酶製備簡便，但是製備過程比較粗放，產品不同批次間質量參差不齊，品質難以控制，而對其進行精製則成本較大；另外動物源胰酶在皮革工業中存在生物安全性低和標準化困難的缺點；製革工業中常用的的酶為蛋白酶，蛋白酶種類可分為四大類:絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶類、天冬氨酸蛋白酶類和金屬蛋白酶類，鏈黴菌屬可以產生其中的除了半胱氨酸蛋白酶類的其他三類蛋白酶，已經發現了多種可產生蛋白酶的鏈黴菌，主要包括灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseu)、變鉛青鏈黴菌(S.lividans)、弗氏鏈黴菌(S.fradiae)和帶小棒鏈黴菌(S.clavuligerus)等。通過對目前皮革工業中應用較為普遍的動物源胰酶與鏈黴菌屬(Streptomyces)胰蛋白酶的理論比較,鏈黴菌源胰蛋白酶的酶活性質和作用方式均與動物源胰蛋白酶相同，而經過鏈黴菌胰蛋白酶胺基酸序列和胰蛋白酶基因結構的比較，發現鏈黴菌源胰蛋白酶的胺基酸序列和基因結構同動物源胰蛋白酶具有高度同源性，胺基酸序列相似度80.9%，酶基因序列相似度79.8%。然而，鏈黴菌源胰蛋白酶的生產卻由於鏈黴菌的發酵周期長，野生菌表達酶活低，及胰蛋白酶基因表達調控複雜等因素而受到制約。對於動物源胰蛋白酶的重組基因工程菌的構建和表達研究較多，但是由於通過原核生物表達真核生物蛋白在轉錄和翻譯的調節上存在差異，因此得到外源表達胰蛋白酶多數為包涵體蛋白，小鼠的胰蛋白酶編碼基因同細菌鹼性磷酸酶啟動子(PhoA)在E.coli中進行融合表達，並且通過添加外源激酶激活胰蛋白酶原，實現了胰蛋白酶的外源表達，但是需要添加外源激酶激活，且產量較低，而鏈黴菌胰蛋白酶的活性表現不需要添加任何外源激酶，對於鏈黴菌胰蛋白酶的研究起始較早，但是其集中在酶學性質和生理生化特性方面的研究。對於鏈黴菌的胰蛋白酶的外源表達研究則主要集中在胰蛋白酶在不同的鏈黴菌宿主中表達的生理生化作用的研究，且鏈黴菌的發酵周期普遍較長，發酵控制等相對較為困難，並且鏈黴菌本身具有的蛋白質水解功能也會影響目的蛋白酶的產量。然而胰蛋白酶在實際應用中的作用溫度通常為37°C，在此條件下，胰蛋白酶具有較高的酶催化效率，但會由於熱力因素導致其緩慢失活，而導致其效力下降。而目前針對胰蛋白酶的熱穩定性改造尚未有報導，但是近些年國內外有較多的N端融合短肽來改善酶熱穩定性的報導，比如在酶的N端融合雙親短肽可以明顯提高RNaseHI的熱穩定性。據此，對鏈黴菌胰蛋白酶進行重組改造，通過融合人工設計雙親短肽來實現鏈黴菌胰蛋白酶的熱穩定性改造，並且進行熱穩定性提高的重組鏈黴菌胰蛋白酶基因工程菌的構建，來實現鏈黴菌胰蛋白酶的外源表達，及提高重組菌胰蛋白酶的表達量。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種產熱穩定性重組胰蛋白酶(thermostabletrypsin,EC3.4.21.4)的酵母工程菌，表達熱穩定性提高的的重組胰蛋白酶編碼基因(Exmt)ο所述熱穩定性提高的胰蛋白酶(thermostabletrypsin)基因(Exmt)的序列為SEQIDNO:1所示。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種類胰蛋白酶酵母工程菌的構建方法。為解決上述技術問題，所採用的技術方案包括如下具體步驟，見圖1:第一步熱穩定性提高的胰蛋白酶基因的獲得及分析首先，對灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseu)[StreptomycesgriseusubspgriseusATCC10137，2010年5月26日購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)]，對其類胰蛋白酶基因進行PCR擴增及測序，其次，畢赤酵母(Pichiapastoris)的表達系統有著特殊的密碼子偏好性，如果不對類胰蛋白酶基因要表達的密碼子的進行一定的分析，畢赤酵母(Pichiapastoris)可能無法正確翻譯類胰蛋白酶基因。