哺乳動物雷帕黴素靶蛋白的抑制的製作方法
2023-10-26 21:39:42 1
哺乳動物雷帕黴素靶蛋白的抑制的製作方法
【專利摘要】本發明公開了包含位於微膠囊內的哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)抑制劑的微膠囊,以及包含所述微膠囊的醫藥組合物和試劑盒。還公開了用於治療或預防受試對象的年齡相關性疾病、病症或紊亂的方法,其涉及對受試對象施用醫藥有效量的微膠囊,所述微膠囊包含位於微膠囊內的mTOR抑制劑。
【專利說明】晡乳動物雷帕黴素靶蛋白的抑制
[0001] 本申請是申請日為2009年11月11日、發明名稱為"哺乳動物雷帕黴素靶蛋白的 抑制"的中國專利申請200980154352. X的分案申請。
[0002] 本申請主張於2008年11月11日提交的美國臨時專利申請第61/113, 481號之申 請日的權益,其內容以全文引用的方式併入本文。
[0003] 根據美國國家衛生署(National Institutes of Health)的資金號AG029729和 AG022307,美國政府擁有本發明中的某些權利。
【技術領域】
[0004] 本發明一般涉及藥理學以及年齡相關性紊亂的治療和預防領域。更具體地說,本 發明涉及包含哺乳動物雷帕黴素祀蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑的 微膠囊,以及在受試對象中使用本發明的微膠囊來治療或預防年齡相關性疾病、紊亂和病 症的方法。
【背景技術】
[0005] 因為在發達國家中大多數死亡是由發病率隨年齡增長而迅速升高的疾病引起的, 所以延緩衰老的幹預措施遠比預防措施更有益於人體健康,預防措施只對特定的晚年疾病 有作用,例如心臟病、癌症或糖尿病。目前對用於延緩衰老和延長壽命的膳食添加劑的研發 有著濃厚的興趣。
[0006] mTOR和癌症.哺乳動物TOR是在與癌症相關聯的失調的信號傳導路徑中的關鍵 效應分子(Guertin 和 Sabatini, 2007 ;Shaw 和 Cantley, 2006)。tscl 或 tsc2 基因中的突 變導致錯構瘤性綜合癥結節硬化症(TSC),表明在mTOR和癌症之間存在分子聯繫。mTORCl 是癌症中兩個主信號傳導路徑(Ras和PI3K)所共有的唯一所知的下遊效應分子,同時也與 營養信號傳導相整合從而用於調節細胞生長(質量)(Shaw和Cantley,2006)。超活化AKT 信號傳導很可能通過mTOR來調節致癌性轉化(Skeen等人,2006)。
[0007] 已經表明,一種主要mTORCl效應分子,S6激酶1 (S6K1),調節有害效應,例如胰島 素抵抗和 II 型糖尿病(Patti 和 Kahn, 2004 ;Tremblay 等人,2005b ;Tremblay 等人,2005c ; Um等人,2006)。與野生型相比,S6K1缺陷型小鼠顯示了降低的生長速率,包括因細胞較小 而引起的白色脂肪組織(WAT)較少(Shima等人,1998)。有趣的是,S6K1缺陷型小鼠的表 型包括低胰島素血症,同時胰島素敏感性增加(Um等人,2004)。因為脂肪分解和代謝速率 提高,所以這些小鼠顯示不容易發生因飲食引起的肥胖(Um等人,2004)。在S6K1功能缺陷 型肌細胞中,AMP和無機磷酸鹽增加,而包括線粒體生物合成和脂肪酸氧化的活化AMPK和 AMPK依賴性功能也隨之增加(Aguilar等人,2007)。與此反應相對應的,細胞中脂質含量 也隨之降低。
[0008] 雷帕黴素已被證實作為脂肪細胞分化(這是一種被高FK506濃度逆轉的效應) 的有效抑制物,表明了由親免蛋白-雷帕黴素複合物所調節的有效的抑制作用(Yeh等 人,1995)。已經提出了一種用於證明mTOR和其激酶活性在3T3-L1前脂肪細胞分化中的關 鍵作用的模型,其中mTOR路徑和磷脂醯肌醇3-激酶/Akt路徑在脂肪生成過程中分別通過 調控營養有效性和胰島素信號來平行地發揮功能(Kim和Chen,2004)。
[0009] 因此,對於年齡相關疾病的更有效的治療方法存在需求,同時也有必要對可延長 壽命並延緩年齡相關疾病出現的藥劑有更深的了解。
【發明內容】
[0010] 本發明是部分基於以下發現,即通過用被膠囊化的製劑形式的mTOR抑制劑製劑 長期阻斷營養物感應和生長因子應答路徑中被稱為哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)的重 要蛋白複合物,可在包括人在內的哺乳動物中實現與食物和/或生長因子限制類似的生理 狀態,其與延遲衰老和降低年齡相關性疾病的發病率有關。例如,發明人已經發現用微膠囊 化的雷帕黴素對晚年的遺傳異質小鼠進行餵養可以延長其壽命。此外,還發現微膠囊化的 雷帕黴素可以使阿爾茨海默病(Alzheimer disease)小鼠模型恢復認知並使病理減弱。與 未膠囊化的製劑相比,微膠囊化可以提高治療功效。通過改善幾種主要的年齡依賴性疾病, mTOR的長期抑制可被應用於提高包括成年人在內的個體的健康和康樂,從而提高生命中生 育年齡的質量和數量,同時提供顯著的經濟效益。
[0011] 本發明的一些實施方案涉及微膠囊,其包含含有mTOR抑制劑的核心組分,其中該 核心組分裹有包衣。mTOR抑制劑可以是哺乳動物雷帕黴素靶蛋白複合物l(mTORCl)的抑 製劑或哺乳動物雷帕黴素靶蛋白複合物2(mT0RC2)的抑制劑。在具體的實施方案中,包 衣在受試對象的腸道中提供mTOR抑制劑的延緩釋放和/或治療劑的優先釋放(即腸溶 衣)。腸溶衣可以是所屬領域技術人員所知的任何此類包衣。所述包衣的非限制性實例包 括EudragitSlOO、鄰苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥 珀酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)或甲基丙 烯酸甲酯 -甲基丙烯酸共聚物。在一些具體的實施方案中,包衣包含EudragitSlOO。包衣 可包含Eudragit S100、鄰苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙 酸琥珀酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)或甲 基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物中一種或多種的混合物。
[0012] 本文所使用的術語"微膠囊"被定義為用於將治療劑遞送至受試對象的運載體,其 包含一個或多個核心,其中所述核心被包裹在上文所描述的包衣中。在具體的實施方案中, 微膠囊包含包裹於包衣中的單核心。在進一步的實施方案中,微膠囊包含多個被包裹於包 衣中的核心,其中周圍具有包衣的核心聚集在一起,從而形成單藥物遞送結構。核心可以是 固體或可以是液體,且其狀態取決於環境溫度。
[0013] 微膠囊可以是任何大小或形狀。基本的幾何形狀可以是例如球體、棒狀、圓柱體、 立方體、長方體、稜柱體、稜錐體、圓錐體、截錐體和截稜錐。此外,星形擠出物、十字擠出物、 肋狀擠出物和三葉形也是合適的。諸如納入管的空腔可納入微膠囊中。
[0014] 微膠囊可以是規則形狀或不規則形狀。微膠囊的表面可以是平滑的、不平的或鋸 齒狀的。微膠囊可以是無定形的、球形的或針形的,這取決於相應的製造方法。微膠囊可使 用所屬領域技術人員所知的任何方法來形成。此類方法的非限制性實例將在下文中更詳細 地討論。在包含微膠囊的單一劑量中,微膠囊可以是均勻的大小和形狀,或變化的大小和形 狀。
[0015] 微膠囊可以是任何大小。例如,微膠囊的最大直徑可以是約ΙΟΟηπκΙμπκΙΟμηι、 50um、100um、200um、300um、400um、500um、600um、700 um、800um、900um、lmm、 1. 5mm、2. 0mm、2. 5mm、3. 0mm、3. 5mm、4. 0mm、4. 5mm、5. 0mm、5. 5mm、6. 0mm、6. 5mm、7. Omm、 7. 5mm、8. 0mm、8. 5mm、9. 0mm、9. 5mm、l. Ocm或以上,或從上述最大直徑內可推導出的任何最 大直徑範圍。例如,微膠囊的最大直徑的範圍可以是約l〇〇nm到約1. Ocm。在更具體的實施 方案中,平均直徑的範圍是約1〇〇 μ m到約1mm。在其它實施方案中,平均直徑的範圍是約 100 μ m 到約 0· 1mm。
[0016] 按重量計算(w/w),微膠囊可包含至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少 40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或以上的 mTOR抑制劑。
[0017] mTOR抑制劑可以是雷帕黴素或雷帕黴素類似物。在具體的實施方案中,mTOR抑制 劑是雷帕黴素。在更具體的實施方案中,mTORCl是雷帕黴素且包衣是Eudragit S100。在 一些實施方案中,mTOR抑制劑是mTOR激酶的競爭性抑制劑。這些mTOR抑制劑與mTOR激 酶直接相互作用且不依賴於細胞內受體,如FKBP12。
[0018] 所屬領域技術人員所知的任何雷帕黴素類似物都被考慮包含於本發明的 微膠囊中。雷帕黴素類似物的非限制性實例包括依維莫司(everolimus)、他克莫司 (tacrolimus)、CCI-779、ABT-578、AP-23675、AP-23573、AP-23841、7-表-雷帕黴素、7-硫 甲基 -雷帕黴素、表-二甲氧基苯基-雷帕黴素、7-表-硫甲基-雷帕黴素、7-去甲氧 基 -雷帕黴素、32-去甲氧基-雷帕黴素、2-去甲基-雷帕黴素或42-〇-(2-輕基)乙基-雷 帕黴素。以下說明書討論了雷帕黴素類似物的許多其它實例。本發明的微膠囊可包含雷帕 黴素和一種或多種雷帕黴素類似物,或可包含一種以上的雷帕黴素類似物。
[0019] 在一些實施方案中,本發明的微膠囊包含一種或多種醫藥或保健藥劑。此類藥劑 的非限制性實例包括維生素、中草藥劑(例如銀杏葉或綠茶)、魚油(Ω 3脂肪酸)、抗菌劑、 抗氧化劑、藥物或消炎劑。例如,核心組分可包含第二化合物,該第二化合物是維生素 E、維 生素 A、抗菌抗生素、抗氧化劑、L-肉鹼、硫辛酸、二甲雙胍、白藜蘆醇、勒帕茄鹼(leptine)、 非類固醇消炎藥、C0X抑制劑、維生素 D、礦物質(如鎂、鈣、鋅或鉀)、微量元素(如鑰或碘)、 類胡蘿蔔素(如維生素 A)、酶(如脂肪酶或澱粉酶)或胺基酸(如賴氨酸、精氨酸、牛磺酸 或脯氨酸)。藥物可以是已知或疑似對治療或預防年齡相關疾病、紊亂或病症有效的藥劑。 例如,此藥物可以是已知或疑似對治療或預防神經退行性疾病、記憶喪失、葡萄糖代謝異常 或癌症有效的藥劑。以下說明書中討論此類藥劑的非限制性實例。本文闡述的微膠囊的核 心和/或包衣可包含一種或多種的輔助物質,如載劑、粘合劑以及所屬領域技術人員所熟 知的類似物。
