抑制vegf的穩定和可溶的抗體的製作方法

2023-10-10 15:41:54

專利名稱：：抑制vegf的穩定和可溶的抗體的製作方法抑制VEGF的穩定和可溶的抗體相關信息本申請要求2008年6月25日提交的US61/133，212、2008年6月25日提交的US61/075,697,2009年2月24日提交的US61/155，041和2008年6月25日提交的US61/075,692的優先權。在整個本說明書中引用的任何專利、專利申請和參考資料的內容以其全文通過引用合併入本文。
背景技術：
：血管生成牽涉許多種病症的發病機制，所述病症包括實體瘤、眼內新生血管症候群例如增殖性視網膜病或年齡相關性黃斑變性(AMD)、類風溼性關節炎和銀屑病(Folkman等人J.Biol.Chem.267:10931-10934(1992)；Klagsbrun等人Annu.Rev.Physiol.53217-239(1991)；禾口GarnerA,Vasculardiseases.In:Pathobiologyofoculardisease.Adynamicapproach.GarnerA,KlintworthGK,Eds.第2版MarcelDekker,NY,pp1625-1710(1994))。在實體瘤中，新脈管系統(vasculture)的生長和血管生成允許腫瘤存活，並且已證明腫瘤切片中微血管的密度與乳腺癌和其他癌症的患者存活之間的關係(Weidner等人NEnglJMed324:1-6(1991)；Horak等人Lancet340:1120-1124(1992)；和Macchiarini等人Lancet340145-146(1992))。血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成和新生血管形成(neovascularization)的已知的調節劑，並且已顯示為與腫瘤和眼內病症相關的新生血管形成的至關重要的介體(Ferrara等人Endocr.Rev.18:4-25(1997))。VEGFmRNA在許多人腫瘤中過表達，並且眼液(eyefluid)中VEGF的濃度與糖尿病性和其他缺血相關視網膜病變患者的血管的活躍增殖的存在高度相關(Berkman等人，JClinInvest91:153-159(1993)；Brown等人HumanPathol.26:86-91(1995)；Brown等人CancerRes.53:4727-4735(1993)；Mattern等人Brit.J.Cancer.73:931-934(1996)；和Dvorak等人AmJ.Pathol.1461029-1039(1995)；Aiello等人N.Engl.J.Med.3311480-1487(1994))。此外，最近的研究已顯示在受AMD影響的患者的脈絡膜新生血管膜中存在局域性VEGF(Lopez等人Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37:855-868(1996))。抗VEGF中和抗體可用於在裸鼠中抑制多種人腫瘤細胞系的生長並且還可在缺血性視網膜病的模型中抑制眼內血管生成(Kim等人Nature362:841-844(1993)；Warren等人J.Clin.Invest95:1789-1797(1995)；Borgstrom等人CancerRes.56:4032-4039(1996)；和Melnyk等人CancerRes.56:921-924(1996))(Adamis等人Arch.Opthalmol.114:66-71(1996))。因此，需要能夠用於治療實體瘤和各種新生血管眼內疾病的抗VEGF單克隆抗體。發明概述本發明提供了包含來自兔單克隆抗體的CDR的可溶和穩定的抗VEGF免疫結合劑。所述抗體經設計用於診斷和/或治療VEGF介導的病症。還公開了用於表達本發明的重組抗體的雜交瘤、核酸、載體和宿主細胞、用於分離其的方法和所述抗體在醫藥中的用途。附圖概述7圖1舉例說明了使用Biacore產生的所選擇的scFv對hVEGF165的結合動力學(hVEGF165)。圖Ia顯示獲得的關於511max的數據Ka(l/Ms)6.59E+05；SE(ka)1.10E+03；kd(l/s):4.40E-05；SE(kd):6.30E-07；KD(M)6.67E-11。圖Ib顯示獲得的關於578max的數據:Ka(l/Ms):7.00E+05；SE(ka):1.40E+03；kd(l/s):3.07E-04；SE(kd)8.50E-07；KD(M):4.39E-10。圖2通過顯示578max對人、小鼠和大鼠VEGF的結合動力學舉例說明了種特異性。圖2a顯示獲得的關於人VEGF165的數據=Ka(1/Ms)7.00E+05；SE(ka)1.40E+03；kd(l/s)3.07E-04；SE(kd):8.50E-07；KD(M):4.39E-10。圖2b顯示獲得的關於小鼠VEGF164的數據:Ka(l/Ms):1.03E+06；SE(ka):2.30E+03；kd(l/s):4.40E-04；SE(kd):9.40E-07；KD(M)4.^B-IO。圖2c顯示獲得的關於大鼠VEGF164的數據Ka(l/Ms):8.83E+05；SE(ka)2.50E+03；kd(l/s):5.28E-04；SE(kd):1.20E-06；KD(M)5.98E-10。圖3舉例說明578max對VEGF同種型(hVEGF121和hVEGFllO)的結合動力學。圖3a顯示獲得的關於人VEGF165的數據:Ka(l/Ms)7.00E+05；SE(ka)1.4E+03；kd(l/s)3.07E-04；SE(kd):8.50E-07；KD(M):4.39E-10。圖3b顯示獲得的關於人VEGF121的數據Ka(l/Ms)5.87E+05；SE(ka):1.20E+03；kd(l/s):5.58E-04；SE(kd):9，60E_07；KD(M):9.50E-11。圖3c顯示獲得的關於人VEGFl10的數據:Ka(l/Ms)5.23E+05；SE(ka)1.30E+03；kd(l/s):7.22E-04；SE(kd):8.10E-07；KD(M)1.38E-09。圖4描述了578max、578minmax和578wt對hVEGF165的結合動力學。圖4a顯示獲得的關於578max的數據:Ka(l/Ms):7.00E+05；SE(ka):1.40E+03；kd(l/s):3.07E-04；SE(kd)8.50E-07；KD(M):4.39E-10。圖4b顯示獲得的關於578minmax的數據:Ka(l/Ms)8.06E+05；SE(ka)2.10E+03；kd(l/s):5.04E-04；SE(kd):1.10E-06；KD(M)6.25E-10。