運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法

2023-10-05 02:23:49 1

運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法
【專利摘要】本發明公開了運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟：（1）秀麗隱杆線蟲的培養；（2）大腸桿菌OP50的培養；（3）秀麗隱杆線蟲的復甦；（4）秀麗隱杆線蟲的傳代；（5）秀麗隱杆線蟲的同步化；（6）使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試。本發明的有益效果：運用模式生物——秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析，通過對比空白對照組的線蟲與暴露線蟲的致死率、生殖率、運動行為和世代周期之間的差異，從而判斷廢水的綜合毒性的大小。
【專利說明】運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及汙水毒性檢測領域，尤其涉及運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法。
【背景技術】
[0002]隨著工業的發展及城鎮化水平的提高，汙水的排放量不斷增加。目前，大部分城市汙水和工業廢水都進入汙水處理廠集中治理，汙水處理廠將汙水收集統一處理，處理後的尾水除了一少部分回用外，大部分尾水排入了自然界的水體中。因此汙水處理廠排放的尾水對受納水體環境將是很大的挑戰。

【發明內容】

[0003]本發明提供運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法。
[0004]本發明採用的技術方案:運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱杆線蟲的培養:使用線蟲培養基NGM培養秀麗隱杆線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在15-25°C環境下培養；
(2)大腸桿菌0P50的培養:使用LB液體培養基培養，溫度控制在15-25°C；
(3)秀麗隱杆線蟲的復甦:取1-4隻1.5ml的離心管並分別加入0.5-1.5ml的0P50溶液，將離心管放入離心機中，設置r為11000-13000rpm，離心0.5-1.5min，然後取出離心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩餘的濃縮的0Ρ50用移液器混勻後轉移到NGM培養皿的中央，輕輕轉動培養皿使0Ρ50均勻的攤在培養皿中，待菌苔風乾後，取手術刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻後，用手術刀割取培養基放入新的含有0Ρ50的NGM培養基中，然後將含有需要復甦的秀麗隱杆線蟲的培養基放入生化培養箱中，設定溫度為15-25 °C，進行培養；
(4)秀麗隱杆線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養基，然後將手術刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻後，割取含有秀麗隱杆線蟲的培養基放入新的含有E.coli 0P50的培養基中，將新的培養基放入15_25°C生化培養箱中培養；
(5)秀麗隱杆線蟲的同步化:準備孕蟲生長板2-4塊，用無菌水衝洗孕蟲生長板，吸取2.5-4.5ml的秀麗隱杆線蟲洗脫液於50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每l_3min振蕩一次，每次l_3s以將成蟲蟲體腐蝕，取3-5個1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設置離心機的r為2000-4000rpm,離心0.5-1.5min,去上清,然後向離心管中加入0.5-1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設置離心機的r為2000-4000rpm，離心0.5-1.5min,棄上清時留0.08-0.12mL的溶液，並混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養基中並不加在E.coli 0P50上，在超淨工作檯中晾乾，將加有蟲卵的培養皿放到15-25°C的生化培養箱中，36-60h後蟲卵發育成成蟲，可進行試驗； (6)使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試:取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h的秀麗隱杆線蟲置於待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱杆線蟲的存活率、生殖率、運動行為和世代周期的對比，對待測樣品進行毒性分析。
[0005]步驟(I)中秀麗隱杆線蟲的培養包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處於產卵期的雌雄同體的秀麗隱杆線蟲於鋪有0P50的NGM培養基中，不能破壞瓊脂層，在15-25°C的恆溫培養箱中培養；大量傳代為用經灼燒滅菌後的手術刀片切一塊含有秀麗隱杆線蟲的培養基，轉移到鋪有0P50的NGM培養基上，秀麗隱杆線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在15-25°C的恆溫培養箱中培養。
[0006]步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的存活率的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計線蟲致死率，具體方法為:吸取尾水樣品160-200 μ I於96孔板中，每種水樣做三個平行樣，再取含同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱杆線蟲液密度為800-1200條/ml，再將離心管中秀麗隱杆線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15-25 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個孔中15-25條線蟲，最後用封口膜將96孔板封好，放入15-25 °C生化培養箱中培養，12-48h後取出統計一次存活率。
