基於基因沉默技術的灰飛蝨致死基因片段RibosomalproteinL9-B及其dsRNA的製作方法

2023-10-25 12:11:32

專利名稱：基於基因沉默技術的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B及其dsRNA的製作方法
技術領域：
本發 明屬於農業生物技術領域，涉及基於基因沉默技術的灰飛蝨致死基因片段 Ribosomal protein L9-B 及其 dsRNA。
背景技術：
在我國，化學藥劑連續單一長期使用已導致灰飛蝨對多種農藥產生了不同程度的抗性，需要不斷加大農藥使用量才能達到滿意的防治效果，造成了更為嚴重的環境汙染，形成惡性循環。另外灰飛蝨傳播條紋病毒引起的水稻條紋葉枯病，發病後藥劑控制效果較差， 只能依靠治蟲防病。因此，在農業生產實踐中，急需化學農藥之外的替代防治手段。RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結合，根據序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在於真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發現RNAi現象被授予諾貝爾醫學與生理獎。在生物體中，一些重要的基因對維持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA幹擾技術將農業害蟲中重要基因的表達進行幹擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達到控制害蟲的目的。本專利發明就是利用實驗室改進的dsRNA餵食法從灰飛蝨中篩選出經幹擾後能夠導致灰飛蝨死亡的重要基因，為建立利用RNA幹擾技術控制害蟲的新策略提供序列和數據基礎。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種灰飛蝨致死基因片段 Ribosomal protein L9-B 及其克隆方法。本發明的另一方法是提供該致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA及其合成方法。本發明的又一目的是提供一種用於篩選致死基因的dsRNA餵食法。本發明的目的可通過如下技術方案實現灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B，序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的克隆方法，包括如下步驟(1)取灰飛蝨，提取總RNA，以提取的灰飛蝨總RNA合成cDNA第一條鏈；(2)以步驟(1)合成的灰飛蝨cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID N0. 2的上遊引物P1、序列為SEQ ID N0. 3的下遊引物P2，進行RT-PCR擴增；(3) PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至pEASY_T3載體中，轉化到大腸桿菌Tl，塗於含有x-gal、IPTG以及氨苄青黴素的LB培養基，37°C培養，過夜；(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(6)用含氨苄青黴素的LB培養液將重組子擴增，提取克隆質粒；(7)全自動序列儀進行測序，得到SEQ ID NO. 1所示的Ribosomal protein L9-B 基因片段。其中，所述的RT-PCR擴增體系為反應緩衝液5μ L，Mg2+4y L，dNTP 4μ L，cDNA模板 2yL，上遊引物 Pl lyL，下遊引物 P2 1 μ L，R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L。灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA，序列如SEQ ID NO. 4所
不。 所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA的合成方法，是以灰飛蝨cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID N0. 5的上遊引物P3、序列為SEQ ID N0. 6 的下遊引物P4，PCR擴增得到灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA。所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA的合成方法優選包含如下步驟(1)根據已經驗證的Ribosomal protein L9-B基因片段序列，設計併合成序列為SEQ ID N0. 5的引物3和序列為SEQ ID N0. 6的引物4，以灰飛蝨cDNA第一條鏈為模板 PCR擴增得到灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA，PCR體系為反應緩衝液 5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上遊引物 Ρ3 2 μ L，下遊引物 P4 2 μ L， ExTap 酶 0· 25 μ L, ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ；PCR 反應程序為94°C變性 2min，94°C 30sec, 55-62°C 30sec,72°C 30sec，38 個循環，72°C延伸；(2)PCR產物經濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離；(3)回收目標DNA產物。一種灰飛蝨的dsRNA餵食方法，包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛蝨加入玻璃管內，用紗布將玻
