一種基因遞送系統的製作方法
2023-10-04 20:25:14
本發明涉及由親脂的異喹啉-3-羧酸和親水的rgdv序列肽結合形成的新型兩親性脂質體載體的製備，以及irv/stat3-sirna基因遞送系統的構建，並且對其進行了體內外抗腫瘤活性和基因沉默效率的評價。本專利主要是通過異喹啉結構增強抗腫瘤活性，結合rgdv序列肽增強脂質體的靶向性，使其在靶部位的濃度增加，從而減小副作用，提高了治療指數。
背景技術：
基因治療是指將發揮治療作用的基因通過一定方式導入靶細胞，以糾正基因缺陷或者沉默相關基因表達，從而起到抗腫瘤的目的。stat基因即信號轉導子與轉錄激活子，是一類新型的由細胞因子、生長因子等多肽類配體激活的細胞內信號傳遞和基因表達調控因子家族。其中stat3是這個家族重要的組成，廣泛參與了多種細胞因子的應答反應。研究發現，對大多數成人的正常細胞、組織來說stat3並不是必須的，但是活化的stat3對腫瘤細胞的形成、生長、凋亡等過程卻起著重要的調控作用，在腫瘤轉移中是起重要作用的媒介。同時stat3的異常激活也會導致下遊基因的活化，包括vegf和survivin基因。
rna幹擾技術是通過小幹擾rna造成目的mrna特異性降解,從而使基因轉錄後沉默的一種手段。利用stat3sirna阻斷stat3基因的特異性表達已成為重要的抗癌研究。然而裸sirna在體內容易被rnase酶降解，半衰期短，轉染效率低，這些缺點限制了sirna的活性，因而能夠穩定包裹sirna到達並轉入癌細胞的載體十分必要。
利用合成的兩親性的異喹啉-3-醯基-rgdv替代磷脂，與膽固醇結合形成空白脂質體。再利用脂質體-多聚陽離子-dna複合物技術，帶正電荷的魚精蛋白可以吸附sirna及小牛胸腺dna，形成一個穩定的帶負電的複合物，並能最大限度壓縮sirna，此複合物再與陽離子脂質體複合形成脂質體/sirna複合物，形成一種新型sirna遞送系統，提高了基因的轉染效率。其中異喹啉是已被證明具有抗血栓抗腫瘤等活性的結構，rgd是能夠與腫瘤細胞中整合素受體特異性結合的序列肽，因此該載體還具有靶向性和一定的抗腫瘤活性。
rgdv是一種含「精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸」胺基酸序列的多肽，可識別腫瘤細胞表面特異表達的整合素，並與其特異性結合從而來介導腫瘤的靶向治療。經過rgdv序列肽修飾的抗腫瘤藥物及其遞送系統,可增加藥物的主動靶向性,從而達到特異性治療的目的。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種具有靶向性的基因脂質體載體:isoquinoline-3-acyl-rgdv。
本發明所述的基因脂質體載體的製備方法，包括以下步驟：將化學合成得到iq-cooh，與rgdv縮合即得。
本發明的另一個目的在於提供一種基因遞送系統，由抗腫瘤基因治療藥物stat3-sirna，和權利要求1所述的基因脂質體載體isoquinoline-3-acyl-rgdv製備而成。
本發明所述的基因遞送系統中，抗腫瘤基因治療藥物stat3-sirna(100nm)和基因脂質體載體isoquinoline-3-acyl-rgdv(100％)的用量比為1:1.1(μl:μl)。
本發明所述的基因遞送系統，納米結構。
本發明的另一個目的在於提供基因遞送系統的製備方法。
本發明所述的製備方法，包括以下步驟：基因脂質體載體isoquinoline-3-acyl-rgdv與魚精蛋白室溫下混合，靜置，備用，取小牛胸腺dna與抗腫瘤基因治療藥物stat3-sirna室溫下混合，靜置備用，將上述兩種溶液混合後，即得基因遞送系統。
其中，基因脂質體載體的製備：
irv的合成：苯丙氨酸和甲醛在hcl的催化下發生ps縮合反應得到四氫異喹啉羧酸，經過甲酯化再氧化後脫甲酯得到異喹啉-3-羧酸。iq-cooh與h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl在thf中通過dcc/hobt反應，再脫掉保護基團形成isoquinoline-3-acyl-rgdv(irv)。
優選的，本發明所述的基因脂質體載體的製備：
在hcl的催化下，5g苯丙氨酸與甲醛在80～90℃油浴下發生ps反應，縮合生成四氫異喹啉羧酸(4hiq-cooh)；將4hiq-cooh在socl2的催化下，與甲醇發生酯化反應，得到4hiq-ome；以thf作溶劑，用高錳酸鉀催化氧化4hiq-ome為iq-ome；以甲醇為溶劑，在2nnaoh的催化下，iq-ome脫去甲酯，得到iq-cooh。