通過類胰蛋白酶基因在畢赤酵母中進行表達的密碼子適用指數(CAI)分析，發現在類胰蛋白酶基因中並無畢赤酵母無法識別及利用的稀有密碼子，其次，在進行PCR擴增所得胰蛋白酶基因，並在其上遊利用融合PCR技術融合進去多肽編碼基因Ex(TACGTTGAATTT)，並在此片段上遊再次融合畢赤酵母(Pichiapastoris)a-factor信號肽，同時在最終融合長片段上下遊分別加入BamHI限制性內切酶位點和NotI限制性內切酶位點，進而獲得編碼熱穩定性提高的胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列為:SEQIDNO:1；第二步熱穩定性提高的胰蛋白酶重組質粒的構建為了使Exmt基因能在酵母中的可控高效表達，選用帶有醇氧化酶基因(AOX)的啟動子AOXI的畢赤酵母表達載體(例如pPIC9K，美國Invitrogen公司)，利用PCR技術擴增得到胰蛋白酶編碼基因mt(所述類胰蛋白酶的基因的核苷酸序列為:SEQIDNO:1),結合融合PCR技術，在mt基因的5』端人為添加多肽Tyr-Val-Glu-Phe的編碼序列Ex(TACGTTGAATTT)(所述類胰蛋白酶的基因的核苷酸序列為:SEQIDNO:1),得到融合後的基因Exmt,再次利用融合PCR技術在其5』端融合Saccharomycescerevisiaea-factor信號肽，得到亞克隆片段a-factorsignalpeptide+Exmt,之後將亞克隆片段利用BamHI和NotI酶切亞克隆至表達載體pPIC9K。由於在AOXI強啟動子後面有一段α-因子信號肽序列，這也為類胰蛋白酶在酵母中的正確分泌表達奠定了基礎；另外，由於PPIC9K載體中含有卡那黴素、氨苄青黴素抗性基因，在篩選重組菌時較為方便。第三步熱穩定性提高的胰蛋白酶基因工程菌的構建將重組質粒pPIC9K-Exmt電擊轉化宿主畢赤酵母GSl15，構建高效表達類胰蛋白酶的組成型畢赤酵母重組菌株。本步驟採用的熱穩定性提高的胰蛋白酶基因的重組表達質粒pPIC9K-Exmt可轉化畢赤酵母(Pichiapastoris),成為能分泌表達外源胰蛋白酶的功能酵母菌:由於含外源基因的重組表達質粒pPIC9K-Exmt上有畢赤酵母AOX基因的部分序列，當重組表達質粒進入酵母細胞後，通過體內同源重組，pPIC9K-Exmt可以定向整合到畢赤酵母染色體DNA上。在外源誘導物甲醇存在的情況下，AOXI啟動子啟動外源Exmt基因，信號肽指導表達產物進入畢赤酵母的分泌途徑，正確切割成具有生物活性的外源蛋白表達產物，最終將產物分泌至胞外。畢赤酵母的轉化常採用電激法或化學轉化法:首先接種活化後的畢赤酵母GS115一環於25mLYPD液體培養基中，28°C30°C振蕩培養過夜，然後將上述培養液轉入IOOmLYPD(500mL三角瓶)液體培養基中，28°C30°C振蕩培養，每隔Ih測定，培養直至菌體濃度OD6tltl為1.31.5，在冰水中冷卻IOmin以上，然後在4°C環境下，8000r/min離心收集菌體，用40mL預冷的無菌水懸浮細胞，在冷水中放置lOmin，如此重複步驟4三次，即無菌水洗滌3次,用300μL預冷lmol/L山梨醇懸浮細胞,從而獲得受體菌。然後取5080μL受體菌和590μg線性化重組表達質粒DNA混勻，電擊(電壓:1500V:電容:25yF;電阻:200Ω)處理，然後塗布於卡那黴素(10μg/mL)抗性平板篩選重組子，對陽性轉化子進行PCR驗證。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種發酵生產熱穩定性提高的胰蛋白酶的方法，具體方法如下:接種一環上述酵母工程菌入250mL三角瓶，裝液量50mL的種子培養基，培養溫度28°C30°C，搖床轉速200r/min，培養24h;離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量接入裝液量為50mL發酵培養基的三角瓶(500mL)中，發酵溫度30°C，搖床轉速200r/min,發酵時間:34天。培養基組成(g/L):種子培養基:蛋白腖10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化鈉5_15；優化種子培養基為:蛋白腖15，酵母提取物8，葡萄糖15，氯化鈉10；發酵培養基:酵母氮源基礎培養基1215，生物素0.00020.0005,甲醇1050;微量元素溶液，MnSO4.4H20100,ZnCl270,Na2MoO4.2H2035,H3B0360,CoCl2.6H20200,CuSO4.5H2029,NiCl2.6H2025,37%鹽酸0.9mL。