圖4c顯示獲得的關於578wt-His的數據Ka(l/Ms)8.45E+05；SE(ka)1.60E+03;kd(1/s)1.69E-04；SE(kd):7.60E—07；KD(M)2.OOE-IO0圖5舉例說明578max、578minmax和578minmax_DHP的熱穩定性(通過FT-IR測量去摺疊)。圖5a:578minmax(ESBA903):Tm=71.1°C；圖5b:578minmax_DHP(#961):Tm=70.2°C；圖5c:578max(#821):Tm=70.4°C。圖6舉例說明在熱脅迫(圖6a:50°C，圖6b:60°C，圖6c:70°C)30分鐘後578衍生物的變性和沉澱。圖7舉例說明578max、57aninmax和578minmax_DHP的溶解性(通過硫酸銨沉澱法進行測定)。圖7a:578max(#821)。V50為27.M%。圖7b:578minmax(ESBA903)。V50為28.13。圖7c:578minmax_DHP(#961)。V50為32.36%。圖8舉例說明VEGFR2競爭性ELISA和HUVEC測定(作為測量潛能的方法)。圖8aVEGFR2競爭性ELISA中Lucentis與51Imax(#802)的比較。Lucentis的R2:0.9417；ESBA802的R20.9700。Lucentis的EC50:7.137nM；#802的EC50:0.8221nM。圖8b:VEGFR2競爭性ELISA中Lucentis與578max(#821)的比較。圖8c:HUVEC測定中Lucentis、511maxC_his和534max的比較。Lucentis的R2:0.9399；EP511maxC_his的R2:0.9313，EP534max的R20.7391。Lucentis的EC500.08825nM，511maxC_his的EC50:0.7646nM,534max的EC5063.49nM。圖8d:HUVEC測定中Lucentis、578min和578max的比較。Lucentis的R2:0.9419，EP578min的R2:0.8886，EP578max的R2:0.9274。Lucentis的EC50:0.1529nM,578min的EC501.528nM，578max的EC50:0.1031nM。圖9舉例說明578minmax對由hVEGF165誘導的HUVEC增殖的影響。測定的參數如下hVEGF165濃度0.08nM(3ng/ml)；與VEGF和測試項目的溫育96小時。EC50為0.08959nM(對於Lucentis)和0.05516nM(對於578minmax)，而R2為0.9066(對於Lucentis)和0.9622(對於578minmax)。圖10舉例說明578minmax對由小鼠VEGF164和大鼠VEGF164誘導的HUVEC增殖的影響。測定的參數如下小鼠VEGF164濃度0.08nM(3ng/ml)；大鼠VEGF164濃度0.3nM(ll.3ng/ml)。在VEGF誘導HUVEC增殖的EC90處選擇兩個濃度；與VEGF和測試項目的溫育96小時。圖IOa舉例說明獲得的小鼠VEGF的數據。EC50為0.1196nM(對於V1253)和0.06309nM(對於578minmax)，而R2為0.02744(對於Lucentis)、0.9348(對於V1253)和0.9767(對於EP578minmax)。Lucentis不抑制由小鼠VEGF誘導的HUVEC增殖。圖IOb舉例說明獲得的大鼠VEGF的數據。EC50為1.597nM(對於V1253)和0.06974nM(對於578minmax)，而R2為00，7664(對於V1253)和0.6635(對於578minmax)。圖11舉例說明在裸豚鼠中使用Miles測定的功效研究(第I部分)。給裸豚鼠靜脈內施用染料阿爾瑪藍(almarblue)I0在染料注射後1小時，分別將hVEGF(2.61nM)和Lucentis、ESBA903或#802的預混合物2注射入動物3的皮膚。在注射溶液後1小時，對動物3實施安樂死，收集、清潔毛皮並且使用入射光和透射光對其進行數碼拍照。使用ImageJ評估滲入注射位置的伊文斯藍(EvansBlue)染料的面積，並且對劑量-面積保留(dose-arearetention)作圖。圖12舉例說明在裸豚鼠中使用Miles測定的功效研究(第II部分)。圖12a顯示獲得的關於#803(511max)的結果。EC50為5.990nM並且具有2.060至17.4InM的統計展布(statisticalspread)，而R2為0.5800。圖12b顯示獲得的關於ESBA903(578minmax)的結果。EC50為3.989並且具有1.456至10.93nM的統計展布，而R2為0.3920。圖12c顯示Lucentis的染料滲漏面積。由於曲線的較差的擬合性，無法計算Lucentis的EC50。圖13舉例說明在大鼠中使用改進的miles測定的功效研究(預先混合hVEGF165和578minmax(ESBA903))。圖13a舉例說明阿瓦斯丁(Avastin)對大鼠中VEGF誘導的視網膜血管滲漏的抗滲透性功效-劑量響應。阿瓦斯丁抑制hVEGF-誘導的視網膜血管滲透性。注射之前進行預混合。大約等摩爾量、3倍或10倍過量。*p<0.05(VEGF對BSA)，**p<0.05(阿瓦斯丁處理的對VEGF)。圖13b顯示ESBA903對大鼠中VEGF誘導的視網膜血管滲漏的抗滲透性功效。劑量響應(預先混合的，ivt)。ESBA903完全抑制hVEGF誘導的視網膜血管滲透性。注射之前進行預混合。大約等摩爾量、3倍或10倍過量。*p<0.05(VEGF對BSA)，<0.05(ESBA903處理的對VEGF)。圖14舉例說明在大鼠中使用改進的miles測定的功效研究(局部施用578minmax(ESBA903))。在局部施用後測試AL-5U87(ESBA903)對大鼠中VEGF誘導的視網膜血管滲漏的抗滲透性功效。5天的預處理，4滴/天(使用lOng/mlESBA903製劑)。*p<0.05(VEGF對BSA)，**p<0.05(VEGF對AL-51287)，***p=0.060(AL_51287對AL-52667)，##(VEGF對AL-39324)；ρ<0.05(AL-39324對媒介物參照對照)。AL-5I287ESBA903；AL-52657局部媒介物參照對照；AL-39324小分子RTK抑制劑。圖15舉例說明本文中使用的VH的⑶Rl的界定。發明詳述本發明提供了包含來自兔單克隆抗體的CDR的可溶和穩定的抗VEGF免疫結合劑。