[0020] 在一些實施方案中,微膠囊主要由包含雷帕黴素或雷帕黴素類似物的核心組分組 成,其中核心組分被包裹於包衣中。此包衣可以是上文所討論的任何包衣,且雷帕黴素類似 物可以是上文所討論的任何雷帕黴素類似物。包衣的非限制性實例包含Eudragit S100、鄰 苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纖維素、羥丙基 甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)或甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯 酸共聚物。在具體的實施方案中,包衣是Eudragit S100。在更為具體的實施方案中,包衣 是Eudragit S100且核心包含雷帕黴素。微膠囊可包含上文所討論的一種或多種的輔助物 質。
[0021] 除了一種或多種的mTOR抑制劑之外,核心還可包含一種或多種的附加組分。例 如,核心可包含選自包括甘露醇、乳糖、微晶纖維素、磷酸二鈣、澱粉、預膠化澱粉、山梨醇或 其混合物的組的稀釋劑。核心可包含崩解劑,如羥基乙酸澱粉鈉、交聯羧甲基纖維素鈉、交 聯聚維酮、澱粉或其混合物。核心可包含粘合劑,如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、乙基纖維 素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素或其混合物。核心可包含潤滑劑,如硬脂酸鈣、硬脂酸 鎂、硬脂富馬酸鈉、滑石粉、膠體二氧化矽或其混合物。
[0022] 本發明的其它實施方案涉及用於治療或預防年齡相關性疾病、病症或紊亂的醫藥 或保健組合物,其包含微膠囊,該微膠囊包含含有mTOR抑制劑的核心組分,其中此核心組 分被包裹於包衣中。微膠囊可以是本發明的任何微膠囊。本文所闡述的醫藥組合物可包含 一種或多種藥學上可接受的藥劑,其中許多藥劑都是所屬領域技術人員所熟知的。
[0023] 在一些實施方案中,微膠囊與可食用物質一起配製。可食用物質可以是食物或食 物添加劑。組合物可任選地包含一種或多種用於治療或預防任何疾病、紊亂或健康相關性 病症的附加藥劑。例如,疾病可以是年齡相關性疾病,如神經退行性疾病、葡萄糖代謝異常 或癌症。組合物可與一種或多種的保健藥劑一起配製,其中許多藥劑是所屬領域技術人員 所熟知的。例如,保健藥劑可以是維生素、營養增補劑或源於藥草或植物的藥劑,它們是已 知或疑似對促進受試對象的健康和康樂有益的。
[0024] 本發明還涉及用於在受試對象中治療或預防年齡相關性疾病、病症或紊亂的方 法,其涉及對受試對象施用醫藥有效量的本發明的微膠囊。本發明還涉及本發明的微膠囊 在受試對象中治療或預防年齡相關性疾病、病症或紊亂中的用途。受試對象可以是任何受 試對象,如哺乳動物。哺乳動物的非限制性實例包括小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、綿羊、馬、山 羊、靈長類動物和人。在具體的實施方案中,受試對象是人。人可以是已知或疑似患有年齡 相關性疾病的人。在一些實施方案中,人是年齡大於50歲、大於55歲、大於60歲、大於65 歲、大於70歲、大於75歲或大於80歲的人。
[0025] 年齡相關性疾病、病症或紊亂可以是發病率隨著年齡增長而升高的任何疾病、病 症或紊亂。年齡相關性疾病的非限制性實例包括神經退行性疾病、與葡萄糖代謝異常相關 的疾病、以及癌症。關於癌症,非限制性實例包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、腦癌、肝 癌、宮頸癌、結腸癌、腎癌、皮膚癌、頭頸癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、淋巴癌、胃癌、胰 腺癌、睪丸癌、淋巴瘤和白血病。神經退行性疾病的非限制性實例包括阿爾茨海默病、肌萎 縮性側索硬化病(ALS)、早老性痴呆、老年性痴呆、帕金森氏病(Parkinson' s disease)、亨 廷頓氏病(Huntington' s disease)和與衰老有關的記憶力喪失。
[0026] 考慮使用本發明的微膠囊來治療或預防的年齡相關性疾病、病症或紊亂的其它實 例包括胰島素抵抗、良性前列腺增生症、聽力喪失、骨質疏鬆、年齡相關性黃斑變性、皮膚病 或皮膚老化、皮膚病、皮膚老化、肌肉減少症、心血管疾病、脂質/碳水化合物代謝、癌症和 免疫疾病。可施用本文闡述的微膠囊以延長壽命、提高生活質量、降低氧化性損傷和細胞衰 老的風險。
[0027] 受試對象可患有已經存在的年齡相關性疾病、病症或紊亂,或者受試對象可處於 患上年齡相關性疾病、病症或紊亂的風險。處於風險的受試對象可以是因以前患有年齡 相關性疾病、病症或紊亂而接受過治療的受試對象,其中疾病、病症或紊亂以前已被成功治 療。受試對象可因為其它風險因素而處於危險,如遺傳風險因素或環境風險因素。
[0028] 本發明還涉及一種延長哺乳動物受試對象壽命的方法,其涉及對受試對象施用有 效量的本發明的微膠囊,其中壽命將得到延長。本文所使用的延長壽命是指受試對象的壽 命將比在沒有本發明的微膠囊的情況下生存的受試對象的壽命更長。在沒有所述微膠囊的 情況下生存的受試對象壽命的估算值可以通過以下途徑得到,例如人口學研究、社會保障 局壽命表和關於壽命的科學文獻。本發明進一步涉及在哺乳動物受:試對象中減輕年齡相關 性認知衰退的方法,其涉及對受試對象施用有效量的本發明的微膠囊,其中年齡相關性認 知衰退得到減輕。年齡相關性認知衰退的減輕可通過對受試對象的認知與從一個或一個以 上對照受試對象所獲得的已知認知指數進行對比而進行評估。
[0029] 微膠囊可使用所屬領域技術人員所知的任何方法來施用。給藥途徑的非限制性實 例包括口服、通過鼻胃管、經直腸、腹膜內、局部、皮下、靜脈內、動脈內、肌肉內、通過灌洗和 鞘內給藥。在一些實施方案中,微膠囊是通過將微膠囊與包含可食用物質的組合物組合來 進行施用的。
[0030] 微膠囊所施用的劑量可由醫師使用所屬領域技術人員所知的任何方法來確定。在 一些實施方案中,mTOR抑制劑的劑量是受試對象每千克體重中約1微克至約100毫克。關 於給藥方案的其它信息在以下說明書進行了討論。
[0031] 本發明的其它方面涉及製備包含mTOR抑制劑的微膠囊的方法,其涉及將藥物包 衣施加於包含mTOR抑制劑的核心顆粒,其中核心顆粒被包衣所包裹。包衣可以是腸溶衣。 包衣可以是上文和本說明書其它地方所討論的任何包衣。在具體的實施方案中,包衣是 Eudragit S100〇
[0032] 所屬領域技術人員所知的任何方法都可以用於將包衣施加於顆粒。在具體的實施 方案中,施加腸溶衣涉及使用旋轉盤霧化器,其它方法可包括鍋包衣法、空氣懸浮包衣法、 離心擠出法、振蕩噴管法、噴霧乾燥法、界面聚合法、原位聚合法和基質聚合法。
[0033] 本發明的其它方面涉及試劑盒,其包含含有一個或多個的本發明微膠囊的第一密 封容器。試劑盒可包含含有本發明的任何微膠囊的第一密封容器。在一些實施方案中,試 劑盒進一步包含本發明的微膠囊的使用說明書。在一些實施方案中,試劑盒進一步包含第 二化合物。該第二化合物可被包含於第一密封容器中,或可被單獨包含於例如第二密封容 器中。
[0034] 應理解上述公開內容強調了本發明的一些具體的實施方案,且與其等同的所有修 飾或替代處於如隨附權利要求書中所闡述的本發明精神和範圍之內。本文所引用的所有參 考文獻以全文引用的方式併入以用於所有目的。
[0035] 應專門考慮到,所討論的關於本發明的一個實施方案的任何限制可適用於本發明 的任何其它實施方案。此外,本發明的任何組合物可被用於本發明的任何方法中,並且本發 明中的任何方法可被用於製造或使用本發明的任何組合物。
[0036] 除非明確地說明僅指選擇對象或選擇對象是相互排斥的,否則權利要求書中的術 語"或"是用來表示"和/或"的意思,但本公開書也支持僅指選擇對象和"和/或"的定義。
[0037] 在本申請中,術語"約"被用於說明數值包括用於確定此數值的裝置和/或方法的 誤差的標準偏差。
[0038] 除非另外明確地說明,否則本說明書所使用的"一(a或an)"可表示一個(種)或 多個(種)的意思。當與單詞"包含"結合使用時,本文權利要求中所使用的單詞"一"可 表示一個(種)或多個(種)的意思。本文所使用的"另一個"可表示至少第二個或更多。
[0039] 本文中的醫療裝置、灌流系統和試劑盒中任何一個的任何實施方案都可由或基本 上由所描述的特徵和/或步驟組成,而不是包含/包括/含有/具有所描述的特徵和/或 步驟。因此,在任何權利要求中,術語"由……組成"或"基本上由……組成"可用於替代上 文所引用的任何開放式系動詞,以便改變另外使用開放式系動詞的指定權利要求的範圍。
[0040] 根據以下【具體實施方式】,本發明的其它目的、特徵和優勢將會變得明顯。但是,應 該了解到,表明本發明的優選實施方案的【具體實施方式】和具體實施例僅通過圖解的方式在 文中提供,因為在本發明的精神和範圍之內的各種改動和修飾會通過此【具體實施方式】而使 所屬領域技術人員覺得淺顯易懂。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041] 下列附圖構成了本說明書的一部分,且用於進一步說明本發明的某些方面。本發 明可通過參考這些附圖中的一個或多個並結合本文所提供的【具體實施方式】的詳細描述而 更好地得到理解。
[0042] 圖1.雄性(左)和雌性(右)小鼠的生存曲線,其將對照小鼠與那些用依那普 利、CAPE或雷帕黴素餵養的小鼠進行對比,其中三個試驗場的結果匯合到一起。依那普利 和CAPE在4月齡時被加進食物中,雷帕黴素在20月齡時被加進食物中。P值通過對數秩檢 驗來進行計算。
[0043] 圖2.雄性和雌性小鼠的生存曲線,其將對照小鼠與那些在600日齡開始餵食雷帕 黴素食物的小鼠進行對比,三個試驗場的結果匯合到一起。P值通過對數秩檢驗來進行計 算。由於技術原因,對照小鼠的4%和分配雷帕黴素的小鼠的3%從實驗中移除。在雷帕黴 素治療開始600天後,僅有5隻動物(三隻對照,兩隻雷帕黴素)被移除。因此,在檢查中 各組之間沒有顯著差異。
[0044] 圖3.三個試驗場中單獨每一個的雄性和雌性對照小鼠和用雷帕黴素治療的小鼠 的存活率。P值代表對數秩計算的結果。在600日齡處的垂直線說明在此年齡小鼠首次接 觸雷帕黴素。
[0045] 圖4A、4B、4C.從270日齡開始接受雷帕黴素的小鼠的表徵。A,雄性和雌性小鼠的 生存曲線,其將對照小鼠與單獨(群組2006)群體中用雷帕黴素治療的小鼠進行對比,其中 從270日齡開始小鼠用雷帕黴素進行治療。因為在中期分析時所有活小鼠的年齡都介於 800日齡與995日齡之間,所以關於年齡在900天以上的小鼠的生存曲線的形狀只有有限的 信息,且在最大年齡時(>990天)斜率的顯著改變反映了該實驗的不確定性。P值通過對數 秩檢驗進行計算。B,從750日齡到880日齡的雄性和雌性小鼠獲得的內臟脂肪墊中,雷帕 黴素食物對mTOR效應分子的影響。在組織裂解液中對核糖體亞單位蛋白S6(rpS6)以及其 磷酸化狀態(P_rpS6,雙箭頭)進行了免疫分析,所述組織裂解液由食用了含有微膠囊化的 雷帕黴素的食物或對照食物的小鼠製備而來。所使用的抗體在左邊顯示。P_rpS6/rpS6的 強度值比率顯示在雌性和雄性小鼠的曲線圖中。Pan-actin也在印跡中進行了免疫分析,從 而提供每條泳道中蛋白質負荷的指示。C,在750日齡至880日齡的雄性和雌性小鼠中的全 血雷帕黴素含量。在B和C中,誤差線顯示了平均值的標準誤差。
