一種槐耳多糖蛋白及其製備方法和用途

2023-10-26 03:34:42

一種槐耳多糖蛋白及其製備方法和用途
【專利摘要】本發明涉及一種槐耳多糖蛋白及其製備方法和用途，本發明的槐耳多糖蛋白的單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其質量比為8.9：1.6：3.4：7.4：1.3，該多糖蛋白的重均分子量為7.0×105-2.0×106Da，優選為1.41×106Da。本發明的多糖蛋白可以用於製備治療腫瘤的藥物。
【專利說明】一種槐耳多糖蛋白及其製備方法和用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種槐耳多糖蛋白及其製備方法和用途。

【背景技術】
[0002] 槐耳為多孔菌科真菌槐栓菌（Trametes robiniophila Murr.)的子實體，是一種 重要的民間藥用真菌，在中國具有1600餘年的用藥歷史。Ainsworth真菌分類系統將其歸 屬於真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、多孔菌科、栓菌屬。槐耳子實體中等至較大，木栓質，無菌 柄，生於槐、刺槐等闊葉樹的樹幹上，分布於河北、陝西、遼寧、湖南、廣西、福建等地，是一種 可以導致樹木心材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平無毒，有"治風"、"破血"、"益力"的 功效，臨床上用於治療多種疾病。由於老齡中國槐日益稀少，槐耳藥材資源瀕於枯竭，難以 滿足臨床用藥需求，更無法滿足工業化生產需求。為了解決槐耳的資源問題，啟東蓋天力藥 業有限公司經過長期的研究和實踐，攻克了槐耳菌絲體大規模發酵難題，實現了菌絲體的 工業化生產，並以槐耳菌質(槐耳菌絲體發酵物）提取物為原料開發了槐耳顆粒和槐杞黃顆 粒等藥品，滿足了臨床用藥需求。
[0003] 近年來大量的化學成分及藥理活性研究資料證實槐耳菌質提取物的有效成分為 槐耳多糖蛋白，其主要功效是治療或輔助治療腫瘤性疾病。然而，目前對於槐耳多糖蛋白的 組成、結構及其製備方法研究很少，在化學成分研究方面僅有粗多糖的單糖組成及比例分 析的文獻報導，缺乏對其均一多糖的分離純化和結構研究，如均一多糖蛋白所含的糖殘基 種類、比例、在主鏈中的排列次序等信息，而這些信息對於闡明槐耳菌質真正的藥效成分、 槐耳多糖蛋白的作用機制及構效關係等至關重要。同樣在槐耳多糖蛋白的生物活性研究方 面，多以粗多糖作為研究對象，缺乏應用均一多糖組分獲得的體內、體外藥理學研究數據， 從而無法深入了解槐耳多糖蛋白與人體免疫細胞或腫瘤細胞表面相關多糖受體的作用過 程，因而無法深入的闡明其作用原理。


【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的缺陷，本發明提供一種槐耳多糖蛋白及其製備方法和用途。
[0005] 本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的。
[0006] -方面，本發明提供一種槐耳多糖蛋白，該多糖蛋白的單糖組成為阿拉伯糖、半乳 糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其質量比為8. 9 :1. 6 :3. 4 :7. 4 :1. 3。
[0007] 優選地，所述多糖蛋白的重均分子量為7. OX 105-2. OX 106Da，優選為 1. 41X106Da。
[0008] 優選地，該多糖蛋白的製備方法包括如下步驟：
[0009] (1)將濃度為2%-20% (質量/體積)，優選為8% (質量/體積）的槐耳菌質提取物 (例如槐耳清膏）水溶液採用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分；
[0010] (2)將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為75%-80% (體 積)，優選為80% (體積）的糖溶液，離心，得到沉澱物；
[0011] (3)將步驟（2)得到的沉澱物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內部分；以及
[0012] (4)使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內部分進行分離，其中使用的洗脫 液為〇. 85Mol/L-l. 5Mol/L的NaCl水溶液，優選為1. ΟΜοΙ/L的NaCl水溶液。
[0013] 優選地，所述多糖蛋白的製備方法還包括對NaCl水溶液洗脫得到的產品進行透 析除鹽的步驟。
[0014] 優選地，所述多糖蛋白的製備方法還包括採用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對 透析除鹽後的產品進行分離純化的步驟。
[0015] 另一方面，本發明提供一種上述多糖蛋白的製備方法，該製備方法包括如下步 驟：