所述免疫結合劑經設計用於診斷和/或治療VEGF介導的病症。還公開了用於表達本發明的重組抗體的雜交瘤、核酸、載體和宿主細胞、用於分離其的方法和所述抗體在醫藥中的用途。定義為了可更容易地理解本發明，如下定義某些術語。另外的定義示於本說明書的上下文中。術語「VEGF」是指165個胺基酸的血管內皮細胞生長因子和相關的121、189和206個胺基酸的血管內皮細胞生長因子(如由Leung等人，Science2461306(1989)，和Houck等人，Mol.Endocrin.5=1806(1991)描述的)和這些生長因子的天然存在的等位基因形式和加工的形式。術語「VEGF受體」或「VEGFr」是指VEGF的細胞受體(通常在血管內皮細胞上發現的細胞表面受體)以及保持結合hVEGF的能力的其變體。VEGF受體的一個實例是fms樣酪氨酸激酶(fit)，酪氨酸激酶家族的跨膜受體。DeVries等人，Science255:989(1992)；Siibuya等人，Oncogene5:519(1990)。fit受體包含胞外結構域、跨膜結構域和具有酪氨酸激酶活性的胞內結構域。胞外結構域參與VEGF的結合，而胞內結構域參與信號轉導。VEGF受體的另一個實例是fIk-I受體(也稱為KDR)。Matthews等人，Proc.Nat.Acad.Sci.88:9026(1991)；Terman^A,Oncogene6:1677(1991)；Terman^A,Biochem.Biophys.Res.Commun.187:1579(1992)。VEGF對fit受體的結合導致形成至少2個高分子量複合物(具有205，000和300，000道爾頓的表觀分子量)。300，000道爾頓的複合物據信為包含結合至單個VEGF分子的兩個受體分子的二聚體。如本文中使用的，術語「兔」是指屬於兔科(1印oridae)的動物。本文中使用的術語「抗體」是「免疫球蛋白，，的同義詞。根據本發明的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個可變結構域，例如單個可變結構域，Fv(SkerraA.和Pluckthun，Α.(1988)Science240:1038-41)，scFv(Bird,R.Ε.等人(1988)Science242:423-26；Huston,J.S.等人(1988)Proc.Natl.Acad.ki.USA85:5879-83),Fab,(Fab')2或本領域技術人員熟知的其他片段。術語「⑶R」是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。所述6個CDR的最常用的定義之一由KabatΕ.A.等人，(1991)kquencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的⑶R1、⑶R2和⑶R3(⑶RLi、⑶RL2、⑶RL3或Li、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的⑶R2和⑶R3(⑶RH2、⑶RH3或H2、H3)。然而，如本文中使用的，根據下列殘基(Kabat編號)定義重鏈可變結構域的CDRl(CDRHl或Hl)其始於位置沈並且終止於位置36之前。這基本上是由Kabat和Chotia分別定義的⑶RHl的融合物(關於示例說明，也參見圖15)。本文中使用的術語「抗體構架」或有時僅稱為「構架」，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。術語「單鏈抗體」、「單鏈Fv」或「scFv」意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；^的分子。此類scFv分子可具有一般結構=NH2-V^接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭C00H。如本文中所使用的，「同一性」是指兩個多肽、分子之間或兩個核酸之間匹配的序列。當兩個進行比較的序列中的位置都被相同的鹼基或胺基酸單體亞單元佔據(例如，如果兩個DNA分子的每一個中的位置都被腺嘌呤佔據，或兩個多肽的每一個中的位置都被賴氨酸佔據)時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的「百分數同一性」是由這兩個序列共有的匹配位置的數目除以進行比較的位置的數目再乘以100的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那麼這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，通過電腦程式例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地進行的Needleman等(I97O)J.Mol.Biol.48:443-453的方法來提供。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.ApplBiosci.，411-17(1988))，使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個胺基酸序列之間的百分比同一性。此外，可使用已整合入GCG軟體包(可在mgcg.com上獲得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權重和1，2，3，4，5或6的長度權重來測定兩個胺基酸序列之間的百分比同一性。「相似的」序列是當比對時共有相同和相似胺基酸殘基的序列，其中相似的殘基是進行比對的參照序列中的相應胺基酸殘基的保守置換。在這點上，參照序列中的殘基的「保守置換」是用在物理或功能上與相應的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。因此，「經保守置換修飾的」序列是與參照序列或野生型序列相異在於存在一個或多個保守置換的序列。兩個序列之間的「百分數相似性」是包含由兩個序列共有的匹配殘基或保守置換的位置的數目除以進行比較的位置的數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配以及10個位置中有2個包含保守置換，那麼這兩個序列具有80%的正相似性。如本文中使用的，術語「保守的序列修飾」意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。此類保守的序列修飾包括核苷酸和胺基酸置換、添加和缺失。