[0007]步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的生殖率的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計秀麗隱杆線蟲的生殖率，具體方法為:取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4-8個，每管中分別加入
0.5-1.5ml尾水樣品，再取含同步化36-60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時間待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-25°C的生化培養箱中培養，12-48h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含新鮮0P50的培養基上培養，使其產卵，每12-36h轉移一次準備孕蟲生長板，至秀麗隱杆線蟲停止產卵，每種樣品做4-6個平行樣，待蟲卵孵化成成蟲後，統計板中秀麗隱杆線蟲總數。
[0008]步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的運動行為的的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計暴露的秀麗隱杆線蟲Imin內頭部擺動次數及20s內身體彎曲次數，具體方法為:取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4-8個，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36_60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-25°C生化培養箱中培養，12_48h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入乾淨不含食物的NGM培養基上，恢復Imin後計算20s內線蟲的身體彎曲次數，每種尾水樣品做3-6個平行樣，再取乾淨不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入水中，恢復Imin後統計Imin內頭部擺動次數，每種尾水樣品做3-6個平行樣。
[0009]秀麗隱杆線蟲的爬行軌跡為正弦曲線，假設秀麗隱杆線蟲咽泵的方向為y軸，則對應在其爬行的X軸上每改變一次爬行方向記為一次身體彎曲；而頭部擺動則為秀麗隱杆線蟲頭部擺動達到身體的一半定義為一次頭部擺動。
[0010]步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的世代周期的的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計暴露的秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，具體方法為:取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4-8個，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36-60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-250C生化培養箱中培養，12-48h後將秀麗隱杆線蟲取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含有食物的NGM培養基上，等待線蟲產卵，當第一枚卵產出後，記下時間並挑出秀麗隱杆線蟲，將蟲卵放入生化培養箱培養，培養1-3天後，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產下第一個卵的時間，從而算出暴露秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，每種離子濃度處理3-6條秀麗隱杆線蟲。
[0011]本發明的有益效果:運用模式生物——秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析，通過對比空白對照組的線蟲與暴露線蟲的致死率、生殖率、運動行為和世代周期之間的差異，從而判斷廢水的綜合毒性的大小。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為尾水樣品中秀麗隱杆線蟲的存活率情況的條形圖；
圖2為尾水樣品中秀麗隱杆線蟲的生殖率情況的條形圖；
圖3為尾水樣品中秀麗隱杆線蟲的頭部擺動頻率情況的條形圖；
圖4為尾水樣品中秀麗隱杆線蟲的身體彎曲次數情況的條形圖；
圖5為尾水樣品中秀麗隱杆線蟲的世代周期情況的條形圖。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱杆線蟲的培養:使用線蟲培養基NGM培養秀麗隱杆線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在15°C環境下培養；
(2)大腸桿菌0P50的培養:使用LB液體培養基培養，溫度控制在15°C；
(3)秀麗隱杆線蟲的復甦:取I只1.5ml的離心管並分別加入0.5的0P50溶液，將離心管放入尚心機中，設置r為IlOOOrpm,尚心0.5min,然後取出尚心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩餘的濃縮的0Ρ50用移液器混勻後轉移到NGM培養皿的中央，輕輕轉動培養皿使0Ρ50均勻的攤在培養皿中，待菌苔風乾後，取手術刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻後，用手術刀割取培養基放入新的含有0Ρ50的NGM培養基中，然後將含有需要復甦的秀麗隱杆線蟲的培養基放入生化培養箱中，設定溫度為15°C，進行培養；
