Dna過氧化物酶及其製備方法、用途的製作方法

2023-10-25 15:10:12

專利名稱：Dna過氧化物酶及其製備方法、用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶學領域，具體地說是一種二重複單元DNA G-四鏈體-血紅素DNA過氧化物酶及其製備方法、用途。
背景技術：
眾所周知，酶是具有催化功能的生物大分子，它的特點是具有高度的專一性和很高催化活性。過去人們以為酶只能由蛋白質組成，但1981年T.R. Cech等發現了核酸也具有催化反應的能力，提出了核酶的概念。1994年R. R. Breaker證明了 DNA也具有酶的活性。1996年Dipankar Sen課題組發現了 DNA過氧化物酶,它不僅能夠催化核酸鏈上的反應，還能像普通催化劑那樣參與催化氧化反應。目前發現了各種各樣的DNA過氧化酶具有不同的催化活性。DNA過氧化物酶能夠氧化顯色底物發生顏色的變化，在分析檢測不同類型的靶分子中表現出十分優良的特性。首先，與蛋白質構成的酶相比，DNA過氧化物酶穩定性更高，而且DNA的合成與純化過程遠比蛋白質容易得多，最重要的是在操作過程中不容易失活；其次，DNA過氧化物酶的獲得比較方便，只需將DNA片段在適當的條件下與Hemin (血紅素)混勻即可。

隨著對DNA過氧化物酶深入研究，人們發現能形成G-四鏈體的核酸序列就有可能存在DNA過氧化物酶活性。2009年Chengde Mao課題組發現很多物種的端粒DNA序列與Hemin結合後可以具有DNA過氧化物酶的活性，其中也包括了能夠形成G-四鏈體的人類端粒DNA (TTAGGG)n序列。首先DNA G-四鏈體-Hemin DNA過氧化物酶能夠催化H2O2氧化ABTS2.生成綠色ABTS'可作為一種新型的顏色反應標籤應用於檢測之中。其次DNA G-四鏈體-Hemin DNA過氧化物酶具有酶的活性，能夠放大反應信號，從而提高檢測的靈敏度。研究表明85%以上的腫瘤細胞中端粒酶表達呈陽性，而正常細胞中幾乎檢測不到端粒酶，這說明端粒酶與細胞的惡性轉化及維持分裂增殖具有密切的關係。端粒DNA G-四鏈體結構的形成能夠有效地抑制端粒酶的活性，因而靶向端粒DNA G-四鏈體並使其穩定的配體成為抗癌藥物研究的新方向。在G-四鏈體穩定劑類抗癌藥物的開發過程中，建立一種既簡便又快速的藥物大批量篩選方法是必不可少的。G-四鏈體可以與Hemin結合而顯示出較強的酶活性，並且文獻報導，Hemin主要作用於G-四鏈體末端的G-四分體上；G_四鏈體穩定劑也需要與G-四鏈體結合而對該結構起到穩定作用，若兩者在G-四鏈體的結合位點相同或相接近，G-四鏈體穩定劑與G-四鏈體結合有可能有效的阻礙Hemin與G-四鏈體結合，導致體系中酶的催化活性降低，並且文獻報導，G-四鏈體穩定劑也主要堆積在G-四鏈體末端的G-四分體上。利用體系中信號強度隨時間的變化關係，比較不同藥物與G-四鏈體的作用能力，可實現G-四鏈體穩定劑類抗癌藥物的大批量篩選。但過去研究的都是單體DNA G-四鏈體穩定劑，這些單體DNA G-四鏈體一般由21-26個鹼基組成，然而3』末端單鏈人類端粒DNA實際上由100-200鹼基組成，很多研究表明其能夠形成連續的多重複單元DNA G-四鏈體。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有的技術不足，提供一種二重複單元DNA G-四鏈體-血紅素DNA過氧化物酶，具有更高的催化活性，從而在檢測中可以擴大反應信號，提高檢測靈敏度，降低最低檢測下限的範圍，可以實現多重複單元DNA G-四鏈體穩定劑類抗癌藥物的大批量篩選及高靈敏度的分析檢測不同類型的靶分子，利用二重複單元DNA G-四鏈體-Hemin DNA過氧化物酶比較出了不同配體與二重複單元DNA G-四鏈體的結合能力。本發明解決上述技術問題採用的技術方案是一種DNA過氧化物酶，其特徵是其分子結構如下述通式(I ):
權利要求
1.一種DNA過氧化物酶，其特徵是其分子結構如下述通式(I ):
2.一種製備權利要求1所述DNA過氧化物酶的方法，其特徵是包括下列步驟 (1)試劑和緩衝液 血紅素溶解於二甲基亞碸中製備成血紅素溶液，2 8°C保存； 用去離子水配製氯化鉀溶液； 用去離子水配製PH值為7. O 8. OTris-HCl緩衝液； (2)T8 DNA的預處理 固體樣品T8 DNA在4 °C經離心機以12000 r .mirf1高速離心5 10 min,並在一20°C保存，使用前用去離子水配製成T8 DNA溶液，4°C保存,3天內使用； (3)二重複單元DNA G-四鏈體的製備 取步驟(2)配製的T8 DNA溶液放入到5ml離心管中，加入步驟(I)配製的氯化鉀溶液、Tris-HCl緩衝溶液，使T8 DNA處於含KCl濃度100mM、含Tris-HCl濃度25mM、pH值為7. O 8. O的溶液中，混均，在90°C水浴鍋中加熱5 lOmin，緩慢冷卻至室溫； (4)二重複單元DNA G-四鏈體-血紅素DNA過氧化物酶的製備 在步驟(3)的離心管中加入步驟(I)配製的血紅素溶液，輕輕搖晃使其混均，靜置2 3h。
3.一種如權利要求1所述DNA過氧化物酶，其特徵是作為大批量篩選多重複單元DNAG-四鏈體穩定劑類抗癌藥物及高靈敏度的分析檢測不同類型靶分子的應用。
全文摘要
本發明涉及一種酶學領域，具體地說是一種DNA過氧化物酶，其分子結構如下述通式(Ⅰ)(Ⅰ)，本發明二重複單元DNAG-四鏈體-血紅素DNA過氧化物酶具有更高的催化活性，從而在檢測中可以擴大反應信號，提高檢測靈敏度，降低最低檢測下限的範圍，可以實現多重複單元DNAG-四鏈體穩定劑類抗癌藥物的大批量篩選及高靈敏度的分析檢測不同類型的靶分子，利用二重複單元DNAG-四鏈體-血紅素DNA過氧化物酶比較出了不同配體與二重複單元DNAG-四鏈體的結合能力。
文檔編號C12Q1/28GK103060282SQ201210582990
公開日2013年4月24日 申請日期2013年2月25日 優先權日2013年2月25日
發明者趙豔, 高丹丹 申請人:威海東寶製藥有限公司