一種含金膠敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件的製作方法

2023-10-25 11:06:37 1

專利名稱：一種含金膠敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種含金膠敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，該 梅毒診斷器件是基於抗原/抗體特異性反應來診斷梅毒抗原的專用微 流控晶片，屬於分析測試領域。
背景技術：
梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋體(T. pallidum, TP)引起的一種性傳 播疾病(Sexually transmitted disease, STD)。在自然情況下梅毒螺旋 體只感染人類，人是梅毒唯一傳染源，主要通過性接觸傳播。另也可 通過胎盤垂直傳播，引起胎兒先天性梅毒。少數人也可經輸血感染。 80年代以來，梅毒在我國再次死灰復燃,據全國性病控制中心統計，我 國梅毒發病率年增長率達52.7。/。，且先天性梅毒和神經梅毒發病率增 加明顯，在全球亦有逐漸上升的趨勢，梅毒不僅已經成為世界性的嚴 重社會和公共衛生問題，而且也是危害人群健康的主要疾病之一。因 此，選擇簡單、快速、高敏感性和特異性診斷方法和試劑，對梅毒早 期診斷，發現傳染源，控制梅毒傳播具有重要意義。
目前常用的梅毒診斷方法有病原學檢査、非梅毒螺旋體抗原血清 試驗、TP快速檢測試紙條、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)和聚合 酶鏈反應(PCR)等。病原學檢査的原理是取患者損害的滲出物或 淋巴結穿刺術得到的組織液，觀察螺旋體的特徵性形態和運動方式，在理論上對早期梅毒有較高的檢出率，但受到條件的制約(包括就診 用藥、高質量的螢光顯微鏡、試劑和技術等)也較多，因此實際檢出
率並不高。TP快速檢測試紙條雖克服了檢測時間長、試劑昂貴等缺 陷，但國內暫時未有詳細報導其靈敏性和特異性效果，因此不可用於 確診試驗。非梅毒螺旋體抗原血清試驗的原理是目前診斷梅毒常用的 血清學初篩試驗，在很多文獻中都提到非梅毒螺旋體抗原血清試驗雖 然簡易、快速、易於觀察結果，適合於大量人群的血清篩査，但敏感 性、特異性較差，有時會出現生物學假陽性和假陰性反應，容易造成 漏檢和誤檢，所以不適合用於一期梅毒、先天梅毒、神經梅毒的診斷。 TPHA雖然其敏感性和特異性高，主要被用於梅毒確診試驗，但對療 效觀察意義不大。PCR法是較新的診斷方法，它能對生殖器潰瘍進行 早期鑑別診斷，區分梅毒、生殖器皰疹及軟下疳。但當前診斷梅毒的 PCR仍存在引物的非特異性、對血清/全血等敏感性低等缺點。而且 當皮損開始癒合、分泌物減少、血清學試驗陽性反應時，採用PCR 方法就不合適。另外，PCR方法易受標本中的組織和細胞碎片等物質 抑制，導致PCR假陰性結果。所以PCR檢測不宜用作判愈。
TP快速檢測試紙條、非梅毒螺旋體抗原血清試驗、TPHA以及 PCR等檢測方法均屬於免疫分析。以上免疫分析本身有很強的選擇 性，對傳染病的早期診斷，判斷療效及預後等方面均有重要的意義。 然而重大傳染病的檢測非常複雜，傳統的免疫分析通常只針對單一抗 原進行檢測。由於一種診斷抗原可出現在不同致病菌，或不同診斷抗 原可在同一致病菌同時出現，因此，開展高效的多重免疫分析方法(SMIAs)，從生物相關性的角度真實地定性、定量反映各種致病菌
抗原的種類和數量，在早期預防和聯檢多種傳染病、判斷傳染病菌發 展程度、觀察和評價治療效果等方面都具有重要的醫學價值。
電化學免疫傳感器具有自動化程度高、廉價、易製備、快速靈敏 等獨特優勢，配合免疫反應的高效專一，非常適合構建重大傳染病多 重免疫分析檢測的分析儀。有"生命科學集成電路"之稱的微流控晶片
(lab-on-chip)是構建微型化、集成化的電化學免疫傳感器的理想技 術。微流控晶片技術是將採樣、預處理、加試劑、反應、分離、檢測 等集成在一塊微晶片上完成的一門前沿技術，具有分析速度快、信息 量大、試劑消耗少、汙染小、操作費用低、儀器使用簡便等優點。且 非常適合工業化生產。微流控技術代表著21世紀分析儀器走向微型 化、集成化的發展方向。構建適合於重大傳染病檢測的微流控安培檢 測晶片具有以下優勢(1)通過微加工技術很容易在晶片上集成多 個檢測通道和檢測電極，做到多目標物同時分析，技術可行性高。(2) 通過微流動注射技術，樣品在管路中流動保證了電極表面時刻更新， 較好克服了電極易被汙染，造成假陽性率高、結果平行性差等問題。