璃管另一端封好；(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經準備好的封口膜， 貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養蟲室的養蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛蝨的趨光習性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。所述的dsRNA為所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA。有益效果利用RNAi技術沉默Ribosomal protein L9-B基因，對灰飛蝨具有明顯的致死效果，說明該基因可作為利用RNA幹擾技術控制害蟲的有效靶點。本發明合成的Ribosomal protein L9-B 基因 dsRNA 能有效沉默 Ribosomal protein L9-B基因更好地抵抗RNA酶的降解，同時合成成本較低，便於大量實驗使用。本發明採用餵食法進行RNAi幹擾實驗，相對注射法，減少了蟲體的機械損傷，更加便於實驗操作。最終通過餵食實驗驗證了 Ribosomal protein L9-B基因的RNAi對灰飛蝨具有致死效果，為建立利用RNA幹擾技術控制害蟲的新策略提供新的實驗手段。


圖 IdsRNA 合成電泳圖，泳道 IMarker,泳道 2 =Ribosomal protein L9-B 的 dsRNA。 圖2dsRNA餵食實驗致死率統計圖。
具體實施例方式實施例11. Ribosomal protein L9-B 基因片段的克隆方法(1)取灰飛蝨10-20頭，用TRIzoI法提取總RNA ；(2)合成cDNA第一條鏈；(3)從灰飛蝨轉錄組中獲取基因片段序列，在http://www.ncbi. nlm.nih.gov/進行同源性比對之後，預測為灰飛蝨Ribosomal protein L9-B基因，利用Primer premier 5. O軟體設計P 1和P 2，以RT-PCR方法進行擴增；上遊引物(Pl)5' TTCTAGCGAGTTTCCG 3' (SEQ ID NO. 2)，下遊引物(P2)5' GCGATGCCCAGTATGT 3' (SEQ ID NO. 3)；PCR 反應程序為94°C變性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 個循環， 72°C延伸。PCR 反應體系(50 μ L)
反應緩衝液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上遊引物PlΙμ
下遊引物P 2Ιμ
R- Tag 酶0.5μ
ddH2032.5μ
總體積50μ (4) PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；(5)將回收的目標片段在Τ3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中，轉化到大腸桿菌Tl，塗於含x-gal 0. 02g/ml、IPTGO. 2g/ml以及氨苄青黴素50ng/ml的LB培養基，37°C 培養，過夜；(6)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(7)用含氨苄青黴素的LB培養液將重組子擴增，提取克隆質粒；(8)全自動序列儀進行測序(由上海生工生物工程技術服務有限公司完成)，即可得到SEQ IDNO. 1所示的核苷酸序列的Ribosomal protein L9-B基因片段。實施例2. dsRNA合成及回收(1)根據已經驗證的Ribosomal protein L9-B基因片段序列，採用 Primer Premier 5.0軟體設計P 3和P 4，在上下遊引物5』端加入T7啟動子序列 TAATACGACTCACTATAGGG ；上遊引物(P4) 5 『 TAATACGACTCACTATAGGGTTCTAGCGAGTTTCCG 3' (SEQ ID N0. 5)上遊引物(P5) 5 『 TAATACGACTCACTATAGGGGCGATGCCCAGTATGT 3' (SEQ ID N0. 6)
反應緩衝液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上遊引物P 32μL
下遊引物P 42μL
Ex Tap 酶0.25μ
ddH2030.75μ
總體積50μ PCR 反應程序94°C 變性 2min，94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 30sec，38 個循環， 72°C延伸。(2) PCR產物經濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離並在紫外燈下進行觀察， 結果見圖1，其序列見SEQ ID N0. 4。(3)採用 Promega 公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒進行回收①對分離得到的目標片段切膠，並放入稱量過重量(a)的1. 5ml微量離心管中，再次稱量(b)，b-a算得所切膠重；②根據膠重，每IOmg凝膠加入10 μ L Membrane Binding Solution。凝膠重量不超過350mg ；③將凝膠放入50_65°C水浴鍋中水浴IOmin或者直到凝膠完全融化；④將試劑盒中的濾管放置在配套的收集管中，轉移融化的凝膠液體至濾管中，室溫放置Imin ；⑤16，000 Xg (14，OOOrpm)離心lmin，棄去收集管中的液體；⑥力口入 700 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心lmin，棄去收集管中的液體；⑦力口入 500 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心5min，棄去收集管中的液體；
⑧不加液體空轉Imin ；⑨轉移 濾管到1. 5ml微量離心管中，加入50 μ 1 Nuclease-Free Water，室溫放置 Imin, 16，000 Xg (14，OOOrpm)離心 Imin ；⑩收集到的DNA產物保存在4°C或_20°C。
實施例3. dsRNA餵食實驗(1)將玻璃管的一端用封口膜封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛蝨加入玻璃管內，用紗布將另一端封好；(2)將蟲子輕輕用手拍打至一端，將另一端的紗布取下，將已經準備好的封口膜貼紙的一面朝上，均勻用力向兩側拉，拉成正方形，然後蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置在超淨檯面上；(3)用移液槍吸取飼料100 μ 1滴在封口膜的中央，對照只加飼料(配方見表1)， 處理組在飼料中加入Ribosomal protein L9-B基因的dsRNA，dsRNA的濃度為3875ng/μ 1， 用一個新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養蟲室的養蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛蝨的趨光習性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次飼料和dsRNA ；(5)連續餵食五天，每24h統計一次死亡率，結果見圖2，由圖2可見餵食致死基因 Ribosomal protein L9-B的dsRNA能夠達到較好的致死效果。表權利要求
