線蟲的生物控制的製作方法

2023-10-05 02:30:59 2

線蟲的生物控制的製作方法
【專利摘要】提供了用於控制植物、植物部分和/或植物生長的場所中或其上的線蟲的方法，所述方法包括給需要防護所述線蟲的植物、植物部分或植物生長的場所施用有效量的短小芽胞桿菌、短小芽胞桿菌的突變體或短小芽胞桿菌的至少一種代謝物。具體地，所述短小芽胞桿菌可以是菌株QST2808。
【專利說明】線蟲的生物控制
[0001]發明背景
[0002]植物寄生線蟲引起對多種農作物的嚴重損害，每年導致據估計從5%至12%的全球農作物產率損失。線蟲對根的損傷是非常普遍的，導致具有較小的根系、在它們的葉中顯示礦物質不足的症狀以及容易枯萎的矮化植物。線蟲造成的損害也使植物易受多種植物致病性真菌和細菌引起的感染。
[0003]為了抵 抗和控制線蟲，農民通常使用化學殺線蟲劑。這些殺線蟲劑從氣體和液體燻煙消毒法(例如甲基溴化物和氯化苦)到有機磷酸鹽和氨基甲酸酯例如硫磷嗪和草氨醯的施用。這些化學殺線蟲劑的使用已進行了數十年。儘管化學殺線蟲劑在控制目標線蟲中具有有效性，但存在對這些方法的嚴重限制。一個限制是化學殺線蟲劑不能作用於已穿透根的線蟲。另一個限制是與化學殺線蟲劑的生產和使用相關的危害。化學殺線蟲劑是高度毒性的，並且可導致人中毒和死亡。因此，許多國家已限制和有時禁用某些殺蟲劑。例如，甲基溴化物因其臭氧耗損效應而在大多數國家被禁用。
[0004]由於這些限制和禁止，缺乏切實可行的線蟲解決方案。本公開內容提供了安全和有效的替代化學殺蟲劑的使用或減少其使用的工具。本公開內容在提供抑制線蟲至植物根內的穿透和阻止最終克服該最初屏障的那些線蟲成熟的解決方案中也是獨特的。
[0005]發明概述
[0006]本公開內容提供了用於控制植物寄生線蟲的方法和組合物。本公開內容提供了用於控制線蟲的方法，包括給植物、植物部分或植物的場所施用有效量的短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)、短小芽胞桿菌的突變體、短小芽胞桿菌的孢子或短小芽胞桿菌的代謝物和特別地短小芽胞桿菌QST2808、短小芽胞桿菌QST2808的突變體、短小芽胞桿菌QST2808的孢子或短小芽胞桿菌QST2808的代謝物。在一些實施方案中，將短小芽胞桿菌(例如，短小芽胞桿菌QST2808)作為包括短小芽胞桿菌、其代謝物和任選地殘留髮酵液的發酵產物來施用。
[0007]在一些實施方案中，目標線蟲是引起疾病的根結線蟲。在某些情況下，線蟲來自根結線蟲屬(Meloidogyne)的種類。本發明的組合物殺死根結線蟲的卵、減少根結線蟲植物穿透和/或抑制穿透植物的根結線蟲的成熟。
[0008]在其它實施方案中，目標線蟲是孢囊線蟲。在某些情況下，線蟲來自異皮線蟲屬(Heterodera)的種。在其它情況下，線蟲來自胞囊線蟲屬(Globodera)的種。
[0009]在一些實施方案中，將上述組合物與至少一種其它殺蟲劑例如殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺線蟲劑或除草劑混合。在一個實施方案中，殺蟲劑是殺線蟲劑。在某些實施方案中，將基於短小芽胞桿菌QST2808的殺線蟲劑與商購可得的配製的殺線蟲劑混合於罐中。在其它實施方案中，將基於短小芽胞桿菌的組合物(例如，短小芽胞桿菌QST2808)與至少一種其它殺蟲劑混合，隨後配製，以便多種活性物形成一種產物。
[0010]本公開內容還提供了本公開內容的任何組合物，所述組合物還包含配製惰性物或其它配製成分例如多糖(澱粉、麥芽糊精、甲基纖維素、蛋白質例如乳清蛋白、肽、樹脂)、糖(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂質(卵磷脂、植物油、礦物油)、鹽(氯化鈉、碳酸鈣、檸檬酸鈉)和矽酸鹽(粘土、無定形矽、煙霧/沉澱矽酸鹽、矽酸鹽)。在一些實施方案，例如其中將組合物用於土壤的那些實施方案中，本公開內容的組合物包含載體，例如水或礦物質或有機材料例如促進組合物至土壤的摻入的泥炭(peat)。在一些實施方案，例如其中將組合物用於種子處理或用作根浸潰的那些實施方案中，載體是促進組合物至種子或根的粘附的粘合劑或粘著劑。在其中將組合物用作種子處理的另一個實施方案中，配製成分是著色劑。在其它組合物中，配製成分是防腐劑。
[0011]在一些實施方案中，在種植之前，將組合物施用於植物、植物部分或植物的場所例如土壤。在其它實施方案中，在種植時施用組合物。在其它實施方案中，在種植後施用組合物。
[0012]在某些實施方案中，在施用組合物之前，進行下列步驟，包括鑑定植物或用於生長的植物場所需要處理。在一些實施方案中，鑑定包括確定:用於植物生長的場所超過線蟲侵染的經濟閾值(economic threshold)。