h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl的合成
取6gboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置於茄瓶中，冰浴條件下緩慢加入50ml鹽酸乙酸乙酯，瓶口接乾燥管後薄層色譜法監測反應進程至反應完全結束，溫水浴下用水泵抽乾液體，並用乾燥乙酸乙酯和無水乙醚各磨洗3遍後抽乾8h以上。
isoquinoline-3-acyl-rgdv的合成
取化合物isoquinoline-3-carboxylicacid646mg溶解於少量無水thf，加入hobt605mg攪拌至溶解，冰浴條件下加入dcc923mg，活化30min後加入3.49gh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl，用nmm調節ph至8-9，撤掉冰浴後監測反應進程。反應結束後旋除過濾得到的黃色液體，用ch2cl2溶解後分別用飽和鹼、鹽、酸清洗共十八次，無水na2so4乾燥過濾得到的濾液4h後旋除濾液，得到淡黃色固體isoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl。柱層析純化後進行結構鑑定。取300mgisoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置於茄瓶中，冰浴條件下緩慢加入tfa4.8ml，tfoh1.2ml，30min後加入冰無水乙醚終止反應，離心(3000rpm，3min)，用無水乙醚磨洗5遍後抽乾得到黃色粗產物，柱層析純化後凍幹得到無色晶體。
本發明所述的基因納米載體irv空白脂質體的製備，包括以下步驟：
100％irv膜材，irv與ch的重量比為15:1，1％(g/100ml)tween-80溶液，探頭超聲20min(130w,90％,超2s,停2s)。突出比較100％irv膜材的優越性，同時製備了75％irv、50％irv和25％irv含量的空白脂質體膜材進行對比。
優選的，本發明所述的基因納米載體irv空白脂質體的製備，包括以下步驟：
精確稱取60mgirv，用少量甲醇溶解後轉移至10ml容量瓶，用氯仿定容至10ml後超聲溶解。稱取0.4gtween-80於50ml燒杯中，以40mldepc處理水超聲溶解。精確稱取38.7mgch，用少量氯仿溶解後轉移至10ml容量瓶，用氯仿定容至10ml。精確稱取75mgpe，用少量氯仿溶解後轉移至10ml容量瓶，用氯仿定容至10ml，
取0.906ml的irv和0.094ml的ch加入到25ml茄瓶內，補氯仿至2ml。真空旋轉蒸發的條件為37℃水浴，120rpm，250mbar，30min後每5min降低50mbar直至1mbar，得到均一薄膜。真空乾燥後加入適量水化溶液即不同濃度的tween-80，輕搖水化超聲10min後進行探頭超聲，冷卻後得到含100％irv的空白脂質體溶液。
本發明所述的基因遞送系統的製備方法，包括以下步驟：
首先吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取1μl的irv加入5μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入967.5μl的depc水即得到100nm的100％irv/stat3-sirna。吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取14μl的irv加入15μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入954.5μl的depc水即得到100nm的75％irv/stat3-sirna。吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取20μl的irv加入20μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入943.5μl的depc水即得到100nm的50％irv/stat3-sirna。吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取38μl的irv加入22.5μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入923μl的depc水即得到100nm的25％irv/stat3-sirna。