1.灰飛蝨致死基因片段Ribosomalprotein L9-B，其特徵在於序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.權利要求1所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的克隆方法，其特徵在於包括如下步驟(1)取灰飛蝨，提取總RNA，以提取的灰飛蝨總RNA合成cDNA第一條鏈；(2)以步驟(1)合成的灰飛蝨cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQID NO. 2的上遊引物Pl、序列為SEQ ID NO. 3的下遊引物P2進行RT-PCR擴增；(3)PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中，轉化到大腸桿菌Tl，塗於含有X-gal、IPTG以及氨苄青黴素的LB培養基，37°C培養，過夜；(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(6)用含氨苄青黴素的LB培養液將重組子擴增，提取克隆質粒；(7)全自動序列儀進行測序，得到SEQID NO. 1所示的Ribosomal protein L9-B基因片段。
3.根據權利要求2所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的克隆方法， 其特徵在於所述的RT-PCR擴增體系為反應緩衝液5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA模板 2 μ L，上遊引物 1 μ L，下遊引物 IyL, R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L ；PCR 反應程序為94°C變性 2min，94°C 30sec，55_62°C 30sec,72°C 30sec，38 個循環，72°C延伸。
4.權利要求1所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的dsRNA，其特徵在於序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.權利要求4所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的dsRNA的合成方法，其特徵在於以灰飛蝨cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID NO. 5的上遊引物P3、 序列為SEQ ID NO. 6的下遊引物P4PCR擴增得到灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B 的 dsRNA。
6.根據權利要求5所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomalprotein L9-B的dsRNA的合成方法，其特徵在於包含如下步驟(1)根據已經驗證的Ribosomalprotein L9-B基因片段序列，設計併合成序列為SEQ ID NO. 5的P3和序列為SEQ ID NO. 6的P4，以灰飛蝨cDNA第一條鏈為模板PCR擴增得到灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA，PCR體系為反應緩衝液5 μ L， Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上遊引物 2 μ L，下遊引物 2 μ L，Ex Tap 酶 0. 25 μ L， ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ;PCR 反應程序為94°C 變性 2min，94°C 30sec，55-62 °C 30sec, 72°C 30sec，38 個循環，72°C延伸；(2)PCR產物經濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離；(3)回收目標DNA產物。
7.一種灰飛蝨的dsRNA餵食方法，其特徵在於包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛蝨加入玻璃管內，用紗布將玻璃管另一端封好；(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經準備好的封口膜，貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養蟲室的養蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛蝨的趨光習性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。
8.根據權利要求7所述的dsRNA餵食方法，其特徵在於所述的dsRNA為權利要求4所述的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B的dsRNA。
全文摘要
本發明屬於農業生物技術領域，涉及基於基因沉默技術的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B及其dsRNA。本專利發明就是利用實驗室改進的dsRNA餵食法從灰飛蝨中篩選出經幹擾後能夠導致灰飛蝨死亡的序列如SEQ ID NO.1所示的灰飛蝨致死基因片段Ribosomal protein L9-B，利用該基因片段的dsRNA餵養灰飛蝨，具有很好的致死效果，為建立利用RNA幹擾技術控制害蟲的新策略提供序列和數據基礎。
文檔編號C12N15/113GK102220339SQ20111012277
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者姜衛華, 李國清, 李飛, 董雙林, 韓召軍 申請人:南京農業大學