[0046] 圖5.白色脂肪組織中減少的P-rpS6 (Ser240/244)。
[0047] 圖 6.肝中減少的 P-rpS6 (Ser240/244)。
[0048] 圖7.在大腦中對於P-rpS6(Ser240/244)無可檢測到的作用。
[0049] 圖8.雄性小鼠白色脂肪組織中4E-BP1的增加。
[0050] 圖9.在肝中對於4E-BP1無可檢測到的作用。
[0051] 圖10.雄性小鼠白色脂肪組織中Akt的活化。
[0052] 圖11.雄性小鼠肝中Akt的活化。
[0053] 圖12.大腦中Akt的活化。
[0054] 圖13.食物中雷帕黴素的穩定性。
[0055] 圖14.雷帕黴素的膠囊化可以提高其在實驗室食物中的穩定性。將7ppm雷帕黴 素添加到商業上製備的實驗室食物中,然後分析食物中的雷帕黴素含量。雷帕黴素水平比 預期的要低,暗示雷帕黴素在食物製備或儲存過程中發生了降解(空心柱體)。雷帕黴素的 微膠囊化作用可以減少其降解(陰影柱體)。
[0056] 圖15.在用含有膠囊化或未膠囊化的雷帕黴素的食物進行餵養後,全血中可以檢 測到雷帕黴素。用膠囊化和未膠囊化的雷帕黴素(7ppm)對小鼠餵養3周,並分析血液中的 雷帕黴素水平。膠囊化作用導致血液中的雷帕黴素水平顯著地高於使用未膠囊化的雷帕黴 素時所觀測到的水平。
[0057] 圖16.微膠囊化作用。
[0058] 圖17.血液中的雷帕黴素水平。
[0059] 圖18.在限制熱量的小鼠中mTOR信號傳導的減少。
[0060] 圖19.雷帕黴素對體重沒有作用。
[0061] 圖20.雷帕黴素減弱了在一般運動活動中的年齡相關性哀退。
[0062] 圖21.在從9月齡時開始餵食雷帕黴素的小鼠中,對肥胖無顯著影響。
[0063] 圖22.熱量限制對壽命的影響。
[0064] 圖23.內臟脂肪墊P_Ser473Akt分析:20個月的治療。
[0065] 圖 24.腓腸肌 P_Ser473Akt 分析。
[0066] 圖25.高脂肪食物餵養12周,有或無雷帕黴素對小鼠的體重沒有差異。
[0067] 圖26.雷帕黴素導致了在用高脂肪食物餵養的HET3小鼠中葡萄糖耐受不良。
[0068] 圖27.增加飲食脂肪或熱量對雷帕黴素對於葡萄糖代謝的作用的影響。
[0069] 圖28A、28B、28C、28D.雷帕黴素消除在3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠 AD模型中的記 憶缺陷。A和C :相對於對照餵食Tg組,餵食雷帕黴素的3xTg-AD和hAPP (J20)小鼠到達隱 藏平臺的平均等待時間得到顯著降低(分別是*P < 〇. 004和*P = 0. 036)。在hAPP (J20) 和3xTg-AD兩組中學習都是有效的[分別是F(3, 120) = 10. 29, P < 0· 0001 ;和F(4, 220) =16. 95,P< 0.0001]。沒有觀察到天數和基因型之間有顯著的相互關係;因此,在訓練中 基因型一直都具有大致相同的作用。B和D :在對照餵養的3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠中, 對先前平臺位置的記憶被削弱[P < 0. 01和P < 0. 001,在單向AN0VA中Tukey多重對比檢 驗被應用於基因型的顯著效應(分別是P = 0. 01和P < 0. 0001)],但是餵食雷帕黴素的 3xTg-AD和hAPP (J20)動物的非Tg組沒有顯著差異。數據是平均值+SEM。
[0070] 圖 29A、29B、30C、29D、29E、29F、29G、29H、29I.雷帕黴素降低了 Αβ 42水平和沉積。A 和B :分別從3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠大腦中所提取的蛋白質的代表性Western印跡。C、 D和E :APP、C99和C83的定量分析(以β -肌動蛋白水平校準)顯示出雷帕黴素對兩個轉 基因株系中的ΑΡΡ加工無顯著影響。F和G :ELISA測量表明雷帕黴素沒有改變3xTg-AD (F ; 卩=0.89)或1^--〇20)(6丨=0.29)小鼠大腦中的4840水平。相比之下,雷帕黴素顯著 地降低了 3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠中可溶性As42的水平(P值分別是0. 02和0. 04)。Η 和I :代表性顯微照片,描繪了被抗As42抗體所感染的3xTg-AD小鼠的CA1錐體神經元。統 計評估通過使用雙尾非配對學生t檢驗來進行。
[0071] 圖 30A、30B、30C、30D、30E、30F、30G、30H、30I.雷帕黴素的施用顯著地減輕了 3xTg_AD小鼠中的τ病理表現(tau pathology)。A和B :被抗τ抗體AT270 (其可識別 在ThrlSl經磷酸化的τ )所染色的CA1錐體神經元的代表性顯微照片,明確地表明了用雷 帕黴素治療的小鼠的ΑΤ270免疫反應性降低。C和D:圖Α和Β各自的高倍放大視圖。Ε和 F:上文顯示的CA1錐體神經元的連續部分用構象特異性抗τ抗體MCI染色。當8月齡的 3xTg_AD小鼠的一些海馬神經元(E)中開始顯示出MCI陽性包涵體(positive inclusion) 時,我們無法在用雷帕黴素治療的3xTg-AD小鼠的大腦中檢測到任何MCI陽性包涵體。G : 蛋白質的代表性Western印跡圖,此蛋白質從3xTg-AD小鼠的大腦中提取,並用磷酸化的特 異性抗τ抗體AT270和作為加樣對照的β-肌動蛋白進行檢測。H:圖G上印跡的定量分 析,表明雷帕黴素顯著地降低了在ThylSl經磷酸化的τ的穩態水平((Ρ = 〇. 006))。I : ELISA測量顯示出可溶性τ的水平在雷帕黴素治療過的小鼠大腦中得到顯著地降低(Ρ = 〇.〇1)。對於不溶性τ的水平沒有檢測到任何變化(Ρ >0.05)。統計評估通過使用雙尾 非配對學生t檢驗和單向AN0VA來進行,以分別用於ΑΤ270免疫反應性水平和ELISA測定。 圖A、Β、E和F的比例尺是12. 5 μ m,圖C和D的比例尺是100 μ m。
[0072] 圖 31A、31B、31C、31D、31E、31F.施用雷帕黴素增強了 hAPP(J20)和 3xTg-AD 小鼠 大腦中的自噬作用。A :從3xTg-AD小鼠大腦中提取的蛋白質的代表性Western印跡圖。B 和E :定量分析(數據以s-肌動蛋白校準)表明雷帕黴素顯著地增加了 ATG7(B ;P = 0. 03) 和ATG5/ATG12複合物(C ;P = 0. 04)的穩態水平,此說明用雷帕黴素治療的小鼠的自噬水 平的提高。雖然沒有觀察到LC3I的水平有顯著變化(D ;P > 0. 05),但雷帕黴素顯著地提高 了 LC3II的大腦水平(Ε ;P = 0. 03),此進一步說明自噬作用的提高。E和F :被抗LC3抗體 所染色的對照餵養(E)和用雷帕黴素餵養(F)的hAPP(J20)小鼠大腦中海馬CA1的代表性 表面螢光圖像。在施用雷帕黴素之後,在CA1投影區觀察到LC3特異性免疫反應性有顯著 的提高。插圖,來自同一區域的共焦圖像的z堆疊。橫切體積的代表性2D截面在此顯示。
[0073] 圖32A、32B.用雷帕黴素治療了 5周的UM-HET3雄性小鼠的內臟脂肪中的Akt活 化作用。A)利用所用抗體的免疫分析在每個印跡圖的左邊顯示出來(P-Akt對Ser473具有 特異性)。B)數據已被定量並以圖表的方式顯示。雌性小鼠#21的波段強度從統計分析中 去除,因為它們在平均值的95%置信區間外。
[0074] 圖33.用雷帕黴素治療了 20個月的UM-HET3雄性小鼠的內臟脂肪中的Akt活化 作用降低。也顯示了雌性的數據。所使用的抗體在每個印跡圖的左邊顯示出來(P-Akt對 Ser473具有特異性)。數據已被定量且在免疫印跡圖下方以圖表的方式顯示。
[0075] 圖34.腓腸肌中雷帕黴素的短期治療與長期治療的比較。顯示了量化的強度值 P-473SerAkt/Akt比率的圖表。A)治療5周。B)治療20個月。注意到用雷帕黴素治療了 5周的雌雄小鼠中Ser473磷酸化有顯著提高,在雄性小鼠中也有相同的趨勢。在20個月的 治療中,在雌性或雄性中Akt磷酸化沒有提高。
[0076] 圖35.在群組3中雷帕黴素治療組(R)和對照組(C)小鼠的肝腫瘤中S6K1的免 疫印跡分析。這些小鼠用雷帕黴素食物餵養了 20個月。P-Thr (389) p70是來自於與磷酸化 依賴性抗體的信號,且P70是來自於與磷酸化非依賴性抗體的信號。
[0077] 圖36A、36B.雷帕黴素減弱了 p70激酶的磷酸化作用。A :對照組或雷帕黴素治療 組小鼠的海馬裂解液的印跡中P-P70免疫反應性的定量分析顯示了雷帕黴素降低p70激 酶的磷酸化作用,這與雷帕黴素對mTOR的抑制作用一致。B :從對照組或雷帕黴素治療組 hAPP(J20)小鼠(又名PDAPP小鼠)的海馬中提取的蛋白質的代表性Western印跡圖。統 計評估通過使用雙尾非配對學生t檢驗來進行。
【具體實施方式】
[0078] 本發明利用了以下認知,即mTOR抑制劑的微膠囊化作用提高所述抑制劑的穩定 性,因此增強了抑制劑在細胞衰老延緩、生物體長壽以及年齡相關性的衰老疾病方面的功 效。例如,為了提高在飲食中藥物的穩定性,發明人已經開發了一種微膠囊化程序,其使雷 帕黴素在食物製備過程中穩定存在的部分增加了 3至4倍。食用含有微膠囊化的雷帕黴素 的食物的小鼠的血液濃度是那些食用含有未膠囊化的雷帕黴素的食物的小鼠的血液濃度 的約10倍。雷帕黴素的微膠囊化作用最終使這個試驗變得經濟上可行,因為未膠囊化的 雷帕黴素用於這個試驗的預算費用是非常高的。在至少50%的小鼠死亡之後,雷帕黴素組 的小鼠比對照組顯示出更大的存活率(雄性小鼠的P值小於0. 001,雌性小鼠的P值小於 0. 0007)。這些數據有力地支持以下概念,即通過任何途徑遞送雷帕黴素或其它已知或未知 的mTOR抑制劑而對mTOR長期抑制可以改善年齡相關性疾病,如癌症、代謝綜合症和神經退 行性疾病,從而改善成年人的總體健康和康樂。
[0079] A. mTOR抑制劑和雷帕黴素