[0016] (1)將濃度為2%-20% (質量/體積)，優選為8% (質量/體積）的槐耳菌質提取物 (例如槐耳清膏）水溶液採用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分；
[0017] (2)將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為75%_80% (體 積)，優選為80% (體積）的糖溶液，離心，得到沉澱物；
[0018] (3)將步驟（2)得到的沉澱物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內部分；以及
[0019] (4)使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內部分進行分離，其中使用的洗脫 液為0. 85Mol/L-l. 5Mol/L的NaCl水溶液，優選為1. ΟΜοΙ/L的NaCl水溶液，即得。
[0020] 優選地，所述製備方法還包括對NaCl水溶液洗脫得到的產品進行透析除鹽的步 驟。
[0021] 優選地，所述製備方法還包括採用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對透析除鹽後 的產品進行分離純化的步驟。
[0022] 在一個具體實施方案中，所述製備方法包括如下步驟：
[0023] ( 1)準確稱取槐耳菌質提取物槐耳清膏300g，加入適量蒸餾水將其稀釋為濃度約 為8% (質量/體積）的稀溶液，之後採用Sevage法去除游離蛋白，重複操作5次，收集糖類 部分；
[0024] (2)向步驟（1)得到的槐耳菌質糖類部分中緩緩加入無水乙醇使其成為醇濃度為 80% (體積)的糖溶液，4°C靜置24小時後，以3000轉/分鐘的速度離心10分鐘，沉澱，得到 沉澱物；
[0025] (3)稱取適量步驟（2)得到的沉澱物，將其溶解於150ml蒸餾水中，過濾，減壓濃縮 至體積50ml;透析收集袋內部分，以及
[0026] (4)使用DEAE-52離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內部分進行分離，採用 1. 0M NaCl水溶液進行洗脫，洗脫部分在濃縮後進行透析除鹽，透析過程為對流水透析三 天，蒸餾水透析兩天；以及
[0027] (5)採用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對步驟（4)得到的產品進行分離純化，直 至高效液相色譜法檢測為純品為止。
[0028] 又一方面，本發明提供上述多糖蛋白在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
[0029] 與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果：
[0030] 本發明首次採用系統的水提取、醇沉澱、去蛋白、透析小分子、離子交換色譜及凝 膠分子量排阻色譜分離的手段從槐耳菌質中分離獲得了一個均一的多糖蛋白組分，並綜合 應用分子量分析、單糖組成及胺基酸組成分析、紅外光譜分析及甲基化分析等手段，對其進 行了化學結構特點的確認，明確了其重均分子量、單糖組成及比例、胺基酸組成及比例，以 及所含糖殘基的連接方式。這樣一個結構特點明晰、分子量均一的槐耳菌質多糖組分，是研 究槐耳多糖有效成分及其生物活性的理想分子模型，為闡明槐耳多糖的免疫調節及抗腫瘤 的有效成分及其作用機制奠定了基礎，本發明將為槐耳菌質進一步開發利用和相關製劑的 質量控制提供科學依據。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0032] 圖1為槐耳菌質提取物槐耳清膏分級醇沉澱流程圖；
[0033] 圖2為槐耳菌質提取物槐耳清膏80%乙醇沉澱部位TCP-80柱色譜純
[0034] 化流程圖；
[0035] 圖3為槐耳多糖蛋白TP-4分子量（Mw)測定標準曲線；
[0036] 圖4為槐耳多糖蛋白TP-4單糖組分分析中對照品溶液的離子色譜圖；
[0037] 圖5為槐耳多糖蛋白TP-4的超高效液相-凝膠色譜（UPLC-GPC)圖譜；
[0038] 圖6為槐耳多糖蛋白TP-4單糖組成分析離子色譜圖；
[0039] 圖7為3H_TdR摻入法檢測小鼠脾細胞增殖，其中，TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋 白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多糖蛋白-3 ;TP-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;Τ〇-1 :槐耳 低分子量組分-1 ;T〇-2 :槐耳低分子量組分-2 ;T〇-3 :槐耳低分子量組分-3 ;T〇-4 :槐耳低 分子量組分-4 ;TFP :槐耳粗總游離蛋白部分；