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入修飾。保守胺基酸置換包括其中用具有相似側鏈的胺基酸殘基替代胺基酸殘基的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個胺基酸殘基替代人抗VEGF抗體中的預測的非必需胺基酸殘基。鑑定不消除抗原結合作用的核苷酸和胺基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的(參見，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.ki.USA94:412-417(1997))。本文中使用的「胺基酸共有序列」是指可使用至少兩個，優選更多的進行比對的胺基酸序列的矩陣產生的胺基酸序列(允許在比對中出現缺口)，其使得可能確定各位置上出現頻率最高的胺基酸殘基。共有序列是包含在各位置上出現頻率最高的胺基酸的序列。如果兩個或更多個胺基酸等同地出現在單個位置上，那麼共有序列包括兩個或所有此類胺基酸。可在不同水平上分析蛋白質的胺基酸序列。例如，可在單個殘基水平、多個殘基水平、具有缺口的多個殘基水平等上展示保守性或變異性。殘基可展示相同殘基的保守性或可在種類水平上保守。胺基酸種類的實例包括具有下列的胺基酸種類極性的但不帶電荷的R基團(絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺)；帶正電荷的R基團(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負電荷的R基團(穀氨酸和天冬氨酸)；疏水R基團(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊胺基酸種類(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對於本領域技術人員來說是已知的並且可使用結構測定法或其他數據來定義以估量可置換性。在該意義上，可置換的胺基酸可以指可在該位置上進行置換並且保持功能保守性的任何胺基酸。然而，將認識到，相同種類的胺基酸在它們的生物物理性質上可具有一定程度的不同。例如，將認識到，某些疏水性R基團(例如，丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸)比其他疏水性R基團(例如，纈氨酸或亮氨酸)更加親水(即，具有更高的親水性或更低的疏水性)。相對親水性或疏水性可使用本領域公知的方法(參見，例如，Rose等人，Science,229834-838(1985)和Cornette等人，J.Mol.Biol.，195:659-685(1987))來測定。如本文中所使用的，當一個胺基酸序列(例如，第一￥11或八序列)與一個或多個另外的胺基酸序列(例如，資料庫中的一個或多個VH或VL序列)比對時，可將一個序列(例如，第一Vh或\序列)中的胺基酸位置與一個或多個另外的胺基酸序列中的「相應位置」相比較。如本文中所使用的，「相應位置」表示當對序列進行最優比對時，即當序列進行比對以獲得最高百分數同一性或百分數相似性時進行比較的序列中的等同位置。如本文中所使用的，術語「抗體資料庫」是指兩個或更多個抗體胺基酸序列(「多個」序列)的集合，通常是指數十個、數百個或甚至數千個抗體胺基酸序列的集合。抗體資料庫可存儲例如抗體Vh區、抗體\區或兩者的集合的胺基酸序列，或可存儲由Vh和\區域組成的scFv序列的集合。優選，可將資料庫存儲在可檢索的、固定的介質中，例如計算機上可檢索的電腦程式中。在一個實施方案中，抗體資料庫是包含或由種系抗體序列組成的資料庫。在另一個實施方案中，抗體資料庫是包含或由成熟(即，表達的)抗體序列組成的資料庫(例如，成熟抗體序列的Kabat資料庫，例如KBD資料庫)。在另一個實施方案中，抗體資料庫包含或由功能性選擇的序列(例如，根據QC測定選擇的序列)組成。術語「免疫結合劑」是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結構域的全部或一部分，這樣免疫結合劑能夠特異性識別靶抗原。免疫結合劑的非限定性實例包括全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限於(i)Fab片段，由\、VH、CjnCHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有鉸鏈區的一部分的Fab(參見，FundamentalImmunology(Paul編輯，3.sup.rded.1993)；(iv)由Vh和ChI結構域組成的Fd片段；(ν)由抗體的單臂的\和Vh結構域組成的Fv片段；(vi)單結構域抗體例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)，其由Vh或八結構域組成，Camelid(參見Hamers-Casterman等人，Nature363:446-448(1993)和Dumoulin等人，ProteinScience11:500-515(2002))或Shark抗體(例如，sharkIg-NARsNanobodieS)；和(Vii)納米抗體(Nanobody)，包含可變結構域和兩個恆定結構域的重鏈區。如本文中所使用的，術語「功能性質」是例如為了提高多肽的生產性質或治療功效，其提高(例如相對於常規多肽)對於本領域技術人員來說是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結合劑)的性質。在一個實施方案中，功能性質是穩定性(例如，熱穩定性)。在另一個實施方案中，功能性質是溶解性(例如，在細胞條件下)。在另一個實施方案中，功能性質是非聚集性。在另一個實施方案中，功能性質是蛋白質表達(例如，在原核細胞中)。在另一個實施方案中，功能性質是在相應的純化方法中內含體溶解後的重摺疊效率。在某些實施方案中，抗原結合親和力不是期望提高的功能性質。術語「表位」或「抗原決定簇」是指抗原(例如，VEGF)上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷，G.E.Morris,Ed.(1996)。術語「特異性結合」、「選擇性結合」、「選擇性地結合」和「特異性地結合」是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10_7m，例如大約小於10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或更小的親和力(Kd)結合。