[0080] 任何mTOR抑制劑都考慮包含在本發明的微膠囊和方法中。在具體的實施方案 中,mTOR抑制劑是雷帕黴素或雷帕黴素類似物。雷帕黴素(又名西羅莫司(sirolimus) 並且以商品名Rapamune.RTM.進行銷售)是一種已知的大環內脂。雷帕黴素的分子式 是 C51H79N013。其化學名是(3S, 6R, 7E, 9R, 10R, 12R, 14S, 15E, 17E, 19E, 21S, 23S, 26R, 27 R, 34aS)-9, 10, 12, 13, 14, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 32, 33, 34, 34a-十六氫-9, 27-二羥 基-3-[(lR)-2-[(lS,3R, 4R)-4-羥基-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基]-10, 21-二甲氧 基-6, 8, 12, 14, 20, 26-六甲基-23, 27-環氧-3H-吡啶並[2, Ι-c] [1,4]氧雜氮雜三i^一環 烯-1,5, 11,28,29(4Η,6Η,31Η)_ 戊酮。
[0081] 雷帕黴素與FK結合蛋白(FKBP)家族的成員FKBP12相結合。雷帕黴素/FKBP12 複合物與蛋白激酶mTOR相結合,以阻斷信號轉導路徑的活性。因為mTOR信號傳導網絡包 括多個腫瘤抑制基因(包括PTEN、LKB1、TSC1和TSC2)和多個原癌基因(包括PI3K、Akt和 eEF4E),所以mTOR信號傳導在細胞存活和增殖中發揮核心作用。雷帕黴素/FKBP複合物與 mTOR的結合導致細胞周期在G1期被阻遏(Janus等人,2005)。
[0082] mTOR抑制劑也包括雷帕黴素類似物。許多雷帕黴素類似物在所屬領域中是已 知的。雷帕黴素類似物的非限制性實例包括(但不限於)依維莫司、他克莫司、CCI-779、 ABT-578、AP-23675、AP-23573、AP-23841、7-表-雷帕黴素、7-硫甲基-雷帕黴素、7-表-三 甲氧基苯基-雷帕黴素、7-表-硫甲基-雷帕黴素、7-去甲氧基-雷帕黴素、32-去甲 氧基-雷帕黴素、2-去甲基-雷帕黴素、前雷帕黴素(prerapamycin)、西羅莫司脂化物 (temsirolimus)和42-〇-(2_輕基)乙基-雷帕黴素。
[0083] 雷帕黴素的其它類似物包括:雷帕黴素肟(美國專利第5, 446, 048號)、雷帕黴素 氨基酯(美國專利第5, 130, 307號)、雷帕黴素二醛(美國專利第6, 680, 330號)、雷帕黴素 29-烯醇(美國專利第6, 677, 357號)、0-烷基化雷帕黴素衍生物(美國專利第6, 440, 990 號)、水溶性雷帕黴素酯(美國專利第5, 955, 457號)、烷基化雷帕黴素衍生物(美國專利 第5, 922, 730號)、雷帕黴素脒基氨基甲酸酯(美國專利第5, 637, 590號)、雷帕黴素生物 素酯(美國專利第5, 504, 091號)、雷帕黴素氨基甲酸酯(美國專利第5, 567, 709號)、雷 帕黴素羥基酯(美國專利第5, 362, 718號)、雷帕黴素42-磺酸酯和42-(N-烷氧羰基)氨 基磺酸酯(美國專利第5, 346, 893號)、雷帕黴素環氧己烷異構體(美國專利第5, 344, 833 號)、咪唑烷基雷帕黴素衍生物(美國專利第5, 310, 903號)、雷帕黴素烷氧酯(美國專利第 5, 233, 036號)、雷帕黴素吡唑(美國專利第5, 164, 399號)、雷帕黴素醯基衍生物(美國專 利第4, 316, 885號)、雷帕黴素的還原產物(美國專利第5, 102, 876號和第5, 138, 051號)、 雷帕黴素醯胺酯(美國專利第5, 118, 677號)、雷帕黴素氟化酯(美國專利第5, 100, 883 號)、雷帕黴素縮醛(美國專利第5, 151,413號)、氧雜雷帕黴素(美國專利第6, 399, 625 號)和雷帕黴素矽醚(美國專利第5, 120, 842號),上述每個專利都以引用的方式特別並 入。
[0084] 雷帕黴素的其它類似物包括下述專利中所描述的物質:美國專利第7, 560, 457、 7, 538, 119、7, 476, 678、7, 470, 682、7, 455, 853、7, 446, 111、7, 445, 916、7, 282, 505、 7, 279, 562、7, 273, 874、7, 268, 144、7, 241,771、7, 220, 755、7, 160, 867、6, 329, 386、 RE37, 421、6, 200, 985、6, 015, 809、6, 004, 973、5, 985, 890、5, 955, 457、5, 922, 730、 5, 912, 253、5, 780, 462、5, 665, 772、5, 637, 590、5, 567, 709、5, 563, 145、5, 559, 122、 5, 559, 120、5, 559, 119、5, 559, 112、5, 550, 133、5, 541,192、5, 541,191、5, 532, 355、 5, 530, 121、5, 530, 007、5, 525, 610、5, 521,194、5, 519, 031、5, 516, 780、5, 508, 399、 5, 508, 290、5, 508, 286、5, 508, 285、5, 504, 291、5, 504, 204、5, 491,231、5, 489, 680、 5, 489, 595、5, 488, 054、5, 486, 524、5, 486, 523、5, 486, 522、5, 484, 791、5, 484, 790、 5, 480, 989、5, 480, 988、5, 463, 048、5, 446, 048、5, 434, 260、5, 411,967、5, 391,730、 5, 389, 639、5, 385, 910、5, 385, 909、5, 385, 908、5, 378, 836、5, 378, 696、5, 373, 014、 5, 362, 718、5, 358, 944、5, 346, 893、5, 344, 833、5, 302, 584、5, 262, 424、5, 262, 423、 5, 260, 300、5, 260, 299、5, 233, 036、5, 221,740、5, 221,670、5, 202, 332、5, 194, 447、 5, 177, 203、5, 169, 851、5, 164, 399、5, 162, 333、5, 151,413、5, 138, 051、5, 130, 307、 5, 120, 842、5, 120, 727、5, 120, 726、5, 120, 725、5, 118, 678、5, 118, 677、5, 100, 883、 5, 023, 264、5, 023, 263、5, 023, 262號,所有專利都以引用的方式併入本文。其它雷帕黴素類 似物和衍生物可見於以下美國專利申請公開案:20080249123、20080188511、20080182867、 20080091008、20080085880、20080069797、20070280992、20070225313、20070203172、 20070203171、20070203170、20070203169、20070203168、20070142423、20060264453 和 20040010002,所有公開案都以引用的方式特別併入本文。
[0085] 雷帕黴素或雷帕黴素類似物可以從所屬領域技術人員所知的任何來源獲得。此來 源可以是商業來源或天然來源。雷帕黴素或雷帕黴素類似物可使用所屬領域技術人員所知 的任何技術來進行化學合成。關於雷帕黴素合成的信息的非限制性實例可見於Schwecke 等人,1995 ;Gregory 等人,2004 ;Gregory 等人,2006 ;Graziani, 2009。
[0086] B.微膠囊的製備
[0087] 本發明的微膠囊可以使用所屬領域技術人員所知的任何方法來進行製備。可使用 所屬領域技術人員所知的任何方法來獲得核心。然後使用所屬領域技術人員所知的任何 方法來包裹此核心。在具體的實施方案中,包衣是腸溶衣。包衣的一些實例在下文進行討 論。在具體的實施方案中,施加腸溶衣涉及使用旋轉盤霧化器,其它方法可包括鍋包衣法、 空氣懸浮包衣法、離心擠出法、振蕩噴管法、噴霧乾燥法、界面聚合法、原位聚合法和基質聚 合法。
[0088] 用於製備微膠囊的其它方法在以下美國專利申請公開案:20080022965、 20080193653、20070138673、20070082829、20060234053、20060121122、20050113282、 20040121155、20040074089 和 20020009473 以及以下美國專利:7, 576, 903、7, 037, 582、 6, 936, 644、6, 653, 256、6, 592, 916、6, 486, 099、4, 460, 722 中進行了討論,其皆以引用的方 式特別併入本文。
[0089] C.核心
[0090] 本文所使用的核心是指微膠囊中包含活性劑的部分,其中活性劑被包裹於包衣 中。活性劑已經在上文和本說明書的其它地方進行了討論。
[0091] 核心可包含許多的其它治療劑,或許多的其它輔助成分。例如,核心可進一步包含 至少一種下列物質:吸收增強劑、粘合劑、硬度增強劑、任選的崩解劑和另一種賦形劑。粘 合劑的實例包括聚維酮(PVP :聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量HPC(羥丙基纖維素)、低分子 量HPMC(羥丙基甲基纖維素)、低分子量羧甲基纖維素、乙基纖維素、明膠聚環氧乙烷、阿 拉伯膠、糊精、矽酸鎂鋁、澱粉和聚甲基丙烯酸酯。核心可包含穩定劑,如丁基羥基茴香醚、 抗壞血酸和檸檬酸中的至少一種。核心可包含選自由以下組成的組的崩解劑:交聯羧甲基 纖維素鈉、交聚維酮(crospovidoneM交聯聚乙烯吡咯烷酮)、羧甲基澱粉鈉(羥基乙酸 澱粉鈉)、交聯羧甲基纖維素鈉(交聯甲羧纖維素(Croscarmellose))、預膠化澱粉(澱粉 1500)、微晶澱粉、水不溶性澱粉、羧甲基纖維素鈣、矽酸鎂鋁和其組合。
[0092] 核心可包含填充劑,如一水合物、微晶纖維素、澱粉、乳糖醇、乳糖、合適的無機鈣 鹽、蔗糖或其組合。
[0093] 核心可包含選自由以下組成的組的抗氧化劑:4, 4(2, 3二甲基四亞甲基二鄰苯 二酚)、富含生育酚的提取物(天然維生素 E)、α -生育酚(合成維生素 E)、β -生育酚、 生育酚、S -生育酚、Butylhydroxinon、丁基羥基茴香醚(ΒΗΑ)、丁基羥甲苯(ΒΗΤ)、沒 食子酸丙酯、沒食子酸辛酯、沒食子酸十二烷酯、叔丁基氫醌(TBHQ)、富馬酸、蘋果酸、抗壞 血酸(維生素 C)、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、抗壞血酸鉀、抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸硬脂 酸酯、檸檬酸、乳酸鈉、乳酸鉀、乳酸鈣、乳酸鎂、阿諾克索默(Anoxomer)、異抗壞血酸、異抗 壞血酸鈉、異抗壞血酸(Erythorbin acid)、異抗壞血酸鈉 (Sodium erythorbin)、乙氧基喹 啉、甘氨酸、愈創樹脂、檸檬酸鈉(檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉)、檸檬酸鉀(檸檬 酸一鉀、檸檬酸三鉀)、卵磷脂、多聚磷酸酯、酒石酸、酒石酸鈉(酒石酸一鈉、酒石酸二鈉)、 酒石酸鉀(酒石酸一鉀、酒石酸二鉀)、酒石酸鈉鉀、磷酸、磷酸鈉(磷酸一鈉、磷酸二鈉、磷 酸三鈉)、磷酸鉀(磷酸一鉀、磷酸二鉀、磷酸三鉀)、乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA二鈉鈣)、 乳酸、三羥基丁醯苯和硫代二丙酸。