[0013]在一些實施方案中，本公開內容涉及包括短小芽胞桿菌及其用作殺線蟲劑的使用說明書的試劑盒。優選地，所述短小芽胞桿菌為短小芽胞桿菌QST2808。在一些實施方案中，這些說明書是產品標籤。在一些實施方案中，這些說明書是關於短小芽胞桿菌QST2808作為殺線蟲劑與化學殺線蟲劑組合使用的。在某些情況下，說明書指導用戶以低於化學殺線蟲劑的產品標籤所推薦的比率(當用作獨立的處理時)使用所述化學殺線蟲劑。
[0014]發明詳述
[0015]所有公開物、專利和專利申請，包括本文中的任何附圖和附錄通過引用併入，其引用程度就如同將每一個個別公開物或專利申請明確且個別地通過引用併入一樣。
[0016]下列描述包括可用於理解本公開內容的信息。其不是對本文中提供的任何信息是現有技術或與目前要求保護的發明相關的承認，或不是對明確或隱含地參考的任何公開物是現有技術的承認。
[0017]短小芽胞桿菌QST2808、其突變體、上清液和它們用於控制植物病原體和昆蟲的方法詳盡地描述於美國專利號6，245，551和6，586，231中；所述專利的每一個對於其教導的每件事明確且完整地通過引用併入本文。在這些美國專利中，菌株稱為NRRL N0.B-30087,其與QST2808同義。短小芽胞桿菌QST2808於1999年I月14日在國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯協議的條款下在登錄號B-30087下保藏在NRRL中。本說明書中對QST2808的任何提及是指短小芽胞桿菌QST2808。
[0018]術語「突變體」是指來源於短小芽胞桿菌的遺傳變體。在一個實施方案中，突變體具有短小芽胞桿菌的一個或多個或全部鑑定(功能)特徵。在另一個實施方案中，突變體具有短小芽胞桿菌菌株QST2808的一個或多個或全部鑑定(功能)特徵。在具體情況下，突變體或其發酵產物控制(作為鑑定功能特徵)至少線蟲以及親代短小芽胞桿菌(例如，親代短小芽胞桿菌QST2808菌株)。這樣的突變體可以是具有與短小芽胞桿菌、特別是與短小芽胞桿菌菌株QST2808具有大於約85%，大於約90%，大於約95%，大於約98%或大於約99%的序列同一性的基因組序列的遺傳變體。突變體可通過如下方式獲得:利用化學藥品或輻射處理短小芽胞桿菌細胞，特別地短小芽胞桿菌菌株QST2808細胞，或通過從一群這樣的細胞(例如具有噬菌體抗性或抗生素抗性的突變體)選擇自發突變體，或通過本領域技術人員公知的其它方法。在一些實施方案中，術語突變體不包括在swrA基因中具有功能突變的丟失的短小芽胞桿菌細胞。
[0019]本公開內容的組合物可通過按照本領域公知的方法(包括美國專利號6，245，551中描述的培養基和其它方法的使用)培養短小芽胞桿菌，具體地短小芽胞桿菌菌株QST2808來獲得。常規大規模微生物培養法包括深層發酵、固態發酵或液體表面培養。朝向發酵的終點，當營養物被耗盡時，短小芽胞桿菌細胞開始從生長期轉換成孢子形成期，以便發酵的終產物主要為孢子、代謝物和殘留髮酵介質。孢子形成為短小芽胞桿菌的自然壽命周期的部分，並且通常被響應於營養物限制的細胞引發。發酵被構造來獲得高水平的短小芽胞桿菌的菌落形成單位(「cfu」)和促進孢子形成。可直接使用由發酵產生的培養基中的細菌細胞、孢子和代謝物或通過常規工業方法例如離心、切向流過濾、深度過濾和蒸發來濃縮。發酵液和發酵液濃縮物在本文中都稱為「發酵產物」。本公開內容的組合物包括發酵產物。在一些實施方案中，通過透析過濾法洗滌濃縮發酵液以除去殘留髮酵液和代謝物。
[0020]使用常規乾燥處理或方法(包括但不限於噴霧乾燥、冷凍乾燥、盤式乾燥(traydrying)、流化床乾燥、 轉鼓式乾燥或蒸發)在添加或不添加載體的情況下乾燥發酵液或發酵液濃縮物。
[0021]所得乾燥產物還可例如通過研磨或造粒進一步加工，以獲得特定粒度(例如，約I至約5，000、約I至約2，500、約I至約500、約I至約250、約I至約100、約I至約50、約I至約25、約I至約10 μ m的平均粒度，或期望的和本領域已知的任何其它粒度或其範圍)或物理形式。還可在乾燥後添加下文中描述的載體。
[0022]本公開內容的芽孢桿菌屬(Bacillus)的新型變體和菌株的發酵液的無細胞製劑可通過本領域已知的任何方法例如發酵液的提取、離心和/或過濾來獲得。本領域技術人員將理解所謂的無細胞製劑可以不是不含細胞，而是大體上無細胞或基本上無細胞，這取決於用於除去細胞的技術(例如，離心的速度)。可乾燥所得無細胞製劑和/或利用幫助其對植物或植物生長介質的施用的組分來配製所述製劑。上述用於發酵液的濃縮法和乾燥技術也適用於無細胞製劑。
[0023]短小芽胞桿菌包括短小芽胞桿菌菌株QST2808的代謝物可按照美國專利號6，245，551中所示的方法來獲得。如本文中所用，術語「代謝物」可指半純的和純的或基本上純的代謝物，或指未與短小芽胞桿菌分離的代謝物。