術語「KD」或「K/』是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約1(ΓΜ，例如小於大約10_%、101或ΙΟ,Μ或更小的解離平衡常數(Kd)結合VEGF，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIAC0RE儀中測定的。術語「中和VEGF」、「抑制VEGF」和「阻斷VEGF」可互換使用，表示本發明的抗體阻止VEGF與一個或多個VEGF受體例如VEGFR-I和/或VEGFR-2相互作用(從而例如引發信號轉導)的能力。本文中使用的「重組免疫結合劑」是指通過從重組DNA表達而產生的免疫結合劑。如本文中使用的，」嵌合的」免疫結合劑具有與來源於特定物種或屬於特定抗體種類或亞類的抗體中的相應序列同一或同源的重鏈和/或輕鏈的部分，同時鏈的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體種類或亞類的抗體以及此類抗體的片段中的相應序列同一或同源。本文中使用的人源化抗體是一種嵌合抗體。如本文中使用的，」人源化抗體」是使用重組DNA技術合成以規避對外來抗原的免疫應答的免疫結合劑。人源化是用於減少異種來源的單克隆抗體的免疫原性的良好建立的技術。這包括受體構架的選擇(優選人受體構架)、待插入受體構架的來自供體免疫結合劑的CDR的範圍和來自供體構架的殘基至受體構架內的置換。用於將CDR移植入人受體構架的一般方法已由Winter在美國專利5，225，539(其以其全文通過引用合併入本文)中公開。US6，407，213(其教導以其全文通過引用合併入本文)公開了構架的許多胺基酸位置，其中來自供體免疫結合劑的置換是優選的。術語「核酸分子」是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是「有效連接的」。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至所述編碼序列。術語「載體」是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。另一種類型的載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。某些載體(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)能夠在已將它們引入其中的宿主細胞中自主複製。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而它們可隨宿主基因組一起複製。術語「宿主細胞」是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)；月市炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Mi^ptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(Pichiapastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NSO細胞。術語「治療」、「療法」和「醫治」是指本文中描述的治療性或預防性措施。「治療」的方法利用給有此治療需要的受試者(例如，患有VEGF介導的病症的受試者或最終可能獲得這樣的病症的受試者)施用本發明的抗體以預防、治癒、延遲、減輕病症或復發性病症的嚴重度或改善其一個或多個症狀，或以延長在這樣的治療不存在的情況下所預期的受試者的存活。術語"VEGF-介導的病症"是指其症狀或疾病狀態的發作、進展或持續需要VEGF的參與的任何病症。示例性VEGF介導的病症包括但不限於，年齡相關黃斑變性、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、晶體後纖維增生症、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、男性細胞瘤(arrhenoblastoma)、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮內膜增生、子宮內膜異位、纖維肉瘤、絨毛膜癌、頭頸癌、鼻咽癌、喉癌、肝母細胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、黑素瘤、皮膚癌、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、胰腺癌、視網膜母細胞瘤、星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、神經鞘瘤、少突膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲狀腺癌、腎母細胞瘤(Wilm'stumor)、腎細胞癌、前列腺癌、與斑痣性錯構瘤病(phakomatoses)相關的異常血管增生、水腫(edema)(例如與腦腫瘤相關的水腫)、麥格症候群(Meigs'syndrome)、類風溼性關節炎、銀屑病和動脈粥樣硬化。術語"有效劑量"或"有效給藥量"是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。對於該用途有效的量將取決於待治療的病症的嚴重度和患者自己的免疫系統的總體狀態。術語「受試者」是指任何人或非人動物。例如，本發明的方法和組合物可用於治療患有VEGF介導的病症的受試者。如本文中使用的，術語〃Min-graft"或〃min"是指通過將來自兔可變結構域的兔⑶R移植入天然存在的人受體構架(FW1.4，SEQIDNo.172)而產生的人源化的可變結構域。在構架區中不進行改變。就期望的功能性質(溶解性和穩定性)預先選擇構架本身。如本文中使用的，術語〃Max-graft"或〃max"是指通過將來自兔可變結構域的兔CDR移植入「兔源化的(rabbitized)，，人受體構架〃RabTor」(rFWl.4，SEQIDNo.173)或移植入稱為rFWl.4(v2)的其衍生物(SEQIDNo.174)而產生的人源化的可變結構域。通過整合通常參與兔可變結構域結構和穩定性的構架位置處的保守兔殘基(另外其在其他物種中是高度可變的)來製備"RabTor"構架，目的在於產生可通用的構架，所述構架幾乎接受任何兔⑶R組而無需移植供體構架殘基(除了在這樣的位置上，所述位置在它們的假定祖先序列中不同，例如在體細胞高度突變過程中被改變從而可能促進抗原結合)。