(4)秀麗隱杆線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養基，然後將手術刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻後，割取含有秀麗隱杆線蟲的培養基放入新的含有E.coli 0P50的培養基中，將新的培養基放入15°C生化培養箱中培養；
(5)秀麗隱杆線蟲的同步化:準備孕蟲生長板2塊，用無菌水衝洗孕蟲生長板，吸取2.5ml的秀麗隱杆線蟲洗脫液於50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每I振蕩一次，每次Is以將成蟲蟲體腐蝕，取3個1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設置離心機的r為2000rpm,離心0.5min,去上清,然後向離心管中加入0.5mL的無菌水,輕微振蕩，再設置離心機的r為2000rpm,離心0.5min,棄上清時留0.08mL的溶液，並混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養基中並不加在E.coli 0P50上，在超淨工作檯中晾乾，將加有蟲卵的培養皿放到15°C的生化培養箱中，36h後蟲卵發育成成蟲，可進行試驗；
(6)使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試:取樣4個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36h的秀麗隱杆線蟲置於待測樣品中暴露12-48h，通過對秀麗隱杆線蟲的存活率、生殖率、運動行為和世代周期的對比，對待測樣品進行毒性分析。
[0014]步驟(I)中秀麗隱杆線蟲的培養包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處於產卵期的雌雄同體的秀麗隱杆線蟲於鋪有0P50的NGM培養基中，不能破壞瓊脂層，在15°C的恆溫培養箱中培養；大量傳代為用經灼燒滅菌後的手術刀片切一塊含有秀麗隱杆線蟲的培養基，轉移到鋪有0P50的NGM培養基上，秀麗隱杆線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在15°C的恆溫培養箱中培養。
[0015]存活率的研究方法:取樣4個典型汙水處理廠的尾水樣品，吸取尾水樣品160 μ I於96孔板中，每種水樣做三個平行樣，再取含同步化36h後的秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱杆線蟲液密度為800條/ml，再將離心管中秀麗隱杆線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個孔中15條線蟲，最後用封口膜將96孔板封好，放入15°C生化培養箱中培養，12h後取出統計一次存活率。
[0016]生殖率的研究方法:取樣4個典型汙水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4個，每管中分別加入0.5ml尾水樣品，再取含同步化36h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時間待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15°C的生化培養箱中培養，12h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含新鮮0P50的培養基上培養，使其產卵，每12h轉移一次準備孕蟲生長板,至秀麗隱杆線蟲停止產卵，每種樣品做4個平行樣，待蟲卵孵化成成蟲後，統計板中秀麗隱杆線蟲總數。
[0017]運動行為的的研究方法:取樣4個典型汙水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4個，每管中分別加入0.5ml尾水樣品，取含同步化36h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15°C生化培養箱中培養，12h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入乾淨不含食物的NGM培養基上，恢復Imin後計算20s內線蟲的身體彎曲次數，每種尾水樣品做3個平行樣，再取乾淨不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入水中，恢復Imin後統計Imin內頭部擺動次數，每種尾水樣品做3個平行樣。
[0018]世代周期的的研究方法:取樣4個典型汙水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4個，每管中分別加入0.5ml尾水樣品，取含同步化36h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15°C生化培養箱中培養，12h後將秀麗隱杆線蟲取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含有食物的NGM培養基上，等待線蟲產卵，當第一枚卵產出後，記下時間並挑出秀麗隱杆線蟲，將蟲卵放入生化培養箱培養，培養I天后，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產下第一個卵的時間，從而算出暴露秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，每種離子濃度處理3條秀麗隱杆線蟲。
[0019]實施例2
運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱杆線蟲的培養:使用線蟲培養基NGM培養秀麗隱杆線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在20°C環境下培養；
(2)大腸桿菌0P50的培養:使用LB液體培養基培養，溫度控制在20°C；