[0024]上述用於配製發酵液的濃縮法和乾燥技術也適用於代謝物。
[0025]本公開內容的組合物可包括添加至包含細胞、無細胞製劑或代謝物的組合物以改善效力、穩定性和可用性和/或有利於加工、包裝和終端用戶應用的配製惰性物。這樣的配製惰性物和成分可包括載體、穩定劑、營養物或物理性質改性劑，可單獨地或組合地添加所述成分。
[0026]在一些實施方案中，載體可包括液體材料例如水、油和其它有機或無機溶劑以及固體材料例如礦物質、聚合物或生物來源的或通過化學合成產生的多聚體複合物。在一些實施方案中，載體是有利於組合物至植物部分例如種子或根的粘附的粘合劑或粘著齊Li。參見，例如，Taylor, A.G.，等人，「Concepts and Technologies of Selected SeedTreatments」 , Annu.Rev.Phytopatho1.28:321-339 (1990),將所述文獻針對其教導的每一件事明確且完整地通過引用併入本文。穩定劑可包括抗結塊劑、抗氧化劑、乾燥劑、保護劑或防腐劑。營養物可包括碳、氮和磷源例如糖、多糖、油、蛋白質、胺基酸、脂肪酸和磷酸鹽。物理性質改性劑可包括填充劑、溼潤劑、增稠劑、pH調節劑、流變學改性劑、分散劑、佐劑、表面活性劑、防凍劑或著色劑。在一些實施方案中，可在利用水或不利用水作為稀釋劑的情況下直接使用包含細胞、無細胞製劑或通過發酵產生的代謝物的組合物而無需任何其它製劑製備。在一些實施方案中，在濃縮發酵液之後和在乾燥過程中和/或乾燥後添加配製惰性物。
[0027]本公開內容的組合物可包含載體，其為添加至發酵產物或無細胞製劑以改善回收、效力或物理性質和/或幫助包裝和施用的惰性配製成分。可單獨地或組合地添加這樣的載體。
[0028]可將本公開內容的組合物與其它化學藥品和非化學添加劑、佐劑和/或處理混合，其中這樣的處理包括但不限於化學和非化學殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺蟎劑、殺線蟲劑、肥料、營養物、礦物質、生長素、生長刺激物等。
[0029]可與本公開內容的基於短小芽胞桿菌的組合物混合的殺線蟲劑可以是化學或生物殺線蟲劑。如本文中所用，術語「化學殺線蟲劑」不包括燻劑，術語「燻劑」包括在種植前被用於土壤並通過土壤(在土壤空氣和/或土壤水中)擴散的廣譜殺蟲化學藥品，並且可作為氣體例如甲基溴化物、揮發性液體例如氯化苦或揮發性固體例如福美甲酯施用。
[0030]在一些實施方案中，化學或生物殺線蟲劑是商購可得的配製產品，與本公開內容的組合物配製於罐中。在其它實施方案中，在配製之前將化學或生物殺線蟲劑與基於短小芽胞桿菌的組合物(例如，來自短小芽胞桿菌QST2808)混合，以便組合物形成一種配製產品O
[0031]用於這樣的混合物的化學殺線蟲劑是氨甲酸酯類、氨基甲酸肟酯和有機磷殺線蟲劑。氨甲酸酯殺線蟲劑 包括苯菌靈、蟲蟎威(FURADAIV?)、丁硫克百威和除線威。氨基
甲酸肟酯包括棉鈴威、涕滅威(TEMIK?或作為來自Syngenta的AVICTA? CompletePak種子處理的部分)、涕滅碸威(STANDAK? )，草氨醯(VYDATE?:)，硫雙威(來自Bayer CropScience的AERIS?種子應用系統的部分)和環線威。有機磷殺線蟲劑包
括豐索磷(DANSANIT?:)，丙線磷(MOCAP?)、二甲基氨基磷酸酯、苯線磷、丁硫環
磷、磷胺、硫線磷、毒死蝶、除線磷(dichlofenthion)、樂果、噻唑磷、速殺硫磷、isamidofos、氯唑磷、甲拌磷、磷蟲威、特丁磷、硫磷嗪、三唑磷、imicyafos和四甲磷。每一種化合物後的括號中的名稱是上述化學藥品的每一種的代表性商業製劑。用於這樣的混合物的其它化學
殺線蟲劑包括螺蟲乙酯(MOVENTO?)、MON37400?殺線蟲劑和氟蟲腈。
[0032]生物殺線蟲劑包括殼多糖和尿素混合物；堆肥提取物和茶劑(充氣的和非充氣的)；包含真菌撫孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)和/或來自其的代謝物(作
為DITERA?商購可得的)的組合物；包含擬青黴屬(Paeci1myces)真菌包括淡
紫擬青黴(P.1ilacinus)的組合物(作為例如MELOCON?或BIOACT?商購可得的)；包含巴斯德氏芽菌屬(Pasteuria)細菌包括P.usgae的組合物(作為例如ECONEM?商購可得的)；包含來自芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的細菌，包括堅硬芽胞桿菌(Bacillus firmus)(例如菌株 CNMC 1-1582，於 1995 年 5 月 29 日保藏在 CollectionNationale de Cultures de Microorganismesj Institute Pasteur, France 中的，並且作為