假定的祖先序列定義為最接近的兔種系對應物，並且在不能確定最接近的種系對應物的情況下，定義為兔亞型共有序列或具有高相似性百分數的兔序列的共有序列。如本文中使用的，術語〃Min-Max"或〃minmax"是指包含"Min-graft」可變輕鏈與"Max-graft"可變重鏈的人源化可變結構域。如本文中使用的，術語〃Max-Min"或〃maxmin"是指包含"Max-graft"可變輕鏈與"Min-graft"可變重鏈的人源化可變結構域。不同的命名法被用於產生的免疫結合劑。此類免疫結合劑通常利用編號(例如#578)來標識。在使用前綴例如EP或Epi的情況下(例如，EP578，其與Epi578相同)，表示相同的免疫結合劑。有時，免疫結合劑接受由前綴"ESBA"標識的第二名稱。例如ESBA903表示與578minmax或EP578minmax或Epi578minmax相同的免疫結合劑。除非另外指出，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域內的技術人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用於本發明的實踐或試驗中，但下面描述了適當的方法和材料。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例只是舉例說明性的而非限定性的。在下列部分更詳細地描述本發明的多個方面。應理解，可隨意組合不同實施方案、參數和範圍。此外，取決於具體的實施方案，可不使用選擇的定義、實施方案或範圍。抗VEGF免疫結合劑在一個方面，本發明提供了結合VEGF，從而適合於在體內阻斷VEGF的功能的免疫結合劑。此類免疫結合劑的CDR來源於從用人VEGF和/或其片段(SEQIDNO.1)免疫的兔獲得的兔抗VEGF單克隆抗體。就我們所知，這是首次從兔獲得單克隆抗VEGF抗體並且對其進行了詳盡地表徵。令人驚訝地，發現親和力(Kd)極高。在某些實施方案中，本發明提供了特異性結合VEGF的免疫結合劑，其包含CDRH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3胺基酸序列中的至少一個。用於本發明的免疫結合劑的示例性⑶R胺基酸序列示於SEQIDNo:2-72(表1-6)中。表1.本發明的抗VEGF免疫結合劑的⑶RHl胺基酸序列。權利要求1.中和人VEGF並且包含兔⑶R的重組免疫結合劑，其包含可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL)。2.權利要求1的免疫結合劑，其為嵌合免疫結合劑。3.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其為人源化的。4.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO14,SEQIDNO26,SEQIDNO37,SEQIDNO49,SEQIDN0:60禾口SEQIDNO:71的共有序列具有至少80%的相似性的⑶R。5.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO2,SEQIDNO3,SEQIDNO:15，SEQIDNO:27，SEQIDNO:38，SEQIDNO50和SEQIDNO61的序列具有至少80%的相似性的⑶R。6.權利要求5的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO:2,SEQIDN0:15和SEQIDNO:27組成的組中的CDR和/或其中所述VL包含由SEQIDNO:38，SEQIDNO:50和SEQIDNO61組成的組中的CDR。7.權利要求5的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO:3,SEQIDNO:15和SEQIDNO:27組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO38,SEQIDN0:50和SEQIDNO61組成的組中的⑶R。8.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:4，SEQIDNO16,SEQIDNO28,SEQIDNO39,SEQIDNO:51禾口SEQIDNO:62的序列具有至少80%的相似性的⑶R。9.權利要求8的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO4,SEQIDNO16,SEQIDNOJ8組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO39,SEQIDN0:51禾口SEQIDNO:62組成的組中的CDR。10.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:5,SEQIDNO:17,SEQIDNO29,SEQIDNO40,SEQIDN0:52禾口SEQIDNO:63的序列具有至少80%的相似性的⑶R。11.權利要求10的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO:5,SEQIDNO17,SEQIDNO:組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO40,SEQIDN0:52和SEQIDN0:63組成的組中的CDR。12.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDN0:6，SEQIDNO:18,SEQIDNO30,SEQIDN0:41，SEQIDNO:53禾口SEQIDNO:64的序列具有至少80%的相似性的⑶R。13.權利要求12的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO:6，SEQIDN0:18和SEQIDNO:30組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:41，SEQIDNO:53和SEQIDNO:64組成的組中的CDR。14.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:7,SEQIDNO:19,SEQIDN0:31，SEQIDNO42,SEQIDNO:54禾口SEQIDNO:65的序列具有至少80%的相似性的⑶R。15.