本發明的另一個目的在於提供基因遞送系統在製備抑制腫瘤的藥物中的應用。
本發明的另一個目的在於涉及以肺癌a549細胞株為模型，用mtt法評價基因載體irv對a549細胞的細胞毒性和stat3-sirna/irv的體外抗腫瘤活性，結果顯示100％irv和75％irv對a549細胞表現出較弱的抗腫瘤活性，50％irv和25％irv在高濃度下有細胞毒性，並且100％irv/stat3-sirna具有良好的體外抗腫瘤活性。
本發明的另一個目的在於涉及以肺癌a549細胞株為模型，用annexinv-fitc/pi雙染法考察irv/stat3-sirna誘導肺癌a549細胞的凋亡率，並且通過pi染色法考察了irv/stat3-sirna對肺癌a549細胞周期的影響。annexinv-fitc/pi雙染法結果顯示irv/stat3-sirna(濃度為100nm)作用的a549細胞在48h的凋亡率為43.8％；周期實驗結果顯示100％irv/stat3-sirna具有周期依賴性，將處於有絲分裂的a549細胞阻滯在g2/m期。
本發明的另一個目的在於涉及以肺癌a549細胞株為模型，通過elisa測定蛋白水平的基因沉默效率，通過rt-pcr測定mrna水平的基因沉默效率。在mrna水平，100％irv/stat3-sirna能夠下調stat3-sirna相應mrna的表達，濃度為100nm的抑制率為49.5±2.8％，同時stat3-sirna的下調造成下遊基因vegf和survivin相應mrna表達的降低，vegf的抑制率為66.8±4.7％，survivin的抑制率為51.9±11.9％；在蛋白水平，100％irv/stat3-sirna能夠下調stat蛋白的表達，濃度為100nm的抑制率為37.82±2.98％。
本發明的另一個目的在於涉及以荷s180腹水瘤小鼠模型進行體內抗腫瘤活性評價，irv/stat3-sirna複合物中stat3-sirna的給藥劑量為0.3mg/kg，其抑瘤率為52.73％；並且通過對小鼠各臟器進行勻漿處理後測定ft-ms，結果顯示在腫瘤部位能夠檢測到rgdv分子，說明irv/stat3-sirna具有腫瘤靶向性。
對說明書中出現的以下詞語作進一步的解釋：
rgdv：arg-gly-asp-val，精氨醯-甘氨醯-天冬氨醯-纈氨酸
stat：信號轉導子與轉錄激活子
dmf：n,n-二甲基甲醯胺
dcc：二環己基碳二亞胺
hobt：1-羥基苯並三唑
tfa：三氟乙酸
tfoh：三氟甲磺酸
od值：光密度值
depc：焦碳酸二乙酯
nc：非同源-sirna
fbs：胎牛血清
fam：羥基螢光素
mtt:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽
dmso：二甲基亞碸
ns：生理鹽水
elisa：酶聯免疫吸附測定
rt-pcr：逆轉錄-聚合酶鏈式反應
附圖說明
附圖1為irv/stat3-sirna在a549細胞的轉染效果圖。
註：irv為「isoquinoline-3-acyl-rgdv」的縮寫，lipo2000為「lipofectaminetm2000」的縮寫。
附圖2為irv對a549細胞的細胞毒性。
附圖3為irv/stat3-sirna的體外抗腫瘤活性。
註：irv為「isoquinoline-3-acyl-rgdv」的縮寫，lipo為「lipofectaminetm2000」的縮寫；▲表示與stat3-sirna/100％irv組相比p＜0.05，有統計學差異。
附圖4為100％irv/stat3-sirna對a549細胞的凋亡作用。
a:空白對照組24h內對a549細胞的凋亡作用
b:裸sirna對照組24h內對a549細胞的凋亡作用
c:100％irv/stat3-sirna組24h內對a549細胞的凋亡作用
d:空白對照組48h內對a549細胞的凋亡作用
e:裸sirna對照組24h內對a549細胞的凋亡作用
f:100％irv/stat3-sirna組24h內對a549細胞的凋亡作用
附圖5為100％irv/stat3-sirna對a549細胞周期的影響。
a:24h內各組藥物對細胞周期的影響
b:48h內各組藥物對細胞周期的影響
附圖6為各組stat3蛋白的含量。
