一種利用天然的枯草芽孢桿菌製備β-甘露聚糖酶的方法

2023-10-05 05:16:24

專利名稱：一種利用天然的枯草芽孢桿菌製備β-甘露聚糖酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物生產酶的技術，尤其是涉及一種β -甘露聚糖酶的製備方法。
背景技術：
甘露聚糖的來源豐富，在魔芋粉、瓜爾膠、槐豆膠等中都有不同種類的甘露聚糖存在。主鏈甘露聚糖降解酶包括甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶。其中，最重要的是β -甘露聚糖酶。β -甘露聚糖酶是一類能夠水解含有β -1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露寡糖、甘露多糖的內切水解酶，它屬於半纖維素酶類，廣泛存在於動物、植物和微生物中。其中，微生物是甘露聚糖酶的主要來源，具有活性高、來源穩定等優點。隨著近年來對自然界半纖維素資源的開發，β-甘露聚糖酶的研究和開發進入一個新高潮，已在食品、醫藥、造紙、紡織印染、石油開採以及生物研究技術等方面得到了廣泛的應用。在石油開採領域，油田開採過程中，壓裂效果的好壞直接影響油田開發水平和經濟效益。水力壓裂是以植物膠(如瓜爾膠)為稠化劑的水基壓裂液體系，具有價廉、安全、 應用範圍廣等特點。但是，水力壓裂會損害水敏性儲存，以及由於殘渣、未破膠的濃縮膠和濾餅造成的導流能力的傷害。其中殘渣、未破膠的濃縮膠和濾餅造成的導流能力損害主要通過加入破膠劑來解決。常規的氧化破膠劑有很多的缺陷，比如在高溫下與壓裂液反應迅速，使壓裂液提前降解而失去輸送支撐劑的能力；可與遇到的任何的反應物如管材、地層基質和烴類反應，生成與地層不配伍的汙染物，造成地層傷害；氧化破膠劑還可能在到達目標裂縫前就消耗盡了，因而達不到破膠的目的。酶破膠劑是一種新型的破膠劑，與常規破膠劑相比，具有一系列的優點，如酶在反應過程中不與其它物質如壓裂液、管材等反應，具有高度專一性、降解高效性和無汙染等特性。如吳襟等人將諾卡氏菌形放線菌產生的甘露聚糖酶用於低溫(30 60°C )油井壓裂液的生物破膠劑，具有效率高、成本低、對地層傷害小、配膠工藝簡便等優勢。目前有關β -甘露聚糖酶製備的文獻報導較多。在利用芽孢桿菌產β -甘露聚糖酶方面，採用較典型的文獻(柴萍萍，韋贊等.中國農業大學學報，2005，10 (3) :77-80)報導的培養基培養天然枯草芽孢桿菌，測定最大酶活為2. 36U/ml。在提高酶產量方面，主要是圍繞甘露聚糖酶的編碼基因開展研究並通過基因工程構建產酶功能菌等，雖然獲得了較高的產量，但由於基因工程菌存在著性能不穩定和生態安全等問題，使得該技術的大量推廣受到一定限制。