(3)秀麗隱杆線蟲的復甦:取2隻1.5ml的離心管並分別加入Iml的0P50溶液，將離心管放入尚心機中，設置r為12000rpm,尚心Imin,然後取出尚心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩餘的濃縮的0Ρ50用移液器混勻後轉移到NGM培養皿的中央，輕輕轉動培養皿使0Ρ50均勻的攤在培養皿中，待菌苔風乾後，取手術刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻後，用手術刀割取培養基放入新的含有0Ρ50的NGM培養基中，然後將含有需要復甦的秀麗隱杆線蟲的培養基放入生化培養箱中，設定溫度為20°C，進行培養；
(4)秀麗隱杆線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養基，然後將手術刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻後，割取含有秀麗隱杆線蟲的培養基放入新的含有E.coli 0P50的培養基中，將新的培養基放入20°C生化培養箱中培養；
(5)秀麗隱杆線蟲的同步化:準備孕蟲生長板3塊，用無菌水衝洗孕蟲生長板，吸取
3.5ml的秀麗隱杆線蟲洗脫液於50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每2min振蕩一次，每次2s以將成蟲蟲體腐蝕，取4個1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設置離心機的r為3000rpm，離心lmin，去上清，然後向離心管中加入ImL的無菌水，輕微振蕩，再設置離心機的r為3000rpm,離心lmin,棄上清時留0.1mL的溶液,並混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli0P50的NGM培養基中並不加在E.coli 0P50上，在超淨工作檯中晾乾，將加有蟲卵的培養皿放到20°C的生化培養箱中，48h後蟲卵發育成成蟲，可進行試驗；
(6)使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試:取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化48h的秀麗隱杆線蟲置於待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱杆線蟲的存活率、生殖率、運動行為和世代周期的對比，對待測樣品進行毒性分析。
[0020]步驟(I)中秀麗隱杆線蟲的培養包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處於產卵期的雌雄同體的秀麗隱杆線蟲於鋪有0P50的NGM培養基中，不能破壞瓊脂層，在20°C的恆溫培養箱中培養；大量傳代為用經灼燒滅菌後的手術刀片切一塊含有秀麗隱杆線蟲的培養基，轉移到鋪有0P50的NGM培養基上，秀麗隱杆線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在20°C的恆溫培養箱中培養。
[0021]存活率的研究方法:取樣6個典型汙水處理廠的尾水樣品，吸取尾水樣品180 μ I於96孔板中，每種水樣做三個平行樣，再取含同步化48h後的秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱杆線蟲液密度為1000條/ml，再將離心管中秀麗隱杆線蟲液搖勻，用微量移液器吸取20 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個孔中20條線蟲，最後用封口膜將96孔板封好，放入20°C生化培養箱中培養，48h後取出統計一次存活率。實驗結果如圖1所示。
[0022]生殖率的研究方法:取樣6個典型汙水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的乾淨1.5ml離心管6個，每管中分別加入Iml尾水樣品，再取含同步化48h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時間待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取20 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入20°C的生化培養箱中培養，12h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含新鮮0P50的培養基上培養，使其產卵，每24h轉移一次準備孕蟲生長板,至秀麗隱杆線蟲停止產卵，每種樣品做5個平行樣，待蟲卵孵化成成蟲後，統計板中秀麗隱杆線蟲總數。實驗結果如圖2所示。
[0023]運動行為的的研究方法:取樣6個典型汙水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的乾淨1.5ml離心管6個，每管中分別加入Iml尾水樣品，取含同步化48h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取20μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入20°C生化培養箱中培養，12h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入乾淨不含食物的NGM培養基上，恢復Imin後計算20s內線蟲的身體彎曲次數，每種尾水樣品做5個平行樣，再取乾淨不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入水中，恢復Imin後統計Imin內頭部擺動次數，每種尾水樣品做5個平行樣。實驗結果如圖3和圖4所示。