[0094] 核心可包含螯合劑,如抗氧化劑、依地酸二鉀、依地酸二鈉、依地酸二鈉鈣、依地 酸、富馬酸、蘋果酸、麥芽酚、依地酸鈉、依地酸三鈉。
[0095] 核心可包含潤滑劑,如硬脂酸鹽、硬脂酸、科羅拉油(corola oil)、硬脂酸棕櫚酸 甘油酯、氫化植物油、氧化鎂、礦物油、泊洛沙姆(poloxamer)、聚乙二醇、聚乙烯醇、硬脂酸 鎂、苯甲酸鈉、滑石粉、硬脂富馬酸鈉、c 〇mprit〇l(山嵛酸甘油酯)和十二烷基硫酸鈉(SLS) 或其組合。根據本發明的製劑的一個優選實施方案優選提供含有親水的、可溶脹的、水凝膠 形成材料的核心,所述核心由包含水不溶性聚合物和親水性水滲透性劑的包衣包裹,水通 過所述包衣可以進入核心。核心中可溶脹的水凝膠形成物質然後溶脹並使包衣脹開,之後 核心更優選緩慢崩解或以其它方式釋放出活性成分。另一種可選的但是優選的實施方案涉 及控釋核心,其帶有緩慢侵蝕型乾燥包衣。
[0096] D.包衣
[0097] 許多藥物劑型由於其化學性質會對胃產生刺激作用,或由胃酸通過酶的作用而被 降解,因此變得不太有效。包衣可以是腸溶衣,即一種在活性成分到達腸之前可以防止其釋 放和吸收的包衣。"腸"是指小腸,因此腸溶衣促進藥劑遞送至小腸。一些腸溶衣促進藥劑遞 送至結腸。在一些實施方案中,腸溶衣是EUDRAGIT(丨_.!)包衣。Eudragit包衣包括Eudragit L100-44 (用於遞送至十二指腸 )、Eudragit L30D-55 (用於遞送至十二指腸 )、Eudragit L100 (用於遞送至空腸 )、Eudragit S100 (用於遞送至迴腸)和Eudragit FS30D (用於遞送 至結腸)。其它包衣包括Eudragit RS、Eudragit RL、乙基纖維素和聚乙酸乙烯酯。優點包 括pH依賴型藥物釋放、保護對胃液敏感的活性劑、保護胃黏膜不受活性劑影響、增加藥物 有效性、良好的儲存穩定性以及GI和結腸靶向。
[0098] 腸溶衣組分的一些實例包括鄰苯二甲酸乙酸纖維素、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共 聚物、乙酸琥珀酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸 酯、聚乙酸乙烯酯鄰苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、海藻酸鈉和硬脂 酸。包衣可包含合適的親水性膠凝聚合物,其包括(但不限於)纖維素聚合物,如甲基纖維 素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥乙基纖維素等;乙烯基聚合物,如聚 乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等;丙烯酸聚合物和共聚物,如丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸共聚物、 丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物;天然和合成樹膠,如瓜爾豆膠、阿拉伯膠、黃原膠、明 膠、膠原蛋白;蛋白質;多糖,如果膠、果膠酸、海藻酸、海藻酸鈉、多聚胺基酸、多元醇、聚乙 二醇等;及其混合物。所屬領域技術人員所知的任何其它包衣劑都考慮包含在本文所闡述 的微膠囊的包衣中。
[0099] 包衣可任選地包含增塑劑,如癸二酸二丁酯、聚乙二醇和聚丙二醇、鄰苯二甲酸二 丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯、檸檬酸三丁酯、乙醯化單甘油酯、乙醯檸檬酸三丁 酯、三乙酸甘油酯、鄰苯二甲酸二甲酯、苯甲酸苄酯、脂肪酸的丁酯和/或乙二醇酯、精煉礦 物油、油酸、蓖麻油、玉米油、樟腦、甘油和山梨醇或其組合。包衣可任選地包含樹膠。樹膠 的非限制性實例包括同多糖,如刺槐豆膠、半乳聚糖、甘露聚糖、植物膠,如藻酸鹽、梧桐膠、 果膠、瓊脂、黃芪膠、金合歡膠、卡拉膠、核聚糖、海藻酸、其它多糖膠(如水狀膠質)、兒茶、 salai guggal、indianbodellum、capaiba膠、阿魏膠、cambi膠、象耳豆、乳香樹膠、安息香 膠、山達脂、棕兒茶膠(gambier gum)、豆科紫礦樹(Flame of Forest Gum)、沒藥樹、魔芋甘 露聚糖、瓜爾豆膠、汶萊膠、結冷膠、他拉膠、刺槐豆膠、鹿角菜膠、葡甘露聚糖、半乳聚糖膠、 海藻酸鈉、黃芪膠、核聚糖、黃原膠、脫乙醯黃原膠、果膠、聚果膠酸鈉、谷蛋白、卡拉牙膠、羅 望籽果膠、印度樹膠、禾木膠(Accaroid)/羅漢松膠/紅膠、達瑪膠、生達膠、酯樹膠、伊皮 爾-伊皮爾種子膠、塔拉膠(gum talha)(阿拉伯膠)以及人工培養的植物細胞膠,其包括 來自下列屬的植物的那些:金合歡屬植物、稱猴桃屬、花蔓草屬、carbobrotus、chickorium、 黃瓜屬、大豆屬、木槿屬、大麥屬、letuca、番茄屬、蘋果屬、苜蓿屬、松葉菊屬、稻屬、黍屬、薦 草屬、貓尾草屬、poliathus、聚卡波非、sida、茄屬、三葉草屬、胡蘆巴屬、緬茄種子膠、非洲 麵包樹膠、蘇木膠(detarium gum)、肉桂膠、角豆樹膠、非洲牧豆木膠(Prosopis africana gum)、芋頭膠(Colocassia esulenta gum)、哈克木膠(Hakea gibbosa gum)、非洲棟膠(khaya gum)、硬葡聚糖、玉蜀黍屬和上述任何物質的混合物,以及類似物。
[0100] E.應用
[0101] 1.定義
[0102] 本文所使用的術語"治療"是指對受試對象施用或應用治療劑,或對受試對象執行 程序或物理療法,以便獲得疾病或健康相關性病症的治療益處。例如,本發明的微膠囊可施 用於受試對象以便治療受試對象的神經退行性疾病。本文所使用的"治療"是指治癒疾病 的所有病徵和症狀,或降低疾病的病徵或症狀的嚴重程度。
[0103] 本申請中所使用的術語"治療益處"或"治療上有效的"是指就此病症的醫學治療 來說,促進或提高受試對象的健康的任何方面。其包括(但不限於)疾病的病徵或症狀在 頻率或嚴重程度上的降低。例如,施用本發明的微膠囊以減少神經退行性疾病的病徵和症 狀。
[0104] "預防"的使用是根據其一般和普遍含義,意思是"在……之前採取行動"或諸如此 類的行為。在特定疾病或健康相關性病症的上下文中,這些術語是指將藥劑、藥物或療法施 用或應用於受試對象,或對受試對象執行程序或物理療法以便阻止疾病或健康相關性病症 的發病。例如,施用本發明的微膠囊以阻止神經退行性疾病在老年人中的發病。
[0105] 2.與T0R路徑相關的年齡相關性疾病
[0106] 本發明的方法可用於治療或預防年齡相關性疾病、病症或紊亂。年齡相關性疾病、 病症或紊亂的非限制性實例包括胰島素抵抗(即,糖耐量受損)、良性前列腺增生症、聽力 喪失、骨質疏鬆、年齡相關性黃斑變性、神經退行性疾病、皮膚病、皮膚老化或癌症。在本發 明方法的一個實施方案中,年齡相關性疾病、病症或紊亂是皮膚病。可使用本發明的方法來 治療的皮膚病的實例包括脂溢性角化病、光化性角化病、瘢痕疙瘩、牛皮癬和卡波西氏肉瘤 (Kaposi's sarcoma)〇
[0107] 神經退行性疾病的非限制性實例包括阿爾茨海默病、癲癇、亨廷頓氏病、帕金森 氏病、中風、脊髓損傷、創傷性腦損傷、路易體痴呆、匹克氏病(Pick's disease)、尼曼-匹 克病(Niewmann-Pick disease)、澱粉樣血管病、腦澱粉樣血管病、系統性澱粉樣變性、遺 傳性腦出血伴荷蘭型澱粉樣變性、包涵體肌炎、輕度認知功能損害、唐氏症候群(Down's syndrome)和神經肌肉紊亂,包括肌萎縮性側索硬化症(ALS)、多發性硬化症和肌營養不 良症,包括杜氏肌營養不良(Duchenne dystrophy)、貝克肌營養不良(Becker muscular dystrophy)、面肩肱型(Landouzy-Dejerine)肌營養不良和肢帶型肌營養不良(LGMD)。還 包括由中風、頭部創傷、脊髓損傷或其它腦、外周神經、中樞神經或神經肌肉系統損傷所引 起的神經退行性疾病。
[0108] 在本發明方法的另一個實施方案中,年齡相關性疾病、病症或紊亂是皮膚老化病 症。可用本發明的方法來治療的皮膚老化病症的實例包括年齡相關性斑點、色斑、皺紋、光 老化皮膚或血管生成斑。在本發明的方法的另一個實施方案中,TOR抑制劑的施用是為了 延長個體的健康壽命。
[0109] 本發明的方法可用於抑制細胞或機體事件。在本發明的一個實施方案中,被抑制 的細胞事件是細胞衰老。在本發明的另一個實施方案中,被抑制的細胞事件是細胞肥大。在 本發明的另一個實施方案中,被抑制的細胞事件是機體衰老。
[0110] 涉及mTOR的年齡相關性疾病的其它實例已得到證明,包括:良性前列腺增生 (BPH)、良性前列腺肥大、良性前列腺腫大(BEP)、包括胰島素抵抗和其併發症的代謝綜合 症、肥胖(尤其是腹部肥胖)、血壓升高、血栓症、高血壓和動脈粥樣硬化、心肌肥厚和骨質 疏鬆症。關於特定的神經退行性疾病,已經表明,mTOR路徑通過增加 τ蛋白合成而與阿 爾茨海默氏症有關聯(Li等人,2005)。另外,血液淋巴細胞中活化的mTOR與記憶力和 認知下降之間的相互關係已經在罹患阿爾茨海默氏病的個體中得到了證明(Paccalin等 人,2006)。