例如VOT丨VO_?商購可得的)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽胞桿菌
(Bacillus amyloliquefaciens)和錯狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)的組合物；和包含殺線蟲鏈黴菌屬的種(Streptomycete sp.)例如利迪鏈黴菌(Streptomyces Iydicus)(作
為ACTINOVATF商購可得的)的組合物。生物殺線蟲劑還包括基於植物的殺線
蟲劑例如基於苦楝植物的產物(包括來自植物的種子或油)或印楝素、苦楝種子的次級代
謝物、基於芝麻油的產品(例如DRAGONF丨RE'?)、香芹酚和基於植物提取物的產品
(例如NEMA-Q?,獲自智利的皂樹樹)。生物殺線蟲劑還包括由細菌產生的分離的化
合物例如mectins,其由阿弗曼鏈黴菌(Streptomyces avermentilis)產生，包括阿巴克丁(由阿巴克丁 Bla和Blb組合組成)和阿佛菌素B2a以及最初在解澱粉歐文氏菌(Erwiniaamy 1vora)中鑑定的 harp in 蛋白，包括 harpinEA 和 harping 0。
[0033]本公開內容的組合物用於控制植物寄生線蟲例如根結線蟲、孢囊線蟲、損傷和環形線蟲，包括根結線蟲屬的種、異皮線蟲屬的種、胞囊線蟲屬(Globodera)的種、短體線蟲屬的種和小環線蟲屬的種(Criconemella sp.)。組合物還用於控制柑橘半穿刺線蟲，輪胎蟲屬的種、長針線蟲屬的種、腎狀線蟲屬的種、劍線蟲屬的種、刺線蟲屬的種(例如長尾刺線蟲(B.1ongicaudatus))、輪線蟲屬的種、矮化線蟲屬的種、紐帶線蟲的某些種、盤旋屬的種、螺旋屬的種、香蕉穿孔線蟲的種(例如柑橘穿孔線蟲和香蕉穿孔線蟲)、雙墊刃線蟲屬的種和其它植物寄生線蟲。在一些實施方案中，目標為孢囊線蟲，例如大豆胞囊線蟲(大豆孢囊線蟲)、甜菜孢囊線蟲(甜菜孢囊線蟲)、禾穀孢囊線蟲(谷孢囊線蟲)、番茄根結線蟲(棉花(或南方)根結線蟲)、馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲(馬鈴薯孢囊線蟲)。在其它實施方案中，目標是根結線蟲例如南方根結線蟲(棉花根結線蟲)、爪哇根結線蟲(爪哇人根結線蟲)、北方根瘤線蟲(北方根結線蟲)和花生根結線蟲(花生根結線蟲)。
[0034]如本文中所用，術語「控制」意指線蟲的殺死、線蟲的數目和/或線蟲的生長、進食或線蟲的任何或所有生命期的正常生理髮育(包括，對於根結線蟲，穿透根和在根內發育的能力)的減少、線蟲感染和/或侵染(例如，癭瘤、穿透和/或根內的發育)的作用的減少、植物對線蟲感染和/或侵染(例如，癭瘤和/或穿透)的抗性、植物對線蟲的感染和/或侵染的耐受性、植物對線蟲感染和/或侵染(例如，癭瘤和/或穿透)的作用的耐受性或其任意組合。植物對寄生線蟲的抗性和耐受性對於本領域普通技術人員來說是已知的，如由 Trudgill, D.L.「Resistance to and Tolerance of Plant Parasitic Nematodes inPlants.」Annual Review of Phytopathology.1991 ;29:167-192 (將其就其教導的每一件事明確且完整地通過引用併入本文)證明的。有效量是能夠顯著地減少害蟲生長、進食、根穿透、根中成熟和/或一般正常生理髮育和因線蟲感染而引起的症狀的量。在一些實施方案中，症狀和/或線蟲相對於未處理的對照減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。
[0035]本公開內容的組合物用於治療多種農業和/或園藝作物，包括為了種子、生產和景觀美化而生長的那些作物。可使用本公開內容的組合物處理的代表性植物包括但不限於下列植物:球莖蔬菜；穀粒；柑橘類水果(例如葡萄柚、檸檬和桔子)；棉花和其它纖維作物；葫蘆科植物；果菜類；葉用蔬菜(例如芹菜、結球萵苣和散葉萵苣和菠菜)；豆類；油料種子作物；花生；仁果(例如蘋果和梨)；核果(例如杏仁、美洲山核桃和胡桃)；根菜類；塊莖菜類；球莖菜類；菸草、草莓和其它漿果；油菜作物(例如綠花椰菜和包菜)；葡萄；菠蘿；顯花植物；花壇植物；和觀賞植物(例如蕨類植物和玉簪屬)。本公開內容的組合物還可用於處理多年生植物，包括種植作物例如香蕉和咖啡，以及存在於森林、公園或園林設計中的那些植物。