註：irv為「isoquinoline-3-acyl-rgdv」的縮寫，lipo2000為「lipofectaminetm2000」的縮寫。
附圖7為各組stat3-mrna的含量。
註：irv為「isoquinoline-3-acyl-rgdv」的縮寫，lipo2000為「lipofectaminetm2000」的縮寫。
附圖8為各組vegf-mrna和survivin-mrna的含量。
註：irv為「isoquinoline-3-acyl-rgdv」的縮寫。
附圖9為ns、100％irv/stat3-sirna、stat3-sirna、100％irv和dox組的髒體比。
附圖10為ns、100％irv/stat3-sirna、stat3-sirna、100％irv和dox組的瘤重。
附圖11為ns組和100％irv/stat3-sirna組臟器勻漿液的ft-ms圖。
a:100％irv/sirna組腫瘤組織液的ft-ms圖
b:100％irv/sirna組心臟組織液的ft-ms圖
c:100％irv/sirna組腎臟組織液的ft-ms圖
d:100％irv/sirna組脾臟組織液的ft-ms圖
e:100％irv/sirna組腦組織液的ft-ms圖
f:100％irv/sirna組肝臟組織液的ft-ms圖
g:生理鹽水組腫瘤組織液的ft-ms圖
h:生理鹽水組心臟組織液的ft-ms圖
i:生理鹽水組腎臟組織液的ft-ms圖
j:生理鹽水組脾臟組織液的ft-ms圖
k:生理鹽水組腦組織液的ft-ms圖
l:生理鹽水組肝臟組織液的ft-ms圖
具體實施方式
實施例1.irv/stat3-sirna的製備
isoquinoline-3-carboxylicacid的合成
在hcl的催化下，5g苯丙氨酸與甲醛在80～90℃油浴下發生ps反應，縮合生成四氫異喹啉羧酸(4hiq-cooh)；將4hiq-cooh在socl2的催化下，與甲醇發生酯化反應，得到4hiq-ome；以thf作溶劑，用高錳酸鉀催化氧化4hiq-ome為iq-ome；以甲醇為溶劑，在2nnaoh的催化下，iq-ome脫去甲酯，得到iq-cooh。
h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl的合成
取6gboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置於茄瓶中，冰浴條件下緩慢加入50ml鹽酸乙酸乙酯，瓶口接乾燥管後薄層色譜法監測反應進程至反應完全結束，溫水浴下用水泵抽乾液體，並用乾燥乙酸乙酯和無水乙醚各磨洗3遍後抽乾8h以上。
isoquinoline-3-acyl-rgdv的合成
取化合物isoquinoline-3-carboxylicacid646mg溶解於少量無水thf，加入hobt605mg攪拌至溶解，冰浴條件下加入dcc923mg，活化30min後加入3.49gh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl，用nmm調節ph至8-9，撤掉冰浴後監測反應進程。反應結束後旋除過濾得到的黃色液體，用ch2cl2溶解後分別用飽和鹼、鹽、酸清洗共十八次，無水na2so4乾燥過濾得到的濾液4h後旋除濾液，得到淡黃色固體isoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl。柱層析純化後進行結構鑑定。取300mgisoquinoline-3-acyl--arg(tos)-gly-asp(obzl)-val-obzl置於茄瓶中，冰浴條件下緩慢加入tfa4.8ml，tfoh1.2ml，30min後加入冰無水乙醚終止反應，離心(3000rpm，3min)，用無水乙醚磨洗5遍後抽乾得到黃色粗產物，柱層析純化後凍幹得到無色晶體。
結構鑑定結果：[m-h]+＝599.51，[m+h]+＝601.13；
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.430(s,1h),9.391(s,1h),9.129(d,j＝8hz,1h),8.915(t,1h),8.847(d,j＝8hz,1h),8.554(s,1h),8.247(d,j＝8hz,1h),8.186(d,j＝8hz,1h),7.874(m,1h),7.807(m,1h),7.241(s,2h),7.014(d,j＝8.5hz,1h),4.704(m,1h),4.337(m,1h),4.112(dd,j＝10hz,j＝8hz,1h),3.934(dd,j＝8hz,