發明內容
為了克服現有技術採用基因工程構建菌提高產量存在的性能不穩定和潛在的生態安全問題等技術缺陷，本發明要解決的技術問題是提供一種非基因工程的、用微生物培養來製備甘露聚糖酶的方法，該方法可以大大提高酶活。本發明的技術方案是，一種利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，該方法包括以下步驟
(1)採用含有魔芋精粉和複合氮源的培養基培養枯草芽孢桿菌HS0121 ；(2)將步驟(1)得到的培養液離心去除菌體細胞後獲得β -甘露聚糖酶粗酶液；所述培養基中魔芋精粉質量濃度為2. 5 5. 0% ；所述複合氮源包括濃度為80 140mmol/L的KNO3和濃度為0. 1 lwt%的蛋白腖。優選的是，所述培養基中含有Mn2+。Mn2+的加入可以進一步提高酶活。更優選地是，所述Mn2+濃度為5 20mmol/L。最佳的是，所述Mn2+濃度為6 9mmol/L。優選的是，所述培養基可以進一步含有KH2PO4 0. 001-lwt %, MgSO4 0. 001-0. 5wt%。根據本發明所述的利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，較好的是，所述的培養基中魔芋精粉質量濃度為3. 0 4. 5wt%。在一個優選的實施方案中，所述培養基中複合氮源由100 120mmol/L的KNO3和 0.5 蛋白腖構成。更優選地是，所述培養基包括魔芋精粉3. 5wt%,KN03 100mmol/L、蛋白腖1襯％和 Mn2+9mmol/L。本發明利用公開文獻(Xiang-YangLiu, Shi-Zhong Yang, Bo-Zhong Mu.Production andcharacterization of a C15-surfactin-0-methyl ester by a lipopeptide producing strain Bacillus subti1isHSOl21. Process Biochemistry44(2009) 1144-1151)報導的天然枯草芽孢桿菌HS0121製備β-甘露聚糖酶， 改進培養基配方，在現有產酶培養基中將魔芋精粉濃度提高，加入錳離子並採用KNO3和蛋白腖複合氮源培養，大大提高了芽孢桿菌HS0121發酵產酶的量，使酶活提高了近10倍，克服了現有技術採用基因工程構建菌提高產量存在的性能不穩定和潛在的生態安全問題等技術缺陷，收到了良好的技術效果。此外，該菌株所產甘露聚糖酶對瓜爾膠、槐豆膠、魔芋膠的降黏作用較為明顯，在低溫油井破膠、食品保健以及動物飼料中都有潛在的應用價值。
具體實施例方式酶活定義和測定方法如下酶活在實驗條件下，每分鐘水解底物產生Iymol相當於D-甘露糖的還原糖的酶量定義為1個β -甘露聚糖酶單位(U)。酶活測定方法取質量濃度為0. 5 %的槐豆膠底物溶液(pH = 6的Na2HPO4-NaH2PO4 緩衝液配製)0. 9mL，加入適當稀釋的粗酶液0. lmL，混勻後於55°C水浴反應lOmin，加入 2mLDNS試劑終止反應，沸水浴^iin顯色，冷卻定容，測定產生的還原糖量，在540nm處測定 OD值，以D-甘露糖作為標準，以預先滅活的粗酶液為對照。實施例1以培養基魔芋精粉2. 5 5.0% (wt% )、蛋白腖 0. (wt% ), KH2PO4 0.1% (wt% ),MgSO4O. 01% (wt% )為培養基，在 pH :7 7. 2、37°C、120r/min 培養枯草芽孢桿菌 HS0121，培養3 後，離心去細胞後獲得粗酶液。55°C下與酶液反應IOmin時測定最大酶活為 13. 16U/mL。
權利要求
1.一種利用天然的枯草芽孢桿菌製備β-甘露聚糖酶的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟(1)採用含有魔芋精粉和複合氮源的培養基培養枯草芽孢桿菌HS0121；(2)將步驟(1)得到的培養液離心去除菌體細胞後獲得β-甘露聚糖酶粗酶液； 所述培養基中魔芋精粉質量濃度為2. 5 5. 0% ；所述複合氮源包括濃度為80 140mmol/L的KNO3和濃度為0. 1 lwt%的蛋白腖。
2.根據權利要求1所述的利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述培養基中含有Mn2+。
3.根據權利要求2所述的利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述Mn2+濃度為5 20mmol/L。
4.根據權利要求2所述利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述Mn2+濃度為6 9mmol/L。
5.根據權利要求1所述的利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述培養基含有 KH2PO4 0. 001-lwt%, MgSO4 0. 001-0. 5wt%。
6.根據權利要求1所述的利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述的培養基中魔芋精粉質量濃度為3. 0 4. 5wt%。
7.根據權利要求1所述利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述的培養基中複合氮源由100 120mmol/L的KNO3和0. 5 Iwt %的蛋白腖構成。
8.根據權利要求1或2所述利用天然的枯草芽孢桿菌製備甘露聚糖酶的方法，其特徵在於所述培養基含魔芋精粉3. 5wt%,KN03 100mmol/L、蛋白腖Iwt%和Mn2+9mmol/L。
全文摘要
本發明提供了一種利用天然的枯草芽孢桿菌製備β-甘露聚糖酶的方法，該方法採用含有魔芋精粉和複合氮源的培養基培養枯草芽孢桿菌HSO121後，再將得到的培養液離心去除菌體細胞後獲得β-甘露聚糖酶粗酶液；所述培養基中魔芋精粉質量濃度為2.5～5.0％，複合氮源包括濃度為80～140mmol/L的KNO3和濃度為0.1～1wt％的蛋白腖。本發明通過優化培養基配方，利用天然枯草芽孢桿菌HSO121，來製備β-甘露聚糖酶，大大提高了枯草芽孢桿菌HSO121發酵產酶的量，收到了良好的技術效果。
文檔編號C12R1/125GK102154247SQ201110038699
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月15日 優先權日2011年2月15日
發明者劉金峰, 楊世忠, 牟伯中, 陳曉青 申請人:華東理工大學