[0036]本文中公開的組合物用於植物、植物部分例如種子、根、根莖、球根、球莖或塊莖，和/或在其上生長植物或植物部分的場所，例如土壤，以控制植物寄生線蟲。可以以葉噴霧、種子/根/塊莖/根莖/球莖/球根處理，和/或作為土壤處理的形式來施用本公開內容的組合物。可在種植之前、種植期間或種植之後處理種子/根/塊莖/根莖/球莖/球根、葉和/或土壤。
[0037]還將本文中描述的組合物用於植物、植物部分例如種子、根莖、球根、球莖或塊莖和/或在其上生長植物或植物部分的場所例如土壤以增加作物產率。在一些實施方案中，作物產率增加至少約5%，在其它實施方案中至少約10%，在其它實施方案中至少約15%，在其它實施方案 中至少約20%。在一些實施方案中，根重增加至少約5 %，在其它實施方案中至少約10%，在其它實施方案中至少約15%，在其它實施方案中至少約20%。
[0038]當用作種子處理時，取決於種子的尺寸，以約IxlO2至約IxlO9Cfu/種子的比率應用本公開內容的組合物。在一些實施方案中，施用比率為IxlO4至約IxlO7Cfu/種子。在一些實施方案中，施用比率為約IxlO2至約lxlO8、約IxlO2至約1x10'約IxlO2至約IxlO6,約IxlO2至約lxlO5、約IxlO2至約lxlO4、約IxlO2至約lxlO3、約IxlO3至約IxlO5或優選約IxlO4Cfu/種子。當將所述組合物與至少一種另外的活性成分(「ai」)組合或一起使用時，所述至少一種另外的活性成分可以以約0.001至約1000克、約0.01至約500克、約0.1至約300克、約I至約100克、約I至約50克、約I至約25克，優選約I至約10克/IOOkg種子，和/或約IxlO2至約lxlO8、約IxlO2至約1x10'約IxlO2至約lxlO6、約IxlO2至約lxlO5、約IxlO2至約lxlO4、約IxlO2至約lxlO3、約IxlO3至約IxlO5或優選約IxlO4Cfu/種子的量存在。
[0039]本發明的組合物還可以以根浸潰的形式以約IxlO3至約IxlO8Cfu/植物根系的比率施用。當將所述組合物與至少一種另外的活性成分組合或一起使用時，所述至少一種另外的活性成分可以以約0.001至約lOOOrng、約0.01至約500、約0.1至約400、約I至約300、約10至約250，優選約25至約200mg ai/L和/或約IxlO3至約IxlO8Cfu/植物根系的
量存在。
[0040]當用作土壤處理時，可將本公開內容的組合物以土壤表面浸透、插柄(shanked-1n)、溝內注射和/或施用或通過與灌溉水的混合物的形式進行施用。可在種植時、播種過程中或播種後或在移植後和在植物生長的任何時期施用的土壤表面浸透處理的施用率為約4xl07至約8xl014、約4xl09至約8xl013、約4χ10η至約8xl012、約2xl012至約6xl013、約2xl012至約3xl013或約4xl013至約2xl014cfu/英畝。在一些實施方案中，施用率為約IxlO12至約6xl012或約IxlO13至約6xl013cfu/英畝。種植時施用的溝內處理的施用率為約2.5xl010至約5xl0ncfu/1000排英尺(row feet)。在一些實施方案中，施用率為約6xl01Q至約 3xl012、約 6xl010 至約 4χ10η、約 6χ10η 至約 3xl012 或約 6χ10η 至約 4xl012cfu/1000排英尺。當向土壤中插柄或注射時施用率為約4xl07至約8xl014、約4xl013至約2xl014、約4xl08 至約 8xl013、約 4xl09 至約 8xl012、約 2xl010 至約 6χ10η、約 4xl07 至約 8xl013、約 4xl07至約8xl012、約4xl07至約8χ10η、約4xl07至約8xl010、約4xl07至約8xl09或約4xl07至約SxlO8Cfu/英畝。本領域技術人員將理解如何調整撒播處理(其中以更低的比率但更頻繁地進行施用)和其它不太常用的土壤處理的比率。當將所述組合物與至少一種另外的活性成分組合或一起使用時，所述至少一種另外的活性成分可以以約10至約1，000、約10至約750、約10至約500、約25至約500、約25至約250，優選約50至約200g ai/ha和/或約4xl07 至約 8xl014、約 4xl013 至約 2xl014、約 4xl08 至約 8xl013、約 4xl09 至約 8xl012、約 2xl010至約 6χ10η、約 4xl07 至約 8xl013、約 4xl07 至約 8xl012、約 4xl07 至約 8χ10η、約 4xl07 至約SxlOiciJ^ 4xl07至約8xl09或約4xl07至約8xl08cfu/英畝的量存在。