(3)微流控傳感器上管路直徑只有Mm級，反應池體積也只有IJL級， 分析時所需試劑用量極少，分析物到達電極表面的擴散距離短、因此 可以大大減少溫育時間，實現快速聯檢目標。(4)目前微流控傳感 器多基於光學檢測系統，儀器昂貴體積大，全集成很難，而且檢測成 本很高，限制了其推廣。而傳感器中採用電化學檢測，體積小、自動 化程度高、成本低。目前，在微流控晶片技術領域，利用梅毒多種特異性抗體來同時 檢測、快速診斷多種梅毒抗原的相關技術和方法尚未見報導。
實用新型內容
本實用新型所要解決的技術問題是，在微流控晶片技術這樣一個 總的技術框架內，研發出一種能夠利用梅毒多種特異性抗體來對多種 梅毒抗原進行同時檢測、快速診斷的專用微流控晶片。
本實用新型通過如下方案解決所述技術問題，該方案提供的裝置 是一種含金膠敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，所述器件是微流控芯 片，該微流控晶片的結構包括貼合裝設在一起的兩片板狀物，所述兩 片板狀物分別是微流控晶片的蓋片以及微流控晶片的基片，在所述兩 片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有毛細管通道，以及，四個微 儲液池，毛細管通道的一端經由歧管狀微通道分別與其中的三個微儲 液池聯通，毛細管通道的另一端與餘下的一個微儲液池聯通，以及， 依序分別裝設在所述毛細管通道內不同位置上的工作電極以及對電 極以及參比電極，所述工作電極由金屬電極以及貼附在所述金屬電極 上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構成，本案要點是，所述毛 細管通道的構造呈並聯構造，所述呈並聯構造的毛細管通道由四個微 小通道並聯構成，以及，所述工作電極的數量是四個，該四個工作電 極的裝設位置分別位於所述四個微小通道內，以及，該四個工作電極 其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體分別是對梅毒抗原能特異性 結合的四種梅毒抗體物質，該四種抗體物質分別是梅毒特異性抗體
TP0684、 TP0453、 TP0821及TP0319。所述金膠敏感膜是將殼聚糖金膠溶液與梅毒特異性抗體溶液充分混合均勻，並使其乾燥成膜而成。 所述金膠敏感膜中的梅毒特異性抗體均為辣根過氧化物酶或者葡糖 糖氧化酶標記的梅毒抗體，所述金膠敏感膜已包含為固定上述各梅毒 特異性抗體而引入其中的輔助性介質，所述輔助性介質例如殼聚糖、 醋酸纖維素、明膠其中的一種或它們的混合物。本案微流控晶片的結 構中涉及若干種電極，所述電極均為微小尺寸的電極，其中的每一個 電極的形狀均可以是任意選定的形狀，所述任意選定的形狀例如方片 形狀、矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。本案微流控晶片結構中涉及 若干個微儲液池，所述微儲液池是用於過渡性儲液的微池或微囊，其 中的每一個微儲液池的微型的內腔其形狀均可以是任意選定的形狀， 所述內腔形狀例如微型的圓柱形空腔狀、微型的方柱形空腔狀、微型 的橢圓形空腔狀或微型的球形空腔狀等等。本案裝置當然還可以進一 步包括一些附件，所述附件例如多道電化學工作站以及微流動泵等 等，所述多道電化學工作站的技術含義以及微流動泵的技術含義是公 知的。本案微流控晶片結構中涉及的各個工作電極以及對電極以及參 比電極等，可以分別經由相應的專用串線與所述多道電化學工作站的 相應接口進行聯接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電 化學工作站的各相應接口進行相互聯接的專用電纜。所述微流動泵專 用於驅動微量液體流動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所 述微儲液池聯通。
本案微流控晶片的具體實現路徑可以有多種，選其一詳解如下 一、高聚物(PC:聚碳酸酯)蓋片上化學鍍微金電極的製備1、 以石英/鉻板為光掩模，用選擇波長的紫外光作為光源對PC
蓋片表面的選擇性區域進行輻射。
2、 採用已二胺作為胺化劑，1-[3， - (N-N-二甲基胺)丙基]-3-
己基碳二亞胺鹽酸鹽為偶合劑對經過選擇性區域照射的PC蓋片進行 胺化反應。
3、 將經過選擇性區域胺化反應的PC蓋片浸入氯金酸中反應。
4、 用蒸餾水清洗以後，再將其浸入硼氫化鈉溶液中還原。
5、 用蒸餾水清洗以後，再將其浸入0.5mol/L的硫氰化鉀溶液中 超聲清洗30Min。