權利要求14的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO-J,SEQIDN0:19和SEQIDNO:31組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:42，SEQIDN0:54和SEQIDNO:65組成的組中的CDR。16.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:8，SEQIDNO:20,SEQIDNO32,SEQIDNO43,SEQIDN0:55禾口SEQIDNO:66的序列具有至少80%的相似性的⑶R。17.權利要求16的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO:8，SEQIDNO:20和SEQIDNO:32組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:43，SEQIDNO:55和SEQIDNO:66組成的組中的CDR。18.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:9,SEQIDNO:21,SEQIDNO33,SEQIDNO44,SEQIDN0:56禾口SEQIDNO:67的序列具有至少80%的相似性的⑶R。19.權利要求18的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO:9，SEQIDNO:21和SEQIDNO:33組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:44，SEQIDNO56禾口SEQIDNO:67組成的組中的CDR。20.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:10，SEQIDNO22,SEQIDNO34,SEQIDNO45,SEQIDNO57禾口SEQIDNO:68的序列具有至少80%的相似性的⑶R。21.權利要求20的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO10,SEQIDNO:22和SEQIDNO:；34組成的組中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:45，SEQIDNO:57和SEQIDNO68組成的組中的CDR。22.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO:11，SEQIDNO13,SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDNO:35，SEQIDNO:46，SEQIDNO58和SEQIDNO69的序列具有至少80%的相似性的CDR023.權利要求22的免疫結合劑，其中所述VH包含⑴由SEQIDNO:11，SEQIDNO:23和SEQIDNO35組成的組中的CDR；(ii)由SEQIDNO:11，SEQIDNO:25和SEQIDNO；35組成的組中的CDR;(iii)由SEQIDNO13,SEQIDNO23和SEQIDNO:；35組成的組中的CDR；或(iv)由SEQIDNO:13，SEQIDNO25和SEQIDNO35組成的組中的CDR024.權利要求23的免疫結合劑，其中所述VL包含由SEQIDNO:46，SEQIDNO:58和SEQIDNO:69組成的組中的CDR。25.權利要求1至4的任一項的免疫結合劑，其包含至少一個與選自SEQIDNO12,SEQIDNO24,SEQIDNO:36，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48，SEQIDNO59和SEQIDNO70的序列具有至少80%的相似性的⑶R。26.權利要求25的免疫結合劑，其中所述VH包含由SEQIDNO12,SEQIDNO:和SEQIDNO:36組成的組中的CDR和/或所述VL包含(i)由SEQIDN0:47，SEQIDNO:59和SEQIDNO:70組成的組中的CDR；或(ii)由SEQIDNO:48，SEQIDNO59禾口SEQIDN0:70組成的組中的CDR。27.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其包含與SEQIDNO:169的序列具有至少80%的序列同一性的重鏈可變區構架序列。28.權利要求27的免疫結合劑，其中所述重鏈可變區構架是SEQIDNO:170或SEQIDNO:171。29.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其在根據AHo編號系統的重鏈可變區的位置1、83或87處具有缺失。30.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其在根據AHo編號系統的重鏈可變區的位置2，12，24，25，46，54，55，83，84，87，89，103，105，108或144的至少一個位置處具有置換。31.權利要求30的免疫結合劑，其中所述置換選自(a)位置2處的穀氨醯胺；(b)位置12處的絲氨酸；(c)位置M處的蘇氨酸；(d)位置25處的纈氨酸；(e)位置46處的亮氨酸；(f)位置討處的酪氨酸；(g)位置陽處的異亮氨酸；(h)位置83處的丙氨酸；(i)位置84處的天冬醯胺；(j)位置87處的丙氨酸或亮氨酸；(k)位置89處的丙氨酸或亮氨酸；(1)位置103處的絲氨酸或蘇氨酸；(m)位置105處的苯丙氨酸；(η)位置108處的精氨酸；和(ο)位置144處的絲氨酸或蘇氨酸。32.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其包含與SEQIDNO:167的序列具有至少85%的序列同一性的輕鏈可變區構架序列。33.權利要求30的免疫結合劑，其中所述輕鏈可變區構架是SEQIDNO:167或SEQIDNO:168。34.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其在根據AHo編號系統的輕鏈可變區的位置1、2或15的至少一個位置處具有置換。35.權利要求34的免疫結合劑，其中所述置換選自(a)位置1處的天冬氨酸；(b)位置2處的纈氨酸；(c)位置15處的蘇氨酸。36.