j＝4.5hz,1h),3.516(dd,j＝17hz,j＝5hz,1h),3.194(m,1h),2.974(m,1h),2.621(dd,j＝16hz,j＝3.5hz,1h),2.252(dd,j＝11hz,j＝5.5hz,1h),2.195(m,1h),2.028(m,1h),1.911(m,1h),1.583(m,2h),0.812(d,j＝3.5hz,6h)；
13cnmr(125mhz,dmso-d6)δ/ppm＝175.90,174.07,172.43,170.62,168.80,164.03,158.09,152.20,143.59,135.83,131.91,129.78,129.72,128.48,128.36,120.27,58.61,52.55,50.67,42.91,41.07,38.02,31.67,31.36,24.72,19.72,18.26；
uv檢測到化合物的最大吸收波長為275.5nm；
在275.5nm波長下進行hplc檢測，純度＝98.08±1.2％，分離條件為色譜柱4.6mm×5.0um×250mmsymmetryc185um4.6×250mmcolumn，甲醇：水(0.1％冰醋酸)＝45:55，流速1ml/min，時間20min；
ir：νn-h3293cm-1,3204cm-1,δn-h1625cm-1；νc＝o1650cm-1；ν＝c-h3064cm-1；νc-h2967cm-1,2933cm-1,2831cm-1,δc-h1468cm-1,1390cm-1；νc＝c1514cm-1,1468cm-1,δc＝c746cm-1。
irv空白脂質體的製備
精確稱取60mgirv，用少量甲醇溶解後轉移至10ml容量瓶，用氯仿定容至10ml後超聲溶解。稱取0.4gtween-80於50ml燒杯中，以40mldepc處理水超聲溶解。精確稱取38.7mgch，用少量氯仿溶解後轉移至10ml容量瓶，用氯仿定容至10ml。精確稱取75mgpe，用少量氯仿溶解後轉移至10ml容量瓶，用氯仿定容至10ml。
取0.906ml的irv和0.094ml的ch加入到25ml茄瓶內，補氯仿至2ml。真空旋轉蒸發的條件為37℃水浴，120rpm，250mbar，30min後每5min降低50mbar直至1mbar，得到均一薄膜。真空乾燥後加入適量水化溶液即不同濃度的tween-80，輕搖水化超聲10min後進行探頭超聲，冷卻後得到含100％irv的空白脂質體溶液。用同樣的方法製備75％irv,50％irv和25％irv。
irv/stat3-sirna的製備
根據電泳篩選結果，首先吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取1μl的irv加入5μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入967.5μl的depc水即得到100nm的100％irv/stat3-sirna。吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取14μl的irv加入15μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入954.5μl的depc水即得到100nm的75％irv/stat3-sirna。吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取20μl的irv加入20μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入943.5μl的depc水即得到100nm的50％irv/stat3-sirna。吸取10μlstat3-sirna，加入6.5μl的小牛胸腺dna，室溫下靜置10min；吸取38μl的irv加入22.5μl的魚精蛋白，室溫下靜置10min；將兩種複合物混合後，室溫下靜置15min。加入923μl的depc水即得到100nm的
25％irv/stat3-sirna。
實施例2.irv/stat3-sirna的體外抗腫瘤活性評價
雷射共聚焦顯微鏡考察sirna的轉染效果