[0111] 癌症的非限制性實例包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、腦癌、肝癌、宮頸癌、結 腸癌、腎癌、皮膚癌、頭頸癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睪丸癌、 淋巴瘤或白血病。癌症的其它具體實例包括鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺瘤、腺癌、皮革胃、 胰島素瘤、胰高血糖素、胃泌素、血管活性腸肽瘤、膽管癌、肝癌、腺樣囊性癌、類癌腫瘤、泌 乳素、嗜酸細胞瘤、許爾特累氏細胞瘤、腎細胞癌、子宮內膜腺瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、華 生氏瘤、胸腺瘤、泡膜細胞瘤、粒層細胞瘤、男性細胞瘤、卵巢含睪丸母細胞瘤、副神經節瘤、 嗜鉻細胞瘤、血管球瘤、黑素瘤、軟組織肉瘤、促纖維增生性小圓細胞腫瘤、纖維瘤、纖維肉 瘤、黏液瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肌瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉 瘤、多形性腺瘤、腎母細胞瘤、卵巢布倫納氏瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、無性細胞瘤、生殖細胞腫 瘤、胚胎癌、卵黃囊瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫、絨毛膜癌、透明細胞癌、血管瘤、血管瘤、血管肉 瘤、血管肉瘤、血管內皮瘤、血管內皮細胞瘤、卡波濟氏肉瘤、血管外皮細胞瘤、淋巴管瘤、囊 狀淋巴管瘤、骨瘤、骨肉瘤、骨軟骨瘤、軟骨外生骨疣、軟骨瘤、軟骨肉瘤、骨巨細胞瘤、尤因 氏肉瘤、牙源性腫瘤、牙骨質母細胞瘤、釉細胞瘤、顱咽管瘤、膠質瘤、混合性少突星形細胞 瘤、室管膜瘤、星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、少枝膠質細胞瘤、神精上皮腫瘤、神經母細胞瘤、 視網膜母細胞瘤、腦膜瘤、神經纖維瘤、多發性神經纖維瘤、神經鞘瘤、神經鞘瘤、神經瘤、顆 粒細胞瘤、腺泡狀軟肉瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病、小淋巴細胞淋巴 瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、縱隔(胸腺)大細胞淋巴 瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、濾泡 淋巴瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤黏膜相關淋巴組織(麥芽淋巴瘤)、淋巴結邊緣區B細胞 淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、塞扎裡症候群症候群、外周T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴 瘤、皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋 巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、原發性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤、急NK細 胞淋巴瘤、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤、肥大細胞瘤、肥大細胞肉瘤、肥大細胞增多症、肥大細 胞白血病、朗格漢斯細胞組織細胞增生症、組織細胞肉瘤、朗格漢斯細胞肉瘤樹突狀細胞肉 瘤、濾泡樹突細胞肉瘤、瓦爾登斯特巨球蛋白血症、淋巴瘤樣肉芽腫、急性白血病、淋巴細胞 性白血病、急性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人T細胞 白血病/淋巴瘤、漿細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病、B細胞幼淋巴細胞白血病、T 細胞幼淋巴細胞白血病、前體B淋巴細胞白血病、前體T淋巴細胞白血病、急性紅白血病、淋 巴肉瘤細胞白血病、骨髓性白血病、髓細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、慢性髓細胞性 白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性粒細胞白血病、嗜鹼性細胞 白血病、嗜酸性粒細胞白血病、急性嗜鹼性白血病、急性髓系白血病、慢性髓細胞性白血病、 單核細胞白血病、急性單核和單核細胞白血病、急性巨核細胞白血病、急性髓系白血病和骨 髓增生異常綜合症、綠色瘤或粒細胞肉瘤、急性全髓增生症伴骨髓纖維化、毛細胞白血病、 少年粒細胞白血病、侵襲性自然殺傷細胞性白血病、真性紅細胞增多症、骨髓增生性疾病、 慢性特發性骨髓纖維化、原發性血小板增多症、慢性中性粒細胞白血病、慢性嗜酸性粒細胞 白血病/嗜酸細胞增多綜合症、移植後淋巴組織增生性疾病、慢性骨髓增生性疾病、骨髓增 生異常/骨髓增生性疾病、慢性粒細胞白血病和骨髓增生異常綜合症。在某些實施方案中, 過度增生病變是可以影響受試對象口腔的疾病。實例包括黏膜白斑病、鱗狀細胞增生性病 變、上皮癌變前病變、上皮內瘤病變、局灶性上皮增生和鱗狀細胞癌病變。
[0112] 本發明的微膠囊可用於治療考慮使用mTOR抑制劑的任何疾病。以下美國專利公 開了雷帕黴素的各種性質和用途,且以引用的方式併入本文。美國專利第5, 100, 899號公 開了雷帕黴素對移植排斥反應的抑制作用;美國專利第3, 993, 749號公開了雷帕黴素的抗 真菌特性;美國專利第4, 885, 171號公開了雷帕黴素針對淋巴白血病、結腸癌和乳腺癌、黑 素癌和室管膜母細胞瘤的抗腫瘤活性;美國專利第5, 206, 018號公開了雷帕黴素對惡性乳 腺癌、皮膚癌和中樞神經系統腫瘤的治療;美國專利第4, 401,653號公開了在腫瘤治療中 雷帕黴素和畢西巴尼(picibanil)的聯合使用;美國專利第5, 078, 999號公開了用雷帕黴 素治療系統性紅斑狼瘡的方法;美國專利第5, 080, 899號公開了用雷帕黴素治療肺部炎症 的方法,此方法可用於緩解肺部炎症作為組成部分的疾病(即哮喘、慢性阻塞性肺病、肺氣 腫、支氣管炎和急性呼吸窘迫綜合症)的症狀;美國專利第6, 670, 355號公開了雷帕黴素 在治療心血管、腦血管或外周血管病上的使用;美國專利第5, 561,138號公開了雷帕黴素 在治療免疫相關性貧血上的使用;美國專利第5, 288, 711號公開了用雷帕黴素預防或治療 過度增生血管疾病的方法,所述血管疾病包括內膜平滑肌細胞增生、再狹窄和血管堵塞;以 及美國專利第5, 321,009號公開了雷帕黴素在治療胰島素依賴型糖尿病上的使用。總的 來說,可通過施用雷帕黴素或雷帕黴素衍生物而得到改善、治療、治癒或預防的任何疾病都 可通過施用本文中所述的微膠囊而得到治療。此類疾病的非限制性實例包括器官或組織 移植排斥反應、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病和炎症性疾病、關節炎(例如類風溼關節 炎、進行性慢性關節炎(arthritis chronica progrediente)和關節炎畸形)和風溼性疾 病、自身免疫性疾病、自身免疫性血液病、系統性紅斑狼瘡、硬皮病、韋格納肉芽腫(Wegener granulamatosis)、皮肌炎、慢性活動性肝炎、重症肌無力、牛皮癬、史蒂芬-詹森綜合症 (Steven-Johnson syndrome)、特發性口炎性腹瀉、自身免疫性炎症性腸道疾病(包括潰瘍 性結腸炎和克羅恩病(Crohn's disease))、內分泌眼病變、格雷夫斯病(Graves disease)、 結節病、多發性硬化症、原發性膽汁性肝硬化、少年糖尿病葡萄膜炎、乾燥性角結膜炎、春季 角結膜炎、肺間質纖維化、牛皮癬關節炎、腎小球腎炎、常染色體顯性多囊腎病、幼年皮肌 炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺氣腫、支氣管炎和急性呼吸窘迫綜合症、腫瘤、過度增生皮膚 病、真菌感染、乾眼症、血管疾病、糖尿病和眼部疾病(如由於年齡相關性黃斑變性而導致 的眼部血管新生疾病)。
[0113] 3.預防性治療
[0114] 本文闡述的方法的某些實施方案涉及預防受試對象的疾病或健康相關性病症的 方法。預防策略在現代醫學中至關重要。
[0115] 根據劑量、治療次數和治療持續時間,欲施用的醫藥組合物的數量取決於欲治療 的受試對象、受試對象的狀況、所要預防的疾病的性質和期望的保護措施。治療組合物的精 確用量也取決於醫師的判斷,並且是因人而異的。例如,組合物的使用頻率可以是一天一 次、一天兩次、一周一次、一周兩次或一個月一次。治療持續時間可從一個月到一年或者更 長。再者,精確的預防方案會高度依賴於受試對象、風險因素的性質和醫師的判斷。
[0116] F.組合物
[0117] 本文闡述的某些方法涉及包括施用含有本發明微膠囊的組合物的方法。
[0118] 本文所使用的"藥學上可接受的載劑"包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、 表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩劑、鹽、防腐劑、藥 物、藥物穩定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、類似物質和 其組合,這將為所屬領域技術人員所知(Remingt 〇n'sl990)。除非與活性成分不相容,否則 任何常規載劑在治療或醫藥組合物中的使用都是可以考慮的。本發明中所使用的組合物可 包含不同類型的載劑,取決於此組合物是以固體、液體還是氣溶膠形式施用,以及所述施用 途徑是否像注射一樣需要無菌。
[0119] 所述介質和藥劑關於醫藥活性物質的使用在所屬領域中是眾所周知的。除非與活 性成分不相容,否則任何常規介質或藥劑在治療組合物中的使用都是可以考慮的。輔助活 性成分也可以被併入到組合物中,並且將會在下文中進行詳細討論。對於人的施用,如FDA 生物製品標準中所要求的,製劑應滿足無菌、熱原性、一般安全和純度標準。
[0120] 製劑可根據給藥途徑而進行變動。對於以水溶液形式腸外施用,例如,必要時溶液 應該適當地進行緩衝,並用足量的鹽水或葡萄糖首先使液體稀釋劑變得等張。在這方面,根 據本公開書,可以採用的無菌水性介質為所屬領域技術人員所知。
[0121] 在某些實施方案中,醫藥組合物包含至少約0. 1重量%的活性化合物。在其它的 實施方案中,醫藥組合物包含約2重量%至約75重量%的組合物,或介於約25重量%至約 60重量%之間的組合物,和任何可自其引申的範圍。
[0122] 本發明的醫藥組合物可包含各種抗氧化劑以延緩一種或多種組分的氧化。另外, 可用防腐劑預防微生物作用,如各種抗菌劑和抗真菌劑,包括(但不限於)對羥基苯甲酸酯 (如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。組 合物在製造和儲存條件下必須穩定,並經歷防腐操作以防止微生物如細菌和真菌的汙染作 用。
[0123] L給藥途徑
[0124] 可以使用所屬領域技術人員所知的任何方法將微膠囊施用於受試對象。例如,醫 藥有效量的組合物可在以如下途徑施用的包含水性介質的組合物中施用:靜脈內、腦內、顱 內、鞘內、進入黑質或黑質區域、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、氣管內、鼻腔內、局部、肌肉 內、腹膜內、皮下、口服、局部、局地、吸入(如氣溶膠吸入)、注射、輸液、連續輸液、直接局部 灌注靶細胞、通過導管、通過灌洗、以乳劑形式、以脂質組合物形式(如脂質體)或通過其它 方法或上述各種方法的任何組合,這將為所屬領域技術人員所知(Remington's, 1990)。微 膠囊的固體組合物可通過口服施用。