[0041]可在種植之前或在種子萌發之前將本公開內容的組合物引入土壤。還可將本公開內容的組合物引入植物的場所，與植物根接觸的土壤，植物基部的土壤，或植物基部周圍的土壤(例如，在植物基部周圍或下面約5cm、約10cm、約15cm、約20cm、約25cm、約30cm、約 35cm、約 40cm、約 45cm、約 50cm、約 55cm、約 60cm、約 65cm、約 70cm、約 75cm、約 80cm、約85cm、約90cm、約95cm、約IOOcm或更多的距離內)。組合物可通過利用多種技術(包括但不限於滴灌、噴灑、土壤注射或土壤表面浸透)來施用。還可將組合物施用於土壤或穴盤(plug tray)中的植物或在移植至不同植物場所之前施用至幼苗。當施用至與植物根接觸的土壤、植物的基部或植物基部周圍指定的距離內的土壤(包括以土壤浸透處理的形式)時，可以以單次施用或多次施用的形式施用組合物。組合物(包括具有至少一種另外的活性成分的那些組合物)可以以上述對於浸透處理所示的比率或以約IxlO5至約IxlO8Cfu/克的土壤、IxlO5至約IxlO7Cfu/克的土壤、IxlO5至約IxlO6Cfu/克的土壤、7xl05至約IxlO7Cfu/克的土壤、IxlO6至約5xl06cfu/克的土壤或IxlO5至約3xl06cfu/克的土壤和/或約 4xl07 至約 8xl014、約 4xl08 至約 8xl013、約 4xl09 至約 8xl012、約 2xl010 至約 6χ10η、約4xl07 至約 8xl013、約 4xl07 至約 8xl012、約 4xl07 至約 8χ10η、約 4xl07 至約 8xl010、約 4xl07至約8xl09或約4xl07至約 8xl08cfu/英畝的比率來施用。在一個實施方案中，將本公開內容的組合物作為單次施用以約7xl05至約IxlO7Cfu/克的土壤的比率施用。在另一個實施方案中，將本公開內容的組合物以單次施用的形式以約IxlO6至約5xl06cfu/克的土壤的比率施用。在其它實施方案中，將本公開內容的組合物以多次施用的形式以約IxlO5至約3xl06cfu/克的土壤的比率施用。
[0042]優選地，本公開內容的基於短小芽胞桿菌的組合物為基於完整製劑約I % w/w至約99% w/w。更優選,基於短小芽胞桿菌的組合物以約1% w/w至約80% w/w、約1% w/w至約 60% w/w、約 I % w/w 至約 50% w/w、約 I % w/w 至約 40% w/w、約 I % w/w 至約 30% w/W、約I % w/w至約20 % w/w、約I % w/w至約10 % w/w,最優選約5 % w/w至約50 % w/w的
量存在。
[0043]可將本公開內容的基於短小芽胞桿菌的組合物單獨地施用或與一種或多種其它殺線蟲劑例如化學和生物殺線蟲劑組合地施用。在一些實施方案中，用至少一種其它殺線蟲劑共配製短小芽胞桿菌QST2808，將共配製的產物用於植物或植物場所。在一些實施方案中，將基於短小芽胞桿菌的組合物與商購可得的化學或生物殺線蟲劑的製劑混合於罐中，給植物或植物場所施用。在其它實施方案中，在即將施用化學或生物殺線蟲劑的商購可得的製劑之前或施用後立即將本公開內容的基於短小芽胞桿菌的組合物施用於植物和/或植物場所。在其它實施方案中，將本公開內容的基於短小芽胞桿菌的組合物與化學或生物殺線蟲劑的商購可得的製劑輪流給植物和/或植物場所施用。在一個情況下，如下文中更詳細地論述的，以種子處理或溝內或浸透處理的方式施用基於短小芽胞桿菌的組合物。在上述實施方案的一些情況下，以比產品標籤上推薦的這樣的殺線蟲劑作為獨立處理使用時的比率小例如約1%、約2%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約35%、約45%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約90%或約95%的比率施用。
[0044]在其它實施方案中，在施用燻劑後，將本公開內容的基於芽孢桿菌屬的組合物用於植物和/或植物場所。燻劑可通過在土壤表面下最少8英寸處插柄注射釋來施用。還可通過表面滴注化學灌溉施用燻劑的液體製劑以將燻劑移至土壤表面下8英寸或更低的深度。用塑料防水布覆蓋處理的土壤以將燻劑保留在土壤中數日。這在種植之前進行，隨後讓土壤排氣，然後進行種植。可在種植之前、種植時或種植之後，在這樣的排氣之後施用本文中描述的基於芽孢桿菌屬的組合物。在一些情況下，以小於產品標籤上推薦的比率的比率施用燻劑。
[0045]化學和生物殺線蟲劑在上文中進行了描述。下列燻劑的每一種的示例性商業製劑提供於化學名稱後的括號中。燻劑殺線蟲劑包括滷代烴例如氯化苦(CHLOR-O-PIC?
);甲基溴化物(METH-O-GAS? )及其組合(例如BROM-O-GAS?