6、 將經過清洗的PC蓋片浸入含有金離子、絡合劑和還原劑甲 醛的鍍液中，於45-6(TC下反應1h。
7、 將鍍有微金電極的蓋片放入烘箱中退火處理約3h,即得到本 發明的高聚物多微金電極蓋片。其中微金電極長3mm，寬3mm，厚 度約為0.1mm。相互之間間距約為3mm。
二、帶有微通道的高聚物(PC:聚碳酸酯)基片的製作 1、製作單晶矽陽模
繪製晶片設計圖，圖形線條寬度約為25-100pm，採用高清晰激 光照排系統輸出在透明的膠片上，即得到光刻掩模。
通過化學氣相沉積法在基片表面上沉積一層氮化矽薄膜作為犧 牲層，在此基片上通過旋轉覆膜技術覆蓋一層光敏膠，於烘箱中60°C 處理15-20min;將光刻掩模覆蓋在基片上，通過暴光成像的原理將 光刻掩模上的圖像轉移到基片表面的光膠層上；通過幹法腐蝕的方法將光膠層上的平面二維圖形加工成具有一定深度的立體結構。即可得
到具有凸起的通道的單晶矽陽模。製備好的單晶矽陽模依次用H202: H2S04溶液(體積比為1: 4)，丙酮和蒸餾水清洗，以除去其表面 的氧化物。
2、 採用熱壓法複製微通道
將PC片切割成長約6cm，寬4cm的尺寸。超聲清洗，自然涼 幹，在熱壓裝置中將PC片加熱到軟化溫度(11CTC)左右，然後在 單晶矽陽模上施加一定的壓力，並持續約1min，即可在PC片壓制 出與單晶矽陽模互補的微通道。然後，將陽模和刻有微通道的PC基
片一起冷卻後脫模，就得到所需的微通道。
3、 在蓋片上製作微儲液池
在蓋片上使用金剛鑽鑽出試樣液池、緩衝液池、試樣廢液池和緩 衝廢液池等四個微儲液池。
三、 將高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片在低溫氧等離 子氣氛中處理乾淨。
四、 將包埋四種梅毒特異性抗體的金膠敏感膜分別貼合於對應的微金 工作電極上。
五、 晶片封合
在顯微鏡下對準高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基 片，將此基片和蓋片固定並用二片蓋玻片夾緊，放置在烘箱中於一定 溫度下保溫15min，即可得到所需的四通道微流控晶片。
六、 將步驟四所完成的PC片分別在工作電極、參考電極及對電極末端利用銀膠接上銅片作為導線，待銀膠完全乾後再封上熱熔膠以固定
銅片，即完成整個四通道微流控晶片的製作。
詳解的本案微流控晶片的上述具體實現路徑其相關各個操作參
數可以根據實際需要進行調整。 本案微流控晶片的使用方法
採用外加微泵驅動液流在四通道微流控晶片的毛細管通道中穩 定流動，利用四通道電化學分析儀器分別對四種梅毒診斷抗原加以檢
本案微流控晶片的具體檢測使用步驟如下
1、 在微管路中加入血清樣品液，在外加微泵驅動下，各種梅毒 抗原分子被各通道中電極表面上金膠敏感膜包埋的相應的辣根過氧 化物酶標記的梅毒特異性抗體捕獲。
2、 辣根過氧化物酶標記的梅毒特異性抗體與血清樣品中的梅毒 抗原形成免疫複合物。
3、 採用多通道電化學分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，採 用安培法檢測上述反應引起的電流變化，由此獲得各種分析物的種類 和含量。
4、 將結果進行綜合分析，對梅毒抗原進行綜合診斷。 本實用新型的優點是，在一塊物理器件即微流控晶片上集成了分
別包覆有四種梅毒特異性抗體物質的四個工作電極，該四個工作電極 分別針對檢測梅毒的四種特徵診斷抗原，本案微流控晶片是一種能夠 利用梅毒多種特異性抗體進行同時檢測的梅毒診斷專用微流控晶片，其集成構造的結構特點決定了該晶片的使用有助於加快梅毒診斷速
度、提高診斷準確率、降低梅毒診斷費用。


圖1是本案所述器件即微流控晶片的實施例構造示意圖，圖中包 括所述附件。
圖中，1是微流動泵，2、 4、 5、 14分別是四個裝設位置不同的 微儲液池，3是歧管狀微通道，6是微流控晶片的蓋片，7是微流控 晶片的基片，8是聯接工作電極與多道電化學工作站的專用串線，本 例圖中共顯示有四條同型的用於聯接工作電極與多道電化學工作站 的專用串線，9是多道電化學工作站，10是裝設在微小通道內的具 有梅毒特異性抗體TP0684的工作電極，11是裝設在微小通道內的具 有梅毒特異性抗體TP0453的工作電極，12是裝設在微小通道內的具 有梅毒特異性抗體TP0821的工作電極，13是裝設在微小通道內的具 有梅毒特異性抗體TP0319的工作電極，15是參比電極，16是對電 極，17是聯接對電極與多道電化學工作站的專用串線，18是聯接參 比電極與多道電化學工作站的專用串線。
具體實施方式