[0040] 圖8為3H-TdR摻入法檢測小鼠 T、B淋巴細胞增殖，其中，圖A為⑶19+細胞；圖B 為⑶3+細胞；圖C為小鼠 T淋巴細胞；圖D為小鼠 B淋巴細胞；Dex :葡聚糖；TCP :粗多糖； TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多糖蛋白-3 ;TP-4 :槐耳多糖 蛋白-4 ;LPS :脂多糖；
[0041] 圖9為槐耳多糖刺激後小鼠及人T、B淋巴細胞比例變化，其中，圖A為小鼠 T淋巴 細胞；圖B為小鼠 B淋巴細胞；圖C為人類T淋巴細胞；圖D為人類B淋巴細胞；Dex :葡聚 糖（Dextran) ;TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多 糖蛋白-3 ;ΤΡ-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;LPS :脂多糖；
[0042] 圖10為槐耳多糖刺激後T、B淋巴細胞表面⑶69的表達，圖A為槐耳多糖刺激後T 淋巴細胞表面⑶69的表達，圖B為槐耳多糖刺激後B淋巴細胞表面⑶69的表達，其中Dex : 葡聚糖（Dextran) ;TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐 耳多糖蛋白-3 ;ΤΡ-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;LPS :脂多糖；
[0043] 圖11為槐耳多糖刺激後小鼠腹腔巨噬細胞N0釋放變化，其中Dex :葡聚糖 (Dextran) ;TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多 糖蛋白-3 ;ΤΡ-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;Τ〇-1 :槐耳低分子量組分-1 ;Τ〇-2 :槐耳低分子量組 分-2 ;Τ〇-3 :槐耳低分子量組分-3 ;Τ〇-4 :槐耳低分子量組分-4 ;TFP :槐耳粗總游離蛋白部 分；LPS :脂多糖；
[0044] 圖12槐耳多糖蛋白對腫瘤血管形成內皮細胞增值的抑制作用，其中TP-4 :槐耳多 糖蛋白-4。

【具體實施方式】
[0045] 下面通過實施例詳細說明本發明，應當理解，下述實施例僅用於說明本發明，而不 以任何方式限制本發明的範圍。
[0046] 實施例1 :槐耳多糖蛋白（TP-4)的分離純化方法
[0047] 準確稱取槐耳菌質提取物槐耳清膏（由啟東蓋天力藥業有限公司提供)300g，加入 適量蒸餾水將其稀釋為濃度約為8% (質量/體積）的稀溶液，之後採用Sevage法去游離蛋 白，重複操作5次，分別收集糖類部分（TCP)及槐耳粗總游離蛋白部分（TFP)，槐耳粗總游離 蛋白部分真空乾燥備用，槐耳菌質糖類物質部分（TCP)在減壓濃縮去除殘存的氯仿及正丁 醇後，進行分級醇沉澱。首先向TCP中緩緩加入無水乙醇使其成為醇體積濃度為40% (體 積）的糖溶液，4°C靜置24小時後，3000轉/分鐘離心10分鐘，沉澱編號為TCP-40,減壓幹 燥以備進一步分離純化，之後向上清液中繼續加入適量無水乙醇使其成為含醇60% (體積） 的糖溶液，4°C靜置24小時後，3000轉/分鐘，離心10分鐘，沉澱編號為TCP-60,減壓乾燥 以備進一步分離純化，在此之後繼續向上清液中加入適量無水乙醇至乙醇濃度達到80%(體 積)，4°C靜置24小時後，3000轉/分鐘離心10分鐘，沉澱編號為TCP-80,減壓乾燥以備進 一步分離純化，具體分級醇沉澱流程圖見圖1。
[0048] 稱取適量的槐耳清膏40 % (體積）乙醇沉澱部位TCP-40,將其溶解於150ml蒸餾 水中，過濾，減壓濃縮至體積50ml，透析收集袋內部分及袋外部分，袋外部分為槐耳低分子 量組分-1 (T0-1)，袋內部分通過DEAE-52離子交換柱色譜分離，分別採用蒸餾水及0. 1M NaCl溶液、0. 5M NaCl洗脫，每個部位收集3. 0L，水洗脫部分直接濃縮至幹，氯化鈉洗脫部 分均在濃縮後進行透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析兩天。然後各段分別 採用S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進行分離純化，直至高效液相色譜法檢測為純品為止， 經過上述柱色譜分離過程，分別從TCP-40離子交換柱色譜0. IMol/L NaCl洗脫部位純化獲 得了 UPLC (超高效液相色譜）驗證為均一組分的多糖蛋白TP-1 (397mg)以及從0. 5Mol/L NaCl洗脫部位獲得了均一多糖蛋白TP-2 (1212mg)，分離流程圖見圖2。