人類肺癌細胞系a549細胞是貼壁生長的細胞，以適量濃度接種於培養瓶中,加入含10％胎牛血清,100u/ml的青黴素、100μg/ml的鏈黴素的1640完全培養液，置於37℃恆溫、5％co2飽和溼度的培養箱中培養。取對數生長期a549細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶,消化1min30s後，離心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至1.5×105個/ml，每個雷射共聚焦培養小皿中加入2ml細胞液，共六組，37℃恆溫、5％co2培養過夜。小心棄掉上清液，pbs洗一次，分別加入2ml含有100nm的100％irv/stat3-sirna、75％irv/stat3-sirna、50％irv/stat3-sirna、25％irv/stat3-sirna和裸stat3-sirna的無血清1640培養基，以及2ml含有100nmirv/lipofectaminetm2000的無血清1640培養基，轉染4h。吸去上清液，1mlpbs洗3次，每個培養皿加1mlhochest染液(pbs稀釋，工作濃度為4μg/ml),染色15min。吸去上清液，用1mlpbs洗3次，最後加入1mlpbs。置於雷射共聚焦顯微鏡下觀察。
實驗結果
本實驗中，irv包載的sirna是fam標記的stat3-sirna，從圖1中我們可以看出100％irv/stat3-sirna組和lipo2000/stat3-sirna的細胞核(被hochest33342染成藍色)周圍有大部分綠色螢光(fam),75％irv/stat3-sirna組細胞核周圍小部分綠色螢光，50％irv/stat3-sirna組、25％irv/stat3-sirna組細胞核周圍有少量或幾乎沒有綠色螢光，而裸stat3-sirna組細胞核周圍沒有綠色的螢光，可以得出結論：stat3-sirna被100％irv、75％irv以及市售轉染載體試劑lipo2000成功遞送進a549細胞內，並且分布在細胞核周圍。
irv的細胞毒作用
將a549細胞以適量濃度接種於培養瓶中，加入含10％胎牛血清，100u/ml的青黴素、100μg/ml的鏈黴素的1640完全培養液,置於37℃恆溫、5％co2飽和溼度的培養箱中培養。取對數生長期a549細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶，消化1min30s後,離心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至1.5×105個/ml。取96孔培養板，pbs液封，設空白培養基組，其餘每孔加入100μl細胞懸液，在37℃，5％co2的培養箱中培養過夜。小心棄去培養液，加入含100％irv、75％irv、50％irv、25％irv的1640培養基100μl，濃度依次為40nm、60nm、80nm、100nm、120nm。每個濃度設置五個復孔。置於培養箱內培養24h。每孔加入20μl新鮮配製的濃度為5mg/ml的mtt，37℃，5％co2培養箱繼續培養4h。離心後小心棄去上清液，並加入150μldmso，用微型振蕩器震蕩700r，10min。混勻後，在酶標儀上以檢測波長為490nm測定吸光度(od)值，計算細胞存活率。細胞存活率(％)＝[(實驗組od值-空白組od值)/(對照組od值-空白組od值)]×100％。上述實驗重複三次。
實驗結果
從圖2中我們可以看出隨著濃度的增加，與空白組相比較，100％irv和75％irv組細胞存活率沒有明顯性差異(p>0.05)，產生抗腫瘤活性較弱。50％irv和25％irv在高濃度下產生較強的細胞毒性，說明irv有抗腫瘤作用。
irv/stat3-sirna的體外抗腫瘤活性
取對數生長期的a549細胞，胰酶消化後,用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至1.5×105個/ml。每孔種100μl細胞懸液於96孔培養板內，37℃，5％co2培養過夜。小心棄去培養液，加入100μl含40nm，60nm，80nm和100nm，120nm的stat3-sirna，100％irv/nc，lipo2000/stat3-sirna的無血清1640培養基，以及100％irv/stat3-sirna,75％irv/stat3-sirna，50％irv/stat3-sirna和25％irv/stat3-sirna的無血清1640培養基。每組每個濃度設置五個復孔。轉染4h，棄掉上清液，每孔加入100μl含10％fbs的1640培養基，然後繼續培養20h。每孔加入20μl新配製的濃度為5mg/ml的mtt，37℃、5％co2繼續培養4h。離心後小心棄去上清液，並加入150μldmso，用微型振蕩器震蕩700r，10min。混勻後，在酶標儀上以檢測波長為490nm測定吸光度(od)值，計算細胞存活率。細胞存活率(％)＝[(實驗組od值-空白組od值)/(對照組od值-空白組od值)]×100％。上述實驗重複三次。