和 TERR-O-GAS? ) ；l,3- 二氯丙烯(TELONE? I1、TELONE? EC、
CURFEW?')和 1，3- 二氯丙烯與氯化苦的組合(TELONE? c-17,TELONE?C-35和INLINE?) ;1，2-二氯丙烯；碘代甲烷(MIDAS? );異氰酸甲酯釋放劑例如甲基二硫代氨基甲酸鈉(VAPAM?、SOILPREP?、METAM-SODIUM? )和
福美甲酯；1，3 二氯丙烯與異硫氰酸甲酯的組合(VORLEX?);和二硫化碳釋放劑例如
甲硫代碳酸鈉(ENZONE?:);和二甲基二硫化物或DMDS (PALADINO?)。
[0046]還可將本公開內容的組合物作為病蟲害綜合治理(「IPM」)項目的一部分施用。這樣的項目描述於不同的出版物中，特別地通過大學合作推廣。這樣的項目包括與不能讓目標線蟲寄生的作物的作物輪作、培養和耕作措施以及移植的使用。例如，基於芽孢桿菌屬的組合物可在與芥子植物或其它線蟲抑制性作物的一季生長後施用。
[0047] 在一些實施方案中，在鑑定需要處理的場所之後給植物、植物部分或植物場所施用本公開內容的組合物。這樣的鑑定可通過植物(所述植物表現出通常與線蟲問題的歷史的知識偶聯的萎黃、矮化、壞死或枯萎(即，表現出具有營養缺乏))的目測鑑定；植物取樣和/或土壤取樣來進行。植物取樣可在生長季節過程中或在最終收穫後立即進行。從土壤除去植物，檢查它們的根以測定田中線蟲問題的性質和程度。對於根結線蟲，根癭嚴重度通過測量長根癭的根系的比例來測定。由根結線蟲引起的根癭可與固氮土壤菌的根瘤區別，因為根癭不容易與根分離。根結線蟲土壤群體水平隨著根癭嚴重度增加而增加。在一些情況下，任意水平的根癭的檢測表明種植任何易感作物的根結線蟲問題，尤其在取樣區域中或其附近。孢囊線蟲還可通過植物取樣和對根的孢囊的細察來鑑定。
[0048]土壤取樣提供了測定浸染特定體積的土壤或根的線蟲和/或線蟲卵的數目的方法。當首先懷疑問題時，可在最終收穫時或種植新的作物之前的任意時間(包括在對先前的作物進行作物破壞之前)進行土壤取樣。大學合作推廣項目提供了土壤取樣服務，包括佛羅裡達大學、俄勒R州立大學和內布拉斯加林肯大學。此外，這樣的項目提供了如何收集樣品的指導方針。例如，在收穫後預測取樣的一個方法中，以規則的之字形圖形在來自範圍5或10英畝(取決於作物的值，作物的值越高取樣的英畝數越少)的10至20塊田間位置的6至10英寸的土壤深度收集樣品。在測試已建立的植物的方法中，在來自顯示症狀但未死亡或瀕死(即分解)的懷疑植物的6至10英寸的土壤深度取出根和土壤樣品。
[0049]在一些實施方案中，鑑定包括確定線蟲侵染的經濟閾值是否已達到，即在無處理的情況下預期的經濟損失超過處理成本時所處的點。經濟閾值取決於作物、地理、氣候、種植時間、土壤類型和/或土壤溫度而變化。關於該課題已發表了許多論文，並且指導方針可從不同地區的大學合作推廣項目獲得。參見，例如，Robb, J.G.，等人，「Factors Affectingthe Economic Threshold for Heterodera schachtii Control in Sugar Beet,，』Economicsof Nematode Control, January-June1992 ；Hafez, Saad L., 「Management of Sugar BeetNematode, 」University of Idaho Current Information Series(CIS), 1071 (1998)；和「UC IPM Pest Management Guidelines: Tomato」，UC ANR Publication3470NematodesA.Ploeg, Nematology, UC Riverside (January2008),將所述文獻的每一篇就其教導的每一件事明確且完整地通過引用併入本文。測定特定作物在一年中的特定時間的經濟閾值完全在本領域普通技術人員的能力範圍內。
[0050]在一些實施方案中，土壤取樣顯示線蟲侵染將引起為未被侵染的土壤的標準的約80%、約90%或約95%的產率。
[0051]在一些實施方案中，以根結幼蟲/千克(kg)的土壤樣品表不的經濟閾值為約250、至少約300、至少約500、至少約750、至少約1000、至少約2000、至少約3000、至少約4000、至少約5000或至少約6000。
[0052]在一些實施方案中，以孢囊線蟲卵和幼蟲/Icm3的土壤表示的經濟閾值為至少約
0.5、至少約1、至少約2、至少約3、至少約4。根據Hafez (1998)(同上)，孢囊可據估計為500個有活力的卵和幼蟲。
[0053]下列實施例被提供來僅用於舉例說明本公開內容而不是為了限定本公開內容。實施例
[0054]實施例1
[0055]利用黃瓜種子蘇丹變種進行研究來測定QST2808抗爪哇根結線蟲的活性。為了進行該研究，使用裝有20g沙和利用QST2808全發酵液預處理的一粒未萌發種子的50ml離心管。