[0125] 在具體的實施方案中,使用藥物遞送裝置對受試對象施用組合物。任何藥物遞送 裝置都可以被考慮用於遞送醫藥有效量的mTOR抑制劑。
[0126] 2.劑量
[0127] mTOR抑制劑的醫藥有效量是基於預期目標來確定。根據治療的次數和劑量,給藥 量取決於欲治療的受試對象、受試對象的狀態、期望的保護措施和給藥途徑。治療劑的精確 量也取決於醫師的判斷,並且也是因人而異的。
[0128] 欲施用的雷帕黴素或雷帕黴素類似物的量取決於所要治療的疾病、期望持續時間 的長度和植入物的生物利用率概況以及給藥部位。一般來說,有效量是在病人主治醫生的 判斷和學識範圍之內的。給藥指導包括雷帕黴素或雷帕黴素類似物的劑量是約〇. oimg至 約 500mg。
[0129] 例如,mTOR抑制劑的劑量可以是每次劑量約0. OOOlmg至約1. Omg,或約0. OOlmg 至約0. lmg,或約0. lmg至約l.Omg,或甚至約10mg等。也可以施用多個劑量。在一些實施 方案中,劑量是至少約〇. 〇〇〇lmg。在其它實施方案中,劑量是至少約0. OOlmg。在其它實施 方案中,劑量是至少O.Olmg。在其它實施方案中,劑量是至少約0. lmg。在更具體的實施方 案中,劑量可以是至少l.Omg。在甚至更具體的實施方案中,劑量可以是至少10mg。在其它 實施方案中,劑量是至少l〇〇mg或更高。
[0130] 在其它非限制性實例中,每次施用的劑量可還包括約1 μ g/kg/體重、約5μ g/kg/ 體重、約10 μ g/kg/體重、約50 μ g/kg/體重、約100 μ g/kg/體重、約200 μ g/kg/體重、約 350 μ g/kg/體重、約 500 μ g/kg/體重、約 lmg/kg/體重、約 5mg/kg/體重、約 10mg/kg/體重、 約 50mg/kg/ 體重、約 100mg/kg/ 體重、約 200mg/kg/ 體重、約 350mg/kg/ 體重、約 500mg/kg/ 體重至約1,〇〇〇mg/kg/體重或以上,以及自其可引申的任何範圍。在本文所列數字的引申 範圍的非限制性實例中,可以施用的範圍是約5mg/kg/體重至約100mg/kg/體重、約5μ g/ kg/體重至約500mg/kg/體重等,這基於上述數字。
[0131] 當所屬領域技術人員確定有需要時,劑量可以重複。因此,在本文所闡述的方法的 一些實施方案中,可以考慮使用單劑量。在其它實施方案中,可以考慮使用兩個或兩個以上 的劑量。在對受試對象施用一個以上的劑量時,劑量之間的時間間隔可以是所屬領域技術 人員所確定的任何時間間隔。例如,劑量之間的時間間隔可以是約1小時至約2小時、約2 小時至約6小時、約6小時至約10小時、約10小時至約24小時、約1天至約2天、約1周 至約2周或更長,或在這些引用的範圍的任一個內可引申的任何時間間隔。
[0132] 在某些實施方案中,可能需要對病人連續提供醫藥組合物。此可以通過插入導管, 隨後連續施用治療劑來完成。給藥可以在手術中或手術後。
[0133] 3.次級治療
[0134] 本發明的某些實施方案提供一種或多種次級治療形式的施用或應用。治療類型取 決於被治療或預防的疾病的類型。次級治療形式可以是施用一種或多種的次級藥理劑,它 可以被應用於治療或預防與衰老相關的疾病,包括上述任何疾病。
[0135] 如果次級治療是藥理劑,那麼它可以先於、同時或接著mTOR抑制劑的施用而施 用。
[0136] mTOR抑制劑和次級治療之間的間隔可以是由所屬領域技術人員所確定的任何間 隔。例如,間隔可以是數分鐘至數周。在藥劑分開施用的實施方案中,一般應確保在每次遞 送時間之間不會間隔過長的時間,以便於每種治療劑仍可以對受試對象發揮有利的聯合作 用。例如,治療劑之間的間隔可以是相互間隔約12小時至約24小時;更優選相互間隔約6 小時至約12小時。在一些情況中,可能需要顯著延長治療的時限,但是,在分別給藥之間會 間隔幾天(2、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)。在一些實施方案中,次級治療劑 的施用時機的確定是以受試對象對mTOR抑制劑的反應為依據。
[0137] 實施例
[0138] 以下實施例用於說明本發明的優選實施方案。所屬領域技術人員應了解,以下實 施例中所公開的技術代表發明人所發現的在本發明實施中表現良好的技術,且因此可被視 為構成其優選實施模式。但是,根據本公開書,所屬領域技術人員應了解,在不脫離本發明 的精神和範圍的情況下,在公開的特定實施方案中可以做許多修改,並且仍可獲得相同或 類似的結果。
[0139] 實施例1
[0140] 通討對20月齡的遺傳異質小鼠餵會雷帕霍素來延長壽命
[0141] 方法
[0142] 小鼠的繁葙、餵養和壽命估算.在三個試驗場的每個場中,通過將CB6F1雌鼠與 C3D2F1雄鼠進行交配來繁殖小鼠,從而繁殖遺傳異質群體。用於健康監測的方法的細節先 前已有報導(Miller等人,2007);簡單地說,每年4次評估三個群體的每個中的傳染性病 原體(包括蟯蟲)情況。在整個研究期間,所有此類試驗都呈陰性。在六個月的試驗期內, 每個試驗場每月都招收數量大致相同的19至21日齡的斷奶幼鼠,每個籠子住3隻雄鼠或4 只雌鼠。每個場中製造者所要求使用的食物是以NIH-31標準為依據,此標準是關於養殖籠 以及斷奶和實驗性食物開始之間的時間,具體如下:關於養殖籠,UM使用的是Purina5008, UT使用的是Teklad7912,TJL使用的是Purina5K52。關於在4月齡之前的斷奶幼鼠,UM使 用的是Purina5008, UT使用的是Teklad7912,且TJL使用的是Purina5LG6。當在4月齡開 始時,所有三個場中對照組、依那普利(Enalapril)組和CAPE組的小鼠接受Purina5LG6,不 使用添加劑(對照組)或使用測試劑。雷帕黴素組的小鼠仍然保持斷奶飲食,直到在600 日齡開始接受含有雷帕黴素的Purina5LG6。對照組小鼠和用雷帕黴素治療的小鼠各自的 群組在一年後以相同的方式進行確立,再次在每個試驗場,但是雷帕黴素是從270日齡開 始使用,而不是600日齡。其它的餵養細節(包括施加於每組中子集的T細胞亞群分布和 活性的臺帳(accounts of tests)細節)已在其它文獻中作出了說明(Nadon等人,2008)。 主要終點是死亡時的年齡(在每天的檢測中被發現死亡的小鼠)或安樂死時的年齡(被認 為不可能再活48小時以上的小鼠)。
[0143] 從長壽群體中移除小鼠 .幾乎平均分配在三個試驗場中的群組2005研究群體最 初由1960隻小鼠組成,其中674隻被分配給對照組,317隻至328隻被分配給四個治療組 中的每一組。在它們中,有51隻小鼠從研究中被移除,原因是打架(31隻小鼠)、意外死亡 (如植入晶片或籠子進水;13隻小鼠)或技術性失誤(性別分配或飲食選擇上的失誤;7隻 小鼠)。為了進行生存分析,在這些小鼠從治療方案中移除的日期,將它們作為活的小鼠來 對待,且此後不再對其進行跟蹤。這些被審查的小鼠不被納入中位數壽命的計算中。
[0144] 死亡時年齡的估算(壽命).至少每天對小鼠不健康的病徵進行檢查,如果它們是 嚴重垂危的,且經驗豐富的技術人員認為它們接下來不可能生存超過額外48小時,出於人 道原因,對它們實施安樂死。如果小鼠表現出一種以上的下列臨床病徵,即被認為是嚴重垂 危的:(a)沒有能力吃喝;(b)嚴重的嗜睡,表現為缺乏反應,例如當用鑷子輕刺時不願意移 動;(c)嚴重的平衡或步態失調;(d)在超過一周或更長的時期內體重迅速下降;或(e)嚴 重的潰瘍性或出血性腫瘤。垂危小鼠被實施安樂死時的年齡被視為其自然壽命最好的可用 估計值。在每次的日檢查中被發現死亡的小鼠也會被記錄下來。屍體將被保存作為以後分 析之用,將在別處報導。
[0145] 對照和實騎飲食.TestDiet公司(Richmond, IN)準備了多批含有每種測試物 質的Purina5LG6食物和對照飲食,間隔大約120天,並將每批食物在同一時間運送到三 個試驗場中的每一個。依那普利是從Sigma(目錄E6888-5G)購買,其用量是每千克食 物120毫克;假設小鼠平均體重為30克且每天消耗5克食物,那麼此劑量每天每千克體 重供應20毫克依那普利。CAPE (即咖啡酸苯乙酯)是從Cayman購買(Ann Arbor, MI ;目 錄70750),其用量是以下兩種劑量中的任一個:高劑量是每千克食物300毫克(每天每 千克體重50毫克),低劑量是每千克食物30毫克(每天每千克體重5毫克)。對依那普 利進行試驗是因為在高血壓、肥胖、糖尿病以及充血性心力衰竭的老年人和嚙齒類動物模 型中,已經報導了依那普利可以改善這些病症中的許多病症。對CAPE進行試驗是因為此 藥劑已被報導具有抗氧化性、抗炎性和免疫調節功能,同時對轉化細胞和腫瘤細胞有特異 性毒性。被餵食依那普利或CAPE的小鼠的壽命在圖1中與對照組和被餵食雷帕黴素的 小鼠進行了對比。雷帕黴素是從LC實驗室(Woburn,MA)購買。雷帕黴素由Southwest Research Institute(San Antonio, TX)使用旋轉盤霧化包衣工藝進行微膠囊化,腸溶衣材 料是Eudragit S100 ( R5hm Pharma, Germany)。此甲基丙烯酸酯聚合物在pH值低於7時 是穩定的,因此保護雷帕黴素在胃的酸性條件下不受損壞;此保護性包衣在小腸中溶解,從 而允許對活性劑的吸收。此熱塑性包衣材料使雷帕黴素耐受食物製備過程的部分提高了 3 至4倍。因為此包衣材料只有在非酸性條件下才溶於水,因此膠囊化的雷帕黴素是在小腸 中被釋放,而不是在胃中。先導研究表明膠囊化的雷帕黴素導致血濃度是同等劑量的未膠 囊化的雷帕黴素所得到的血濃度的大約10倍。膠囊化的雷帕黴素的給藥量是每千克食物 14毫克(每天每千克體重2. 24毫克雷帕黴素)。膠囊化的雷帕黴素接著被併入到5LG6小 鼠食物中,並且被分配到所有三個試驗場。
[0146] 雷帕黴素的測量.雷帕黴素是從LC實驗室(Woburn, MA)獲得。32-去甲氧基雷 帕黴素(32-RPM)是從Sigma化學品公司(St.Louis,M0)獲得。HPLC級甲醇和乙腈是從 Fisher(Fair Lawn, NJ)購買。所有其它試劑是從Sigma化學品公司(St.Louis, M0)購買。 Milli-Q水被用於所有溶液的製備。HPLC系統由Waters510HPLC泵、Waters717自動進樣 器、Waters2487 紫外檢測器和 Waters Empower 色譜軟體組成(Waters, Milford, MA)。HPLC 分析柱是從 Alltech (Deerfield, IL)購買的 Grace Alltima C18 (4. 6 X 150mm,5 微米)。流 動相是64% (v/v)乙腈和36%水。流動相的流速是1.5ml/min,且吸光度的波長是278nm。 在色譜運行期間HPLC分析柱的溫度維持在70°C,使用的是Eppendorf CH-30柱加熱器。將 雷帕黴素和32-RPM粉末溶解於甲醇中,濃度為lmg/ml,並在80°C進行分裝儲存。每天用甲 醇原液來製備濃度為1 μ g/ml的工作原液,並用於摻加校準樣。每天所製備的校準樣通過 用原液摻加全血或小鼠食物而得到,且最終濃度為〇、4、8、12、100和200ng/ml。
