一種土壤線蟲群落基因組提取方法

2023-10-10 11:40:54 2

一種土壤線蟲群落基因組提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種土壤線蟲群落基因組提取方法該具體過程為：將提取的土壤線蟲懸液於-20℃冷凍10-20分鐘後於室溫下解凍，將線蟲懸浮液離心，棄除上清液；向留有線蟲沉澱的離心管中加入DNA提取液和蛋白酶K，37℃；向將保溫消化的線蟲溶液中加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，離心；所述線蟲溶液在4℃離心，以12000rp/m的速度離心10-12分鐘；吸取上清液於新管中再加入1/5倍體積的醋酸鈉和2倍體積無水乙醇混合；向留有沉澱的離心管中加入70％乙醇洗滌DNA1-2次，離心；所得土壤線蟲DNA自然風乾後將其溶於滅菌雙蒸水於-20℃冷凍保存，減少對後續實驗的幹擾。本發明採用物理、化學、酶法相結合方法對線蟲細胞進行裂解，提高了線蟲群落樣品基因組DNA提取效果。
【專利說明】—種土壤線蟲群落基因組提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因提取領域，尤其涉及一種土壤線蟲群落基因組提取方法。
【背景技術】
[0002]土壤線蟲是植物根際土壤生物區重要的後生動物，在自然界中數量龐大，種類繁多，且直接參與土壤生態系統的物質循環和能量流動，對有機物的分解，養分轉化和能量傳遞起到關鍵的作用，是土壤生態系統的重要組成部分。土壤線蟲生存能力、繁殖能力和環境適應能力強，且對環境變化敏感，其群落組成能夠反映出土壤的理化和生物性狀，因此土壤線蟲成為評價土壤健康的重要指示生物。
[0003]由於線蟲體形較小，形態學特徵易受多種因素影響，變異較大，從形態學上鑑定這些線蟲種類，需要豐富的分類鑑定知識和經驗。分子生物學方法已成為十分有效的輔助手段，而其基礎是簡單、高效快速、穩定的進行線蟲DNA提取。高效的提取線蟲群落DNA，使之可以代表整個群落，進而可以進行物種多樣性、功能多樣性分析。近年來，鹼裂解法、蛋白酶K法、試劑盒法等進行線蟲DNA提取，但存在實驗時間長、所用試劑多、價格貴、結果不穩定等問題。
[0004]鑑於上述缺陷，本發明創作者經過長時間的研究和實踐終於獲得了本創作。

【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種土壤線蟲群落基因組提取方法，用以克服上述技術缺陷。
[0006]為實現上述目的，本發明提供一種土壤線蟲群落基因組提取方法，該具體過程為:
[0007]步驟a，將提取的土壤線蟲懸液於-20°C冷凍10-20分鐘後於室溫下解凍，將線蟲懸浮液離心，棄除上清液；
[0008]步驟b，向留有線蟲沉澱的離心管中加入DNA提取液和蛋白酶K，37°C，150rp/min震蕩1-2小時進行保溫消化；
[0009]步驟C，向將保溫消化的線蟲溶液中加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，離心，將上清液轉移至另一新管中；所述線蟲溶液在4°C離心，以12000rp/m的速度離心10-12分鐘；
[0010]步驟d，吸取上清液於新管中再加入1/5倍體積的醋酸鈉和2倍體積無水乙醇混合，於4°C靜置2小時，再以4°C，14000rp/min離心20分鐘，即為土壤線蟲DNA，混合液離心後，棄除上清液；
[0011]步驟e，向留有沉澱的離心管中加入70%乙醇洗滌DNA1-2次，離心，棄除上清液；
[0012]步驟f，自然晾乾後，向離心管中加入無菌雙蒸水溶解DNA，冷凍保存；所得土壤線蟲DNA自然風乾後將其溶於滅菌雙蒸水於-20°C冷凍保存，減少對後續實驗的幹擾。
[0013]進一步，在上述步驟a中，所述線蟲懸浮液為無菌水保存的線蟲；所述離心於室溫下，以8000rp/min的速度離心5min。
[0014]進一步，在上述步驟a中，所述土壤線蟲群落的分離為將土壤樣品加水過濾，分別經過一層線蟲濾紙和兩層紗布，而後將過濾得到的線蟲懸浮液靜置約30min，棄掉上層清液，得到濃縮的線蟲懸浮液。
[0015]進一步，在上述步驟a中，所述凍融處理:將提取的土壤線蟲懸液於-20°C冷凍10-20分鐘後於室溫下解凍。
[0016]進一步，在上述步驟b中，所述DNA提取液於室溫下保存，由10mMTris-HC1、ImMEDTA,0.1% (V/V) SDS 所配成，pH8.0。
[0017]進一步，在上述步驟c中，所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25: 24:1。
[0018]進一步，在上述步驟d中，所述醋酸鈉的濃度為3M，無水乙醇為-20°C預冷。
[0019]進一步，在上述步驟e中，所得土壤線蟲DNA要用70%乙醇洗滌1_2次。
[0020]進一步，在上述步驟f中，所得土壤線蟲DNA自然風乾後將其溶於無菌雙蒸水中並於-20°C下保存備用。
[0021]與現有技術相比較本發明的有益效果在於:本發明採用物理、化學、酶法相結合方法對線蟲細胞進行裂解，提高了線蟲群落樣品基因組DNA提取效果。提取的DNA樣品可以滿足以PCR為基礎的反應，並且可以應用到其他的DNA操作技術，例如變性梯度凝膠電泳，