[0024]世代周期的的研究方法:取樣6個典型汙水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的乾淨1.5ml離心管6個，每管中分別加入Iml尾水樣品，取含同步化48h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取20 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入20°C生化培養箱中培養，12h後將秀麗隱杆線蟲取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含有食物的NGM培養基上，等待線蟲產卵，當第一枚卵產出後，記下時間並挑出秀麗隱杆線蟲，將蟲卵放入生化培養箱培養，培養2天後，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產下第一個卵的時間，從而算出暴露秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，每種離子濃度處理5條秀麗隱杆線蟲。實驗結果如圖5所示。
[0025]實施例3
運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱杆線蟲的培養:使用線蟲培養基NGM培養秀麗隱杆線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在25 °C環境下培養；
(2)大腸桿菌0P50的培養:使用LB液體培養基培養，溫度控制在25°C；
(3)秀麗隱杆線蟲的復甦:取4隻1.5ml的離心管並分別加入1.5ml的0P50溶液，將離心管放入尚心機中，設置r為13000rpm,尚心1.5min,然後取出尚心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩餘的濃縮的0Ρ50用移液器混勻後轉移到NGM培養皿的中央，輕輕轉動培養皿使0Ρ50均勻的攤在培養皿中，待菌苔風乾後，取手術刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻後，用手術刀割取培養基放入新的含有ΟΡ50的NGM培養基中，然後將含有需要復甦的秀麗隱杆線蟲的培養基放入生化培養箱中，設定溫度為25°C，進行培養；
(4)秀麗隱杆線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養基，然後將手術刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻後，割取含有秀麗隱杆線蟲的培養基放入新的含有E.coli 0P50的培養基中，將新的培養基放入25°C生化培養箱中培養；
(5)秀麗隱杆線蟲的同步化:準備孕蟲生長板4塊，用無菌水衝洗孕蟲生長板，吸取
4.5ml的秀麗隱杆線蟲洗脫液於50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每3min振蕩一次，每次3s以將成蟲蟲體腐蝕，取5個1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設置離心機的r為4000rpm，離心1.5min，去上清，然後向離心管中加入1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設置離心機的r為4000rpm,離心1.5min,棄上清時留0.12mL的溶液,並混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養基中並不加在E.coli 0P50上，在超淨工作檯中晾乾，將加有蟲卵的培養皿放到25°C的生化培養箱中，60h後蟲卵發育成成蟲，可進行試驗；
(6)使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試:取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化60h的秀麗隱杆線蟲置於待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱杆線蟲的存活率、生殖率、運動行為和世代周期的對比，對待測樣品進行毒性分析。
[0026]步驟(I)中秀麗隱杆線蟲的培養包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處於產卵期的雌雄同體的秀麗隱杆線蟲於鋪有0P50的NGM培養基中，不能破壞瓊脂層，在25°C的恆溫培養箱中培養；大量傳代為用經灼燒滅菌後的手術刀片切一塊含有秀麗隱杆線蟲的培養基，轉移到鋪有0P50的NGM培養基上，秀麗隱杆線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在25°C的恆溫培養箱中培養。
[0027]存活率的研究方法:取樣8個典型汙水處理廠的尾水樣品，吸取尾水樣品200 μ I於96孔板中，每種水樣做三個平行樣，再取含同步化60h後的秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱杆線蟲液密度為1200條/ml，再將離心管中秀麗隱杆線蟲液搖勻，用微量移液器吸取25 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個孔中25條線蟲，最後用封口膜將96孔板封好，放入25°C生化培養箱中培養，48h後取出統計一次存活率。
[0028]生殖率的研究方法:取樣8個典型汙水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的乾淨1.5ml離心管8個，每管中分別加入1.5ml尾水樣品，再取含同步化60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時間待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入25°C的生化培養箱中培養，48h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含新鮮0P50的培養基上培養，使其產卵，每36h轉移一次準備孕蟲生長板,至秀麗隱杆線蟲停止產卵，每種樣品做6個平行樣，待蟲卵孵化成成蟲後，統計板中秀麗隱杆線蟲總數。
[0029]運動行為的的研究方法:取樣8個典型汙水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的乾淨1.5ml離心管8個，每管中分別加入1.5ml尾水樣品，取含同步化60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取25μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入25°C生化培養箱中培養，48h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入乾淨不含食物的NGM培養基上，恢復Imin後計算20s內線蟲的身體彎曲次數，每種尾水樣品做6個平行樣，再取乾淨不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入水中，恢復Imin後統計Imin內頭部擺動次數，每種尾水樣品做6個平行樣。