在圖1所展示的本案實施例中，該微流控晶片的結構包括貼合裝 設在一起的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控晶片的蓋片6以及 微流控晶片的基片7，在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有 毛細管通道，以及，四個微儲液池，該四個微儲液池分別是試樣液池 2、緩衝液池4、試樣廢液池5和緩衝廢液池14，毛細管通道的一端經由歧管狀微通道3分別與試樣液池2以及緩衝液池4以及試樣廢 液池5聯通，毛細管通道的另一端與餘下的一個緩衝廢液池14聯通， 以及，依序分別裝設在所述毛細管通道內不同位置上的工作電極以及 對電極16以及參比電極15，工作電極由金屬電極以及貼附在所述金 屬電極上的包埋梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構成，毛細管通道的構 造呈並聯構造，該呈並聯構造的毛細管通道由四個微小通道並聯構 成，以及，所述工作電極的數量是四個，該四個工作電極的裝設位置 分別位於所述四個微小通道內，以及，該四種抗體物質分別是梅毒特 異性抗體TP0684、 TP0453、 TP0821及TP0319。該四個工作電極分別 是裝設在第一併聯支流微小通道內的具有梅毒特異性抗體TP0684的 工作電極10以及裝設在第二並聯支流微小通道內的具有梅毒特異性 抗體TP0453的工作電極11以及裝設在第三並聯支流微小通道內的具 有梅毒特異性抗體TP0821的工作電極12以及裝設在第四並聯支流微 小通道內的具有梅毒特異性抗體TP0319的工作電極13。本例圖中包 括作為所述附件的多道電化學工作站9以及微流動泵1，參比電極 15可以經由專用串線18與多道電化學工作站9的對應接口聯接，對 電極16可以經由專用串線17與多道電化學工作站9的對應接口聯 接，工作電極10、 11、 12以及13可以分別經由四條同型專用串線 8與多道電化學工作站9的對應接口聯接，作為附件的微流動泵1可 以與按需選定的任意一個微儲液池聯通，本例中，微流動泵1與微儲 液池4聯通。
權利要求1.一種含金膠敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，所述器件是微流控晶片，該微流控晶片的結構包括貼合裝設在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控晶片的蓋片以及微流控晶片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有毛細管通道，以及，四個微儲液池，毛細管通道的一端經由歧管狀微通道分別與其中的三個微儲液池聯通，毛細管通道的另一端與餘下的一個微儲液池聯通，以及，依序分別裝設在所述毛細管通道內不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由金屬電極以及貼附在所述金屬電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構成，其特徵是，所述毛細管通道的構造呈並聯構造，所述呈並聯構造的毛細管通道由四個微小通道並聯構成，以及，所述工作電極的數量是四個，該四個工作電極的裝設位置分別位於所述四個微小通道內，以及，該四個工作電極其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體分別是對梅毒抗原能特異性結合的四種梅毒抗體物質，該四種抗體物質分別是梅毒特異性抗體TP0684、TP0453、TP0821及TP0319。
專利摘要本實用新型涉及一種含金膠敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，該器件是微流控晶片，屬於分析測試領域。梅毒抗原的快速且廉價的診斷是醫療技術進步的諸多企望之一，本實用新型提供一種利用梅毒多種特異性抗原同時檢測、快速診斷梅毒的微流控晶片。本案要點在於，晶片內含有呈並聯構造的毛細管通道，該並聯構造含有四條相互並聯的微小通道，共有四個工作電極分別裝設在所述四條微小通道內，四個工作電極上分別包覆了四種不同的金膠敏感膜，該四種金膠敏感膜分別包埋了四種不同的梅毒特異性抗體，該四種梅毒特異性抗體分別是抗體TP0684、抗體TP0453、抗體TP0821及抗體TP0319。本案晶片有助於提高梅毒診斷效率。
文檔編號G01N33/571GK201277974SQ20082017570
公開日2009年7月22日 申請日期2008年10月21日 優先權日2008年10月21日
發明者巫遠招, 寧 幹, 李天華, 李榕生, 欣 楊, 峰 王, 王魯雁 申請人:寧波大學