權利要求5-7或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:107至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:72至少80%相似的輕鏈可變區。37.權利要求8-9或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:109至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:73至少80%相似的輕鏈可變區。38.權利要求10-11或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:110至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:74至少80%相似的輕鏈可變區。39.權利要求12-13或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:111至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:75至少80%相似的輕鏈可變區。40.權利要求14-15或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:112至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:76至少80%相似的輕鏈可變區。41.權利要求16-17或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:113至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:77至少80%相似的輕鏈可變區。42.權利要求41的免疫結合劑，其與SEQIDNO178，SEQIDNO:179或SEQIDNO:180具有至少80%的同一性。43.權利要求18-19或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:114至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:78至少80%相似的輕鏈可變區。44.權利要求20-21或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:115至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:79至少80%相似的輕鏈可變區。45.權利要求44的免疫結合劑，其與SEQIDNO:177具有至少80%的同一性。46.權利要求22-M或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:116至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:80至少80%相似的輕鏈可變區。47.權利要求2546或27-35的任一項的免疫結合劑，其包含含有與SEQIDNO:117至少80%相似的胺基酸序列的重鏈可變區和/或與SEQIDNO:81至少80%相似的輕鏈可變區。48.權利要求47的免疫結合劑，其與SEQIDNO:176具有至少80%的同一性。49.與前述權利要求的任一項的免疫結合劑競爭對人VEGF的結合的免疫結合劑。50.一種免疫結合劑，其以至少IO7M-1的親和力結合被前述權利要求的任一項的免疫結合劑識別的人VEGF上的表位。51.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其特異性結合人和大鼠/小鼠VEGF。52.前述權利要求的任一項的免疫結合劑，其是抗體、scFv、Fab或Dab。53.包含前述權利要求的任一項的免疫結合劑和藥學上可接受的載體的組合物。54.編碼前述權利要求的任一項的免疫結合劑的分離的核酸分子。55.包含權利要求M的核酸分子的表達載體。56.包含權利要求55的表達載體的宿主細胞。57.治療或預防受試者中的人VEGF介導的疾病的方法，其包括給受試者施用前述權利要求的任一項的免疫結合劑以便治療所述受試者的VEGF介導的疾病。58.權利要求57的方法，其中局部施用所述免疫結合劑。59.權利要求57或58的方法，其中所述VEGF介導的疾病選自年齡相關黃斑變性、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、晶體後纖維增生症、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、男性細胞瘤、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮內膜增生、子宮內膜異位、纖維肉瘤、絨毛膜癌、頭頸癌、鼻咽癌、喉癌、肝母細胞瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤、皮膚癌、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、胰腺癌、視網膜母細胞瘤、星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、神經鞘瘤、少突膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲狀腺癌、腎母細胞瘤、腎細胞癌、前列腺癌、與斑痣性錯構瘤病相關的異常血管增生、水腫(例如與腦腫瘤相關的水腫)、麥格症候群、類風溼性關節炎、銀屑病和動脈粥樣硬化。60.產生包含SEQIDNo60-166和SEQIDNo.175-180中所示的任一個胺基酸序列的抗體的雜交瘤。61.適合用於產生或鑑定與大鼠/小鼠和人VEGF或其部分交叉反應的免疫結合劑的免疫原。62.權利要求61的免疫原，其具有SEQIDNo.1。63.製備與大鼠/小鼠和人VEGF交叉反應的免疫結合劑的方法，其中所述方法使用權利要求61的免疫原。全文摘要本發明涉及包含來自兔單克隆抗體的CDR的可溶和穩定的抗VEGF免疫結合劑。所述抗體經設計用於診斷和/或治療VEGF介導的病症。還公開了用於表達本發明的重組抗體的雜交瘤、核酸、載體和宿主細胞、用於分離其的方法和所述抗體在醫藥中的用途。文檔編號A61K39/395GK102143976SQ200980124313公開日2011年8月3日申請日期2009年6月25日優先權日2008年6月25日發明者D·厄裡什,L·波拉斯,T·岡德申請人:艾斯巴技術,愛爾康生物醫藥研究裝置有限責任公司