[0056]用QST2808 接種裝有 75ml 的 8g 基於 TSB 的 Schaeffer』 s 培養基(TSB8g/L ；10 % KCl (w/v)，10ml/L ；1.2 % MgS047H20 (w/v)，lOml/L ； IM Ca (NO3) 2, 1.0ml/L ；0.01OMMnCl2, 1.0ml/L ；lmM FeSO4, 1.0ml/L)的250ml培養瓶。將接種的培養瓶在~200rpm的搖動下於30°C溫育2天。測量光密度，利用期望數目的菌落形成單位(參見表2)塗覆種子，並進行乾燥。
[0057]使處理的種子萌發並在溫室中生長。處理後(「DAT」)4至5天，用100隻二期根結線蟲幼蟲接種每一管。在第10DAT，按照0-4的等級對幼苗的百分比根癭進行評分(這描述於表1中)。
[0058]隨後利用酸性品紅對根進行染色以觀察線蟲穿透和發育(參見表2)，在Leica解剖顯微鏡下進行觀察。對於線蟲穿透，計數每一條根內的總的線蟲幼蟲。對於線蟲發育，計數總的肥胖幼蟲，包括二期晚期幼蟲(J2』 s)和三期幼蟲(J3』 S)。如表1中所述對線蟲至根內的穿透和穿透後線蟲發育進行評分。關於所使用的技術的詳細內容，參見C.0.0mwega,等人,「A Nondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance toMeloidogyne incognita, 」 Plant Disease (1988) 72 (11):970_972，將所述文獻就其教導的每一件事明確且完整地通過引用併入本文。
[0059]表1.細菌全發酵液的線蟲拮抗活性的評級方案。根癭指數(galling index)基於根癭的百分比。
【權利要求】
1.一種方法，其用於控制植物、植物部分和/或植物生長的場所中或其上的線蟲，包括給需要防護所述線蟲的植物、植物部分或植物生長的場所施用有效量的短小芽胞桿菌QST2808、短小芽胞桿菌QST2808的突變體或短小芽胞桿菌QST2808的至少一種代謝物。
2.權利要求1的方法，其中在所述施用之前進行鑑定需要防護所述線蟲的植物、植物部分或植物生長的場所的步驟。
3.權利要求2的方法，其中所述鑑定包括確定:植物生長的場所超過線蟲侵染的經濟閾值。
4.權利要求1的方法，其中所述場所為土壤。
5.權利要求4的方法，其中在種植前施用所述短小芽胞桿菌QST2808。
6.權利要求4的方法，其中在種植時施用所述短小芽胞桿菌QST2808。
7.權利要求4的方法，其中在種植後施用所述短小芽胞桿菌QST2808。
8.權利要求1的方法,其中以約4xl07至約8xl014cfu/英畝的比率施用所述短小芽胞桿菌 QST2808。
9.權利要求1的方法，其中將所述短小芽胞桿菌QST2808施用至種子。
10.權利要求1的方法，其中所述短小芽胞桿菌QST2808為發酵產物。
11.權利要求1的方法， 其中所述發酵產物包含短小芽胞桿菌QST2808、代謝物和殘留髮酵液。
12.權利要求1的方法，還包括施用第二殺線蟲劑。
13.權利要求12的方法，其中所述第二殺線蟲劑是選自氨基甲酸酯、有機磷酸鹽及其組合的化學殺線蟲劑。
14.權利要求12的方法，其中將所述第二殺線蟲劑與所述短小芽胞桿菌QST2808組合施用。
15.權利要求12的方法，其中將所述第二殺線蟲劑與所述短小芽胞桿菌QST2808輪流施用。
16.權利要求14的方法，其中所述第二殺線蟲劑是配製的商購可得產品。
17.權利要求16的方法，其中以這樣的比率施用所述第二殺線蟲劑:所述比率低於當所述第二殺線蟲劑用作獨立處理時所述第二殺線蟲劑的產品標籤上推薦的比率。
18.權利要求1-17的任一項的方法，其中所述線蟲是引發根結病的線蟲。
19.權利要求18的方法，其中所述線蟲來自根結線蟲屬的種。
20.一種組合物，其包含短小芽胞桿菌QST2808和第二殺線蟲劑。
21.權利要求20的組合物，其中所述第二殺線蟲劑選自氨基甲酸酯和有機磷酸鹽。
22.—種試劑盒，其包含短小芽胞桿菌QST2808及其用作殺線蟲劑的說明書。
23.權利要求22的試劑盒，其中所述說明書指導用戶以約4xl07至約SxlO14Cfu/英畝的比率使用短小芽胞桿菌QST2808。
24.權利要求22的試劑盒，其中所述說明書指導用戶將所述短小芽胞桿菌QST2808與化學殺線蟲劑組合使用，並進一步指導用戶以低於所述化學殺線蟲劑的產品標籤上推薦的比率使用所述化學殺線蟲劑。
25.一種方法，其用於控制植物、植物部分和/或植物生長的場所中或其上的線蟲，包括給需要防護所述線蟲的植物、植物部分或植物生長的場所施用有效量的短小芽胞桿菌、短小芽胞桿菌的突變體 或短小芽胞桿菌的至少一種代謝物。
【文檔編號】A01N63/00GK104010511SQ201280060948
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年11月2日 優先權日:2011年11月4日
【發明者】R·N·羅亞爾蒂, V·P·託馬斯 申請人:拜爾作物科學有限合夥公司