克隆等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發明陝西省不同地區土壤線蟲群落DNA於I %濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0023]以下結合附圖，對本發明上述的和另外的技術特徵和優點作更詳細的說明。
[0024]該基因組提取的具體過程為:
[0025]步驟a，將提取的土壤線蟲懸液於_20°C冷凍10_20分鐘後於室溫下解凍，將線蟲懸浮液離心，棄除上清液；在該步驟中，所述線蟲懸浮液為無菌水保存的線蟲；所述離心於室溫下，以8000rp/min的速度離心5min。
[0026]所述土壤線蟲群落的分離為將土壤樣品加水過濾，分別經過一層線蟲濾紙和2層紗布，而後將過濾得到的線蟲懸浮液靜置約30min，棄掉上層清液，得到濃縮的線蟲懸浮液。
[0027]步驟b，向留有線蟲沉澱的離心管中加入DNA提取液和蛋白酶K，37°C，150rp/min震蕩1-2小時進行保溫消化；所述DNA提取液於室溫下保存，由1OmMTris-HC1、lmMEDTA、0.1% (V/V) SDS 所配成，ρΗ8.0。
[0028]步驟c，向將保溫消化的線蟲溶液中加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，離心，將上清液轉移至另一新管中；所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25: 24: 1，所述離心於4°C，以12000rp/m的速度離心10-12分鐘。
[0029]步驟d，吸取上清液於新管中再加入1/5倍體積的NaAc和2倍體積無水乙醇混合，於4°C靜置2小時，再以4°C ，14000rp/min離心20分鐘，即為土壤線蟲DNA，混合液離心後，棄除上清液；所述醋酸鈉的濃度為3M，無水乙醇為-20°C預冷。
[0030]步驟e，向留有沉澱的離心管中加入70%乙醇洗滌DNA1-2次，離心，棄除上清液；
[0031]步驟f，自然晾乾後，向離心管中加入無菌雙蒸水溶解DNA，冷凍保存；所得土壤線蟲DNA自然風乾後將其溶於滅菌雙蒸水於-20°C冷凍保存，減少對後續實驗的幹擾。
[0032]請參閱圖1所示，其為陝西省不同地區土壤線蟲群落DNA於I %濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；
[0033]圖中，M:標準；YJ:宜君縣土壤線蟲；HPS:蒿坪寺土壤線蟲；LN:洛南縣土壤線蟲。
[0034]現根據實施例對本發明進行說明:
[0035]實施例一:
[0036]土壤混合線蟲樣品獲取:在口徑為20cm的玻璃漏鬥末端接一段橡皮管，在橡皮管後端用彈簧夾夾緊，在漏鬥內放置一層鐵絲網，其上放置兩層紗布，並在上面放一層線蟲濾紙，用漏鬥夾將漏鬥固定在鐵架臺上，取200g 土樣均勻鋪在濾紙上，加水至浸沒土壤。由於線蟲的趨水性以及自身的重量，陸續穿過濾紙空隙進入水中，聚集在漏鬥末端的橡皮管中。將線蟲分離裝置置於20°C室溫下分離。24h後緩慢打開彈簧夾，將橡皮管中的水收集於培養皿中，靜置約30min，於顯微鏡下用膠頭滴管吸取上層清水，只保留下層線蟲懸浮液，然後將線蟲懸浮液轉入1.5ml離心管中，保存於_20°C備用。
[0037]將提取的土壤 線蟲懸浮液在室溫下8000rp/min離心5min ；
[0038]用槍頭吸取上層清液，保留下面300ul液體，加入lOOulDNA提取緩衝液和4ul蛋白酶K(20ug/ul)於37°C下震蕩保溫消化Ih ;而後向保溫消化後的線蟲溶液中加入等體積的苯酹、氯仿、異戍醇混合液輕輕混勻，室溫靜置IOmin, 4°C, 12000rp/min離心10min,上清轉移到另一新管中，加入1/5倍體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇混勻，混合物於4°C放置2h, 14000rp/min離心20min,棄上清,沉澱即為土壤線蟲基因組DNA。所述沉澱於室溫下自然風乾，加入30ul滅菌雙蒸水，_20°C下保存備用。
[0039]實施例二:
[0040]土壤混合線蟲樣品獲取為貝爾曼漏鬥法，經過濾紙和紗布過濾後，取橡皮管底部水樣，靜置，收集線蟲懸浮液。
[0041]將提取的土壤線蟲懸浮液在室溫下8000rp/min離心5min，用槍頭吸取上層清液，保留下面200ul液體，加入lOOulDNA提取緩衝液和4ul蛋白酶K(20ug/ul)於37°C下震蕩保溫消化2h;而後向保溫消化後的線蟲溶液中加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇混合液輕輕混勻，室溫靜置IOmin,4°C, 12000rp/min離心10min,上清轉移到另一新管中，加入1/10倍體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇混勻，混合物於4°C放置2h, 14000rp/min離心20min,棄上清，沉澱即為土壤線蟲基因組DNA。所述沉澱用70%乙醇洗滌後於室溫下自然風乾，加入50ul滅菌雙蒸水，_20°C下保存備用。