[0147] 使用裝有UV檢測的HPLC對小鼠血液中的雷帕黴素進行定量。簡單地說,將0. 5mL 校準樣和未知樣品與75 μ L的1. 0 μ g/mL32-去甲氧基雷帕黴素(內標)、1. OmL ZnS04 (50g/ L)和1. OmL丙酮進行混合。將這些樣品劇烈渦旋振蕩20秒後在2600g和23°C溫度下離心 5分鐘(接下來的離心作用在相同條件下進行)。上層液被移至乾淨的試管中,然後加入 200μ?的100mM氫氧化鈉,接著渦旋振蕩。接著,加入2mLl-氯丁燒,將樣品加蓋,渦旋振 蕩(1分鐘)並離心。上清液被移至l〇mL的玻璃管中,在環境溫度下、氮氣流中乾燥得到殘 餘物。將乾燥提取物溶解在750yL流動相中,然後將2mL己烷加入到每個試管中。將試管 加蓋,渦旋振蕩30秒,並離心2分鐘。將己烷層移除並丟棄。剩餘的提取物在氮氣中乾燥 並在250 μ L流動相中進行重構,然後將200 μ L最終的提取物注射進HPLC。雷帕黴素的峰 面積與每種未知樣品的內標的峰面積(反應比)的比率與校準樣反應比的線性回歸進行對 t匕,從而對雷帕黴素進行定量。雷帕黴素的濃度可表示為ng/mL全血。
[0148] 小鼠食物中雷帕黴素的含量使用裝有UV檢測的HPLC進行鑑定。簡單地說,對 於摻加的校準樣和未知樣品,l〇〇mg食物用研缽和杵進行粉碎,然後與20 μ L的100 μ g/ mL32-RPM(內標)和0. 5mL甲醇一起劇烈渦旋振蕩。然後將樣品機械搖動10分鐘。接著加 入0. 5mL Millipore水,並將樣品劇烈渦旋振蕩20秒。樣品離心10分鐘後,將40 μ L樣品 注射進HPLC。在食物中雷帕黴素濃度為0、2、4、8、10和20ng/mg時,將雷帕黴素的峰面積和 內標的峰面積的比率(反應比)與校準樣反應比的線性回歸進行對比,從而對雷帕黴素進 行定量。食物中雷帕黴素的濃度可以表示為ng/mg食物(百萬分率)。
[0149] 雷帕黴素的有效件.為了分析mTORCl下遊效應分子的狀態,在小鼠的內臟脂肪組 織裂解液中,測量作為S6激酶1底物的核糖體蛋白S6(Ser240/244)的磷酸化作用,所述 小鼠用膠囊化的雷帕黴素食物餵食了 420天或用帶有空微膠囊的對照食物餵食。解剖組 織並在液氮中速凍後儲存在_8〇°C下,在液氮中磨成粉並溶解於10倍體積的緩衝液(50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、120mM氯化鈉、1 % NP-40、ImM EDTA、50mM NaF、40mM2-磷酸甘油、0· ImM原 釩酸鈉(pH10)、lmM苯甲脒和IX完整蛋白酶抑制劑混合液(Roche))中。經過超聲處理和 微量離心後,對裂解液定量,30。40μ g來自每種提取物中的可溶性蛋白質被加樣至4-12% 梯度的PAGE上,並在5V下電泳過夜。接著將凝膠轉移至硝酸纖維素膜中(乾燥過程), 阻斷並與一級抗體[S6核糖體蛋白(5G10)兔單克隆抗體,目錄號2217 ;磷酸化S6核糖體 蛋白(Ser235/236)抗體,目錄號 2215;和 Pan-Actin 抗體,目錄號 4968 ;Cell Signaling Technologies, Danvers ΜΑ] -起培養,接著與二級抗體[抗兔IgG,(H+L),過氧化物酶結合 抗體,目錄號31460 ;Pierce, Rockford IL] -起培養,以便通過化學突光進行檢測。每個免 疫印跡的信號強度使用柯達影像站(Kodak Image Station)來捕獲,並使用柯達1D圖像分 析軟體來分析。
[0150] MM.
[0151] 在位於三個協同研究場所中每個場所的雄性和雌性小鼠中,通過從600日齡開始 餵食膠囊化的雷帕黴素,小鼠的中位數和最長壽命得到了延長(圖2)。此數據組與2% (1,901中的38)還活著的小鼠一起進行了分析。對於場所間所匯總的數據,對數秩檢驗否 定了治療組和對照組沒有差異的無效假設(P < 0.0001);在雄性和雌性中,餵食雷帕黴素 的小鼠都比對照組(P < 0. 0001)活得更長。表示為平均壽命,在匯總的數據組中效應值是 雄性為9%和雌性為13%。表示成在600日齡時(首次接觸雷帕黴素的年齡)的壽命期望, 效應值是雄性為28%和雌性為38%。平行評價的用其它藥劑(依那普利和CAPE(咖啡酸 苯乙酯))進行治療的小鼠與使用同等劑量的對照組小鼠沒有區別(圖1)。
[0152] 然後,餵食雷帕黴素的小鼠和對照小鼠就場所和性別的每個組合進行單獨對比。 相比於對照組,雷帕黴素組始終具有優勢,P值在0.03至0.0001的範圍內(圖3)。在餵食 雷帕黴素後,所有三個場所的雌性小鼠都提高了存活率(圖3)。雌性小鼠的平均壽命提高 了 15%、16%和7% (分別是TJL、UM和UT),且在三個場所中在600日時的壽命期望對於雌 性提高了 45%、48%和22%。雌性對照組的中位數壽命估算值在場所間保持一致(881天至 895天),且與2004群組中記錄的值相似,其範圍為858天至909天(Miller等人,2007)。 因此,餵食雷帕黴素的雌性小鼠中所觀察到的存活率提高對於雌性對照組的低存活率來說 不是假象。所有三個場所的雄性小鼠在餵食雷帕黴素後也提高了存活率(圖3)。雄性小 鼠的平均壽命增加了 5%、8%和15% (分別是TJL、UM和UT),並且在600日時的雄性壽 命期望分別增加了 16%、23%和52%。解釋由於各場所之間雄性對照組存活率的差異進 行解釋而複雜化,並且因為在UT以及可能在UM分配給餵食雷帕黴素組的小鼠在600日齡 之前的死亡率比對照組低。在UT和UM,對照組小鼠與那些餵食雷帕黴素的小鼠有差異,不 僅表現在從600日齡開始接觸雷帕黴素,同時也表現在斷奶和600日齡期間使用的具體配 方的小鼠食物(所有食物都以NIH-31標準為依據)。因此,不能排除雷帕黴素提高了位於 UT和UM的雷帕黴素組中雄性小鼠的存活率的可能性,其可能反應了在600天之前在營養 或健康狀態下對照組與雷帕黴素組之間的差異,而不僅僅是雷帕黴素的效應。顯而易見的, 雷帕黴素對在T幾的雄性(和雌性)存活率的顯著效應不可能受到施用藥物之前的食物的 影響,因為在這段期間位於T幾中的對照小鼠和餵食雷帕黴素的小鼠都食用了同樣的食物 (Purina5LG6)。最長壽命通過餵食雷帕黴素而得到了提高。表1顯示了對照小鼠和雷帕黴 素治療的小鼠中第90百分數的年齡,同時也顯示了對照組95%的上置信界限。
[0153] 表1雷帕黴素對最長壽命的作用
[0154]
【權利要求】
1. 雷帕黴素在製備用於治療有需要的哺乳動物受試對象中年齡相關性疾病或阻止有 需要的哺乳動物受試對象中年齡相關性疾病發作或延長有需要的哺乳動物受試對象壽命 的醫藥組合物或保健組合物中的用途,其中所述組合物被包裹於包含水不溶性聚合物的包 衣中,其中所述水不溶性聚合物是甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物。
2. 權利要求1所述的用途,其中所述有需要的受試對象已知或疑似患有年齡相關性疾 病。
3. 權利要求1所述的用途,其中所述有需要的受試對象已知患有年齡相關性疾病。
4. 權利要求1所述的用途,其中所述組合物包含25重量%至60重量%的雷帕黴素,其 中在施用所述組合物後受試對象中雷帕黴素的平均血液含量大於25ng/ml,並且其中所述 受試對象是大於50歲的人。
5. 雷帕黴素在製備用於在需要治療腺瘤或延遲腺瘤發作或延長壽命的哺乳動物受試 對象中治療腺瘤或延遲腺瘤發作或延長壽命的醫藥組合物的製劑或保健組合物的製劑中 的用途,其中所述哺乳動物對象具有以下一種或多種病症:所述哺乳動物受試對象已知處 於患有腺瘤的風險;所述哺乳動物受試對象疑似處於患有腺瘤的風險;所述哺乳動物受試 對象以前接受過顯示腺瘤風險的疾病、病症或紊亂的治療;所述哺乳動物受試對象具有與 腺瘤風險相關的遺傳風險因素;所述哺乳動物受試對象具有與腺瘤風險相關的環境風險因 素;或所述哺乳動物受試對象具有與腺瘤風險相關的其它風險因素; 所述醫藥組合物的製劑或保健組合物的製劑包含雷帕黴素和水不溶性的甲基丙烯酸 甲酯-甲基丙烯酸共聚物的組合,所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物是熱塑性的, 所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物在pH值低於7時是穩定的,所述甲基丙烯酸甲 酯-甲基丙烯酸共聚物能夠保護雷帕黴素在所述哺乳動物受試對象的胃的酸性條件下不 受損壞,並且所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物在所述哺乳動物受試對象的腸中的 非酸性條件中是可溶的,從而允許在腸中吸收所述雷帕黴素,所述製劑被製備為口服施用 給哺乳動物受試對象。
6. 權利要求5的用途,其中所述製劑被製備為以每天至少一次的頻率施用一段時間。
7. 權利要求5的用途,其中, 所述製劑包含藥物遞送結構,所述藥物遞送結構包含核心,所述核心包含雷帕黴素; 所述核心在環境氣氛條件下為固體形式;並且 多個所述核心以這樣的方式被包含水不溶性的甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物 的包衣材料圍繞,使得所述多個核心和圍繞的甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物包衣聚 集在一起形成所述藥物遞送結構。
8. 權利要求7的用途,其中所述藥物遞送結構具有小於約50微米的直徑。
9. 權利要求7的用途,其中所述藥物遞送結構包含至少5%重量的雷帕黴素。
10. 權利要求7的用途,其中所述藥物遞送結構包含表面活性劑。
11. 權利要求7的用途,其中 所述藥物遞送結構具有小於約50微米的直徑; 所述藥物遞送結構包含至少5%重量的雷帕黴素;和 所述藥物遞送結構包含表面活性劑。
12. 權利要求11的用途,其中所述哺乳動物受試對象是人受試對象。
13. 權利要求12的用途,其中所述受試對象是大於50歲的人。
14. 權利要求12的用途,其中對於所述人受試對象,在口服施用一定量的所述製劑後 所觀察到的雷帕黴素的平均血液含量的峰值大於12ng/ml。
15. 權利要求11的用途,其中所述哺乳動物受試對象是動物受試對象。
16. 權利要求15的用途,其中所述製劑包含食物或食物添加劑。
17. 權利要求11的用途,其中所述製劑還包含親水的、可溶脹的、水凝膠形成材料,其 中所述組合物由包含水不溶性聚合物和親水性水滲透性劑的包衣包裹。
【文檔編號】A61K31/436GK104042612SQ201410287071
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2009年11月11日 優先權日:2008年11月11日
【發明者】Z·D·夏普, J·R·思創, V·加爾萬, S·奧多, H·惠勒 申請人:德克薩斯大學體系董事會, 西南研究所