胰蛋白酶酶活測定方法:胰蛋白酶能夠選擇性的切斷賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，利用人工合成的具有上述肽鏈的N°-苯甲醯-DL-精氨酸-對-硝基苯醯胺(ΒΑΡΝΑ)作為底物，在410nm下測定類胰蛋白酶催化ΒΑΡΝΑ的產物對硝基苯胺的吸光係數，利用吸光係數在IOmin內的變化率來反映類胰蛋白酶的酶活大小。酶活定義為:在25°C下，每水解Iyg的BAPNA所需的類胰蛋白酶的量，即為類胰蛋白酶的I個BAPNA水解單位。具體測定方法為:將43.5mgBAPNA先溶解於ImL二甲基甲醯胺中，之後再將該混合體系溶解於pH8.0的，含有IOmMCaCL2的50mMTris-HCL緩衝液中，此即為類胰蛋白酶的底物溶液，測定過程為:在25°C下，測定10μL粗酶液同990μLΒΑΡΝΑ溶液在光徑Icm的反應池中，在410nm下IOmin內的吸光值變化，得到AA4icinmAiin，之後利用下面的公式計算得到粗酶液酶活:權利要求1.一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用，其特徵在於採用畢赤酵母宿主(Pichiapastoris)GS115為宿主，表達重組胰蛋白酶基因，所述重組胰蛋白酶基因核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。2.權利要求1所述酵母工程菌的構建方法，其特徵在於具體步驟為:1)熱穩定性提聞的重組膜蛋白酶基因的獲得利用融合PCR技術或化學全合成的方法，將人工設計前導肽Ex核苷酸序列和灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseu)胰蛋白酶編碼基因mt進行融合，並將連接至pMD19Tsimple載體中；所述前導肽Ex核苷酸序列為TACGTTGAATTT；2)融合前導肽的重組酶表達質粒的構建利用融合PCR技術在其5』端融合Saccharomycescerevisiaea-factor信號肽，得到亞克隆片段a-factorsignalpeptide+Exmt,之後將亞克隆片段利用BamHI和NotI酶切亞克隆至表達載體PPIC9K,獲得重組表達質粒pPIC9K_a-factorsignalpeptide+Exmt；3)融合雙親短肽的重組酶表達菌株的構建將重組質粒pPIC9K_a-factorsignalpeptide+Exmt轉化宿主畢赤酵母宿主(Pichiapastoris)GS115。3.一種應用權利要求1所述所述酵母工程菌發酵生產重組胰蛋白酶的方法，其特徵在於以權利要求1所述的酵母工程菌為生產菌株，接種一環轉化子入250mL三角瓶，裝液量50mL的種子培養基，培養溫度28°C30°C，搖床轉速200r/min，培養24h;離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量接入裝液量為50mL發酵培養基的三角瓶中，發酵溫度30°C，搖床轉速200r/min，發酵時間:34天。4.權利要求3所述的方法，其特徵在於所述種子培養基IL組成為:蛋白腖10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化鈉5-15。5.權利要求3所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基IL組成為:酵母氮源基礎培養基1215，生物素0.00020.0005,甲醇1050;微量元素溶液，MnSO4.4H20100,ZnCl270,Na2MoO4.2H2035,H3B0360,CoCl2.6H20200,CuSO4.5H2029,NiCl2.6H2025，37%鹽酸0.9mL。全文摘要本發明公開了一種產熱穩定性重組胰蛋白酶的酵母工程菌及其應用，屬於遺傳工程領域。本發明通過將體外擴增所得的胰蛋白酶基因融合前導短肽YVEF，並將其整合連接到畢赤酵母GS115(Pichiapastoris)染色體上，構建了一株高效分泌表達重組胰蛋白酶的價目工程菌，純化後得到熱穩定提高的重組胰蛋白酶，在40℃、50℃和60℃下，熱穩定性分別比野生胰蛋白酶提高了1.77,2.6和31倍的重組胰蛋白酶，解決了胰蛋白酶熱穩定性低的問題。應用該菌種生產胰蛋白酶，產量相對較高、工藝相對簡單、所使用工程菌株遺傳及應用背景清晰，便於工業化應用。文檔編號C12N1/19GK103173367SQ201310076829公開日2013年6月26日申請日期2013年3月11日優先權日2013年3月11日發明者陳堅,令楨民,馬騰博,堵國成,康振,李江華申請人:江南大學