[0049] 稱取適量的槐耳清膏60% (體積）乙醇沉澱部位TCP-60,將其溶解於150ml蒸 餾水中，過濾，經減壓濃縮至體積50ml，透析收集袋內部分及袋外部分，袋外部分為槐耳低 分子量組分-2 (T0-2)，袋內部分通過DEAE-52離子交換柱色譜分離，分別採用蒸餾水及 1. OMol/LNaCl溶液洗脫，每個部位收集3. 0L，水洗脫部分直接濃縮至幹，氯化鈉洗脫部分 均在濃縮後進行透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析兩天。然後各段分別採 用S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進行分離純化，直至高效液相色譜法檢測為純品為止，經 過上述柱色譜分離過程，分別從TCP-60離子交換柱色譜1. 0M〇l/L NaCl洗脫部位純化獲得 了 UPLC (超高效液相色譜）驗證為均一組分的多糖蛋白TP-3 (12. lg)。
[0050] 稱取適量的槐耳清膏80% (體積）乙醇沉澱部位TCP-80,將其溶解於150ml蒸 餾水中，過濾，減壓濃縮至體積50ml，透析收集袋內部分及袋外部分，袋外部分為槐耳低 分子量組分-3 (T0-3)，袋內部分通過DEAE-52離子交換柱色譜分離，分別採用蒸餾水及 1. 0Mol/L NaCl水洗脫，每個部位收集3. 0L，水洗脫部分直接濃縮至幹，氯化鈉洗脫部分均 在濃縮後進行透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析兩天。然後各段分別採用 S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進行分離純化，直至高效液相色譜法檢測為純品為止，經過 上述柱色譜分離過程，分別從TCP-80離子交換柱色譜1. OMol/LNaCl洗脫部位純化獲得了 UPLC (超高效液相色譜)驗證為均一組分的多糖蛋白TP-4 (10. Og)，收集槐耳清膏80% (體 積）乙醇沉澱上清液部分得槐耳低分子量組分-4 (T0-4)(圖2)。
[0051] 實施例2 :槐耳多糖蛋白（TP-4)化學結構的研究
[0052] 本實施例研究了實施例1製備的槐耳多糖蛋白TP-4的化學結構。
[0053] -、槐耳多糖蛋白（TP-4)化學結構研究方法
[0054] 1、純度及分子量的測定
[0055] 超高效液相-凝膠色譜-蒸發光散射檢測器（UPLC-GPC-ELSD)儀器配置及色譜條 件：美國Waters UPLC，TSK-3000GPC色譜柱，自動進樣器，Millipore超純水離子交換器制 備高純水（0. 45 μ m醋酸纖維素膜過濾）；流速0. 3ml/min。
[0056] 標準曲線的製備：分別稱取適量的右旋糖苷標準品，加入去離子水，將其配置成濃 度0. 5mg/ml的對照品溶液，之後逐一進行UPLC檢測，結果見圖3。
[0057] 樣品溶液製備：分別稱取一定量的實施例1製備的多糖蛋白TP-4,加入適量去離 子水，將其配製成濃度為lmg/ml的溶液，MilliporeO. 22μηι水系濾膜過濾，進樣檢測。
[0058] 2、單糖組成分析
[0059] 完全酸水解：精密稱取實施例1製備的多糖蛋白TP_4(10mg)放入厚壁耐壓瓶中， 加入4ml的2Mol/L三氟乙酸（TFA)，充氮氣，封管後，100°C水解2小時，減壓蒸乾。
[0060] 樣品的離子色譜分析
[0061] 儀器配置及色譜條件：Dionex ICS3000型離子色譜，CarboPac PA20分析柱， 150X3mm，S/N002823, CarboPac PA20 保護柱，50*3mm，S/N002652,淋洗液組成及流速 l-25min,lm Mol/L Κ0Η ；25.l-32min,30mMol/L Κ0Η, ；32.l-35min,lm Mol/L Κ0Η ；0. 45mL/ min,進樣 10 μ L〇
[0062] 對照品溶液的製備：取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖對照品適量，用去 離子水溶解成各含10. 〇mg/L的對照品溶液，搖勻，即得。
[0063] 標準曲線製備：精密吸取對照品混合貯備液適量，分別用去離子水將其稀釋成 0· 5mg/L、lmg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L的標準溶液，0· 45 μ m微孔濾膜過濾後，依次進 行離子色譜測定，離子色譜條件為：Dionex ICS3000型離子色譜，CarboPac PA20分析 柱，150X3mm，S/N002823, CarboPacPA20 保護柱，50*3mm，S/N002652,淋洗液組成及流速 l-25min,lm Mol/LKOH ；25. l-32min,30m Mol/L Κ0Η, ；32. l-35min,lm Mol/L Κ0Η ；0.45mL/ min，進樣10 μ L。以峰面積積分值為縱坐標（Y)、以各標準品濃度為橫坐標（X)，繪製各對照 品標準曲線並計算回歸方程，結果見表1和圖4。
[0064] 表1線性關係考察結果
[0065]

【權利要求】
1. 一種槐耳多糖蛋白，該多糖蛋白的單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘 露糖，其質量比為8. 9 :L 6 :3. 4 :7. 4 :L 3。