[0030]世代周期的的研究方法:取樣8個典型汙水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的乾淨
1.5ml離心管8個，每管中分別加入1.5ml尾水樣品，取含同步化60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入25°C生化培養箱中培養，48h後將秀麗隱杆線蟲取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含有食物的NGM培養基上，等待線蟲產卵，當第一枚卵產出後，記下時間並挑出秀麗隱杆線蟲，將蟲卵放入生化培養箱培養，培養3天後，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產下第一個卵的時間，從而算出暴露秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，每種離子濃度處理6條秀麗隱杆線蟲。
[0031]上述實驗結果顯示，某些汙水處理廠尾水還存在一定量的有毒物質，對秀麗線蟲具有較大的致死毒性。經過廢水急性暴露的秀麗線蟲雖在短時間內不足以致死，但線蟲的各項生理指標均受到不同程度的損害，其中秀麗線蟲的生殖率急劇減少，頭部擺動和身體彎曲等運動行為指標也受到嚴重損傷。因此，通過對秀麗線蟲四種生理指標結果的綜合判定，我們可以得出結論:某些汙水處理廠尾水含有一定的綜合毒性，對環境中的生物的健康存在危害。
[0032]有益效果:運用模式生物一秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析，通過對比空白對照組的線蟲與暴露線蟲的致死率、生殖率、運動行為和世代周期之間的差異，從而判斷廢水的綜合毒性的大小。
【權利要求】
1.運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特 徵在於包括以下步驟: (1)秀麗隱杆線蟲的培養； (2)大腸桿菌0P50的培養； (3)秀麗隱杆線蟲的復甦； (4)秀麗隱杆線蟲的傳代； (5)秀麗隱杆線蟲的同步化； (6)使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試。
2.根據權利要求1所述的運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特徵在於: (1)秀麗隱杆線蟲的 培養:使用線蟲培養基NGM培養秀麗隱杆線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在15-25°C環境下培養； (2)大腸桿菌0P50的培養:使用LB液體培養基培養，溫度控制在15-25°C； (3)秀麗隱杆線蟲的復甦:取1-4隻1.5ml的離心管並分別加入0.5-1.5ml的0P50溶液，將離心管放入離心機中，設置r為11000-13000rpm，離心0.5-1.5min，然後取出離心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩餘的濃縮的0Ρ50用移液器混勻後轉移到NGM培養皿的中央，輕輕轉動培養皿使ΟΡ50均勻的攤在培養皿中，待菌苔風乾後，取手術刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻後，用手術刀割取培養基放入新的含有0Ρ50的NGM培養基中，然後將含有需要復甦的秀麗隱杆線蟲的培養基放入生化培養箱中，設定溫度為15-25 °C，進行培養； (4)秀麗隱杆線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養基，然後將手術刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻後，割取含有秀麗隱杆線蟲的培養基放入新的含有E.coli 0P50的培養基中，將新的培養基放入15_25°C生化培養箱中培養； (5)秀麗隱杆線蟲的同步化:準備孕蟲生長板2-4塊，用無菌水衝洗孕蟲生長板，吸取2.5-4.5ml的秀麗隱杆線蟲洗脫液於50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每l_3min振蕩一次，每次l_3s以將成蟲蟲體腐蝕，取3-5個1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設置離心機的r為2000-4000rpm,離心0.5-1.5min,去上清,然後向離心管中加入0.5-1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設置離心機的r為2000-4000rpm，離心0.5-1.5min,棄上清時留0.08-0.12mL的溶液，並混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養基中並不加在E.coli 0P50上，在超淨工作檯中晾乾，將加有蟲卵的培養皿放到15-25°C的生化培養箱中，36-60h後蟲卵發育成成蟲，可進行試驗； (6)使用秀麗隱杆線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試:取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h的秀麗隱杆線蟲置於待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱杆線蟲的存活率、生殖率、運動行為和世代周期的對比，對待測樣品進行毒性分析。