[0042]實施例三:
[0043]土壤混合線蟲樣品獲取為貝爾曼漏鬥法，經過濾紙和紗布過濾後，取橡皮管底部水樣，靜置，收集線蟲懸浮液於-20°C下保存備用。
[0044]將提取的土壤線蟲懸浮液室溫溶化後在室溫下8000rp/min離心5min，用槍頭吸取上層清液，保留下面200ul液體，加入lOOulDNA提取緩衝液和4ul蛋白酶K(20ug/ul)於37°C下震蕩保溫消化1.5h ;而後向保溫消化後的線蟲溶液中加入等體積的苯酚、氯仿、異戍醇混合液輕輕混勻，室溫靜置IOmin, 4°C, 12000rp/min離心10min,上清轉移到另一新管中，加入1/5倍體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇混勻，混合物於4°C放置2h, 14000rp/min離心20min，棄上清，沉澱即為土壤線蟲基因組DNA。所述沉澱用70%乙醇洗滌後於室溫下自然風乾，加入40ul滅菌雙蒸水，_20°C下保存備用。
[0045]以上所述僅為本發明的較佳實施例，對發明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業技術人員理解，在發明權利要求所限定的精神和範圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入 本發明的保護範圍內。
【權利要求】
1.一種土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，該具體過程為: 步驟a，將提取的土壤線蟲懸液於-20°c冷凍10-20分鐘後於室溫下解凍，將線蟲懸浮液離心，棄除上清液； 步驟b，向留有線蟲沉澱的離心管中加入DNA提取液和蛋白酶K，370C，150rp/min震蕩1-2小時進行保溫消化； 步驟C，向將保溫消化的線蟲溶液中加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，離心，將上清液轉移至另一新管中；所述線蟲溶液在4°C離心，以12000rp/m的速度離心10-12分鐘； 步驟d，吸取上清液於新管中再加入1/5倍體積的醋酸鈉和2倍體積無水乙醇混合，於4°C靜置2小時，再以4°C，14000rp/min離心20分鐘，棄除上清液，沉澱即為土壤線蟲DNA ； 步驟e，向留有沉澱的離心管中加入70%乙醇洗滌DNA1-2次，離心，棄除上清液； 步驟f，自然晾乾後，向離心管中加入無菌雙蒸水溶解DNA，冷凍保存；所得土壤線蟲DNA自然風乾後將其溶於滅菌雙蒸水於-20°C冷凍保存，減少對後續實驗的幹擾。
2.根據權利要求1所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，在上述步驟a中，所述線蟲懸浮液為無菌水保存的線蟲；所述離心於室溫下，以8000rp/min的速度離心5min。
3.根據權利要求2所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，在上述步驟a中，所述土壤線蟲群落的 分離為將土壤樣品加水過濾，分別經過一層線蟲濾紙和兩層紗布，而後將過濾得到的線蟲懸浮液靜置約30min，棄掉上層清液，得到濃縮的線蟲懸浮液。
4.根據權利要求3所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，在上述步驟a中，所述凍融處理:將提取的土壤線蟲懸液於_20°C冷凍10-20分鐘後於室溫下解凍。
5.根據權利要求4所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，在上述步驟b中，所述DNA提取液於室溫下保存，由IOmMTris-HC1、lmMEDTA、0.1% (V/V)SDS所配成，pH8.0。
6.根據權利要求1或5所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，在上述步驟c中，所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25: 24:1。
7.根據權利要求1或5所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，在上述步驟d中，所述醋酸鈉的濃度為3M，無水乙醇為-20°C預冷。
8.根據權利要求1或5所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，所得土壤線蟲DNA要用70%乙醇洗滌1-2次。
9.根據權利要求1或5所述的土壤線蟲群落基因組提取方法，其特徵在於，所得土壤線蟲DNA自然風乾後將其溶於無菌雙蒸水中並於-20°C下保存備用。
【文檔編號】C12N15/10GK103898095SQ201410104236
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】馮紀年, 陳菲菲, 李文海, 張金龍 申請人:西北農林科技大學