2. 根據權利要求1所述的多糖蛋白，其特徵在於，所述多糖蛋白的重均分子量為 7· Ο X 105-2· Ο X 106Da，優選為 1. 41 X 106Da。
3. 根據權利要求1或2所述的多糖蛋白，其特徵在於，該多糖蛋白的製備方法包括如下 步驟： (1) 將濃度為2%-20% (質量/體積)，優選為8% (質量/體積）的槐耳菌質提取物水溶 液採用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分； (2) 將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為75%-80% (體積)， 優選為80% (體積）的糖溶液，離心，得到沉澱物； (3) 將步驟（2)得到的沉澱物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內部分；以及 (4) 使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內部分進行分離，其中使用的洗脫液為 0· 85mol/L_l· 5mol/L 的 NaCl 水溶液，優選為 1. Omol/L 的 NaCl 水溶液。
4. 根據權利要求3所述的多糖蛋白，其特徵在於，所述多糖蛋白的製備方法還包括對 NaCl水溶液洗脫得到的產品進行透析除鹽的步驟。
5. 根據權利要求4所述的多糖蛋白，其特徵在於，所述多糖蛋白的製備方法還包括採 用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對透析除鹽後的產品進行分離純化的步驟。
6. -種權利要求1至5中任一項所述的多糖蛋白的製備方法，該製備方法包括如下步 驟： (1) 將濃度為2%-20% (質量/體積)，優選為8% (質量/體積）的槐耳菌質提取物水溶 液採用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分； (2) 將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為75%-80% (體積)， 優選為80% (體積）的溶液，離心，得到沉澱物； (3) 將步驟（2)得到的沉澱物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內部分；以及 (4) 使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內部分進行分離，其中使用的洗脫液為 0. 85mol/L-l. 5mol/L的NaCl水溶液，優選為1. Omol/L的NaCl水溶液，即得。
7. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法還包括對NaCl水溶液 洗脫得到的產品進行透析除鹽的步驟。
8. 根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法還包括採用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對透析除鹽後的產品進行分離純化的步驟。
9. 根據權利要求5至7中任一項所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括如下 步驟： (1) 準確稱取槐耳菌質提取物槐耳清膏300g，加入適量蒸餾水將其稀釋為濃度約為8% (質量/體積）的稀溶液，之後採用Sevage法去除游離蛋白，重複操作5次，收集糖類部分； (2) 向步驟（1)得到的槐耳菌質糖類部分中緩緩加入無水乙醇使其成為醇濃度為80% (體積)的糖溶液，4°C靜置24小時後，以3000轉/分鐘的速度離心10分鐘，沉澱，得到沉澱 物； (3) 稱取適量步驟（2)得到的沉澱物，將其溶解於150ml蒸餾水中，過濾，減壓濃縮至體 積50ml;透析收集袋內部分，以及 (4) 使用DEAE-52離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內部分進行分離，採用 1. Omol/L NaCl溶液進行洗脫，洗脫部分在濃縮後進行透析除鹽，透析過程為對流水透析三 天，蒸餾水透析兩天；以及 (5) 採用S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對步驟（4)得到的產品進行分離純化，直至高 效液相色譜法檢測為純品為止。
10.權利要求1至6中任一項所述的多糖蛋白在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
【文檔編號】C07K1/36GK104119428SQ201310145185
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優先權日:2013年4月24日
【發明者】徐無為, 陸正鑫 申請人:啟東蓋天力藥業有限公司