3.根據權利要求1或2所述的運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特徵在於:步驟(1)中秀麗隱杆線蟲的培養包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為1mm的鉬金絲挑取處於產卵期的雌雄同體的秀麗隱杆線蟲於鋪有0P50的NGM培養基中，不能破壞瓊脂層，在15-25°C的恆溫培養箱中培養；大量傳代為用經灼燒滅菌後的手術刀片切一塊含有秀麗隱杆線蟲的培養基，轉移到鋪有0P50的NGM培養基上，秀麗隱杆線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在15-25°C的恆溫培養箱中培養。
4.根據權利要求1或2所述的運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特徵在於，步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的存活率的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計線蟲致死率，具體方法為:吸取尾水樣品160-200 μ 1於96孔板中，每種水樣做三個平行樣，再取含同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱杆線蟲液密度為800-1200條/ml，再將離心管中秀麗隱杆線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15-25 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個孔中15-25條線蟲，最後用封口膜將96孔板封好，放入15-25 °C生化培養箱中培養，12-48h後取出統計一次存活率。
5.根據權利要求1或2所述的運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特徵在於，步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的生殖率的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計秀麗隱杆線蟲的生殖率，具體方法為:取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4-8個，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，再取含同步化36-60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時間待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15_25°C的生化培養箱中培養，12-48h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含新鮮0P50的培養基上培養，使其產卵，每12-36h轉移一次準備孕蟲生長板，至秀麗隱杆線蟲停止產卵，每種樣品做4-6個平行樣，待蟲卵孵化成成蟲後，統計板中秀麗隱杆線蟲總數。
6.根據權利要求1或2所述的運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特徵在於，步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的運動行為的的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計暴露的秀麗隱杆線蟲Imin內頭部擺動次數及20s內身體彎曲次數，具體方法為:取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4-8個，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36_60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-25°C生化培養箱中培養，12_48h後將離心管取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入乾淨不含食物的NGM培養基上，恢復Imin後計算20s內線蟲的身體彎曲次數，每種尾水樣品做3-6個平行樣，再取乾淨不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入水中，恢復Imin後統計Imin內頭部擺動次數，每種尾水樣品做3-6個平行樣。
7.根據權利要求1或2所述的運用秀麗隱杆線蟲對汙水處理廠尾水進行毒性分析的方法，其特徵在於，步驟(6)中對秀麗隱杆線蟲的世代周期的的研究方法是取樣4-8個典型汙水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h後的秀麗隱杆線蟲暴露於尾水樣品中，12-48h後統計暴露的秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，具體方法為:取滅過菌的乾淨1.5ml離心管4-8個， 每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36-60h秀麗隱杆線蟲的培養皿，用無菌水衝洗培養皿，將秀麗隱杆線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱杆線蟲沉澱後，棄上清至管中剩餘2ml液體，將管中秀麗隱杆線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-250C生化培養箱中培養，12-48h後將秀麗隱杆線蟲取出，挑出一條秀麗隱杆線蟲放入含有食物的NGM培養基上，等待線蟲產卵，當第一枚卵產出後，記下時間並挑出秀麗隱杆線蟲，將蟲卵放入生化培養箱培養，培養1-3天後，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產下第一個卵的時間，從而算出暴露秀麗隱杆線蟲的世代周期時間，每種離子濃度處理3-6條秀麗隱杆線蟲。
【文檔編號】G01N33/18GK103913555SQ201410150085
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】曹侃, 壯子恆, 李敏, 薛婷, 楊蘊敏 申請人:常州紡織服裝職業技術學院