實驗結果
從圖3中可以得出以下結論：
(1)空白組相比，stat3-sirna和100％irv/nc各濃度組均無統計學差異，stat3-sirna和nc-sirna的各濃度組之間也沒有統計學差異，說明nc-sirna沒有細胞毒性，游離的stat3-sirna也不能進入細胞產生細胞毒性。
(2)lipo2000/stat3-sirna與100％irv/nc組相比，40、60、80nm濃度組之間p＜0.05，100、120nm濃度組之間p＜0.01，均有統計學差異，說明stat3-sirna被市售轉染試劑成功載入細胞而產生細胞毒性。
(3)100％irv/stat3-sirna與100％irv/nc組相比，各濃度組之間p＜0.01，均有顯著性統計學差異，說明100％irv/stat3-sirna能有效將sirna組攝入細胞而產生細胞毒性。100％irv/stat3-sirna與lipo2000/stat3-sirna組相比，120nm組之間p＞0.05，沒有統計學差異，說明此濃度與lipo2000組效果相同。40、60、80nm組之間p＜0.05，有統計學差異，說明這幾個濃度組產生的細胞毒性優於lipo2000組。100nm組之間相比，p＜0.01，有顯著性統計學差異，說明在此濃度下載體載入sirna而產生的細胞毒性最強，顯著優於lipo2000組。
(4)75％irv/stat3-sirna與100％irv/nc組相比，40、60、80、100nm組之間p＜0.05，120nm組p＜0.01，有統計學差異，說明此組亦有細胞毒性。50％irv/stat3-sirna與nc/100％irv組相比，60、80nm組之間p＜0.05，40、100、120nm組之間p＜0.01，有統計學差異。25％irv/stat3-sirna與nc/100％irv組相比，40、60nm組之間p＞0.05，沒有統計學差異，80、100、120nm組之間p＜0.01有顯著性統計學差異。
根據圖1，圖2和圖3的結果，100％irv/stat3-sirna組的細胞毒性大部分由基因沉默引起，轉染效率最好。75％irv/stat3-sirna組作用次之。50％irv/stat3-sirna組和25％irv/stat3-sirna組的細胞毒性大部分是載體毒性造成的。
實施例3.100％irv/stat3-sirna作用機制研究
annexinv-fitc/pi雙染法考察100％irv/stat3-sirna誘導肺癌細胞a549的凋亡率
細胞培養
取對數生長期的a549細胞，先用pbs洗三遍，加1ml胰酶，消化1min30s後，3000rpm離心3min。用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×105個/ml，每孔加2ml於六孔板中，設三個復孔，培養24h後，棄去培養基，分別加入2ml含有100nm100％irv/stat3-sirna和stat3-sirna的不含血清的1640培養基,空白組加入2ml的不含血清的1640培養基，轉染4h，棄去培養基，每孔加2ml含有10％fbs的新鮮培養基。繼續在37℃，5％co2條件下培養20h或44h。
染色
用不含edta的胰酶消化洗脫並與培養基上清的懸浮細胞合併，2000rpm離心3min,然後用預冷的pbs洗滌2次，將離心的細胞團塊完全懸浮在200μl的bindingbuffer(1×)中，然後稀釋至5×105個/ml,至少50μl，加入5μlannexinv-fitc和1μlpi，避光，室溫孵育15min。上機檢查。
實驗結果
如圖4所示,100％irv/stat3-sirna對a549細胞的凋亡率與空白組和stat3-sirna組相比較，有明顯區別。在48h時100％irv/stat3-sirna組的細胞凋亡率可達到43.8％(早調：23.8％；晚調：20.0％)。我們可以得出結論：100％irv/stat3-sirna能夠成功將stat3-sirna遞送到a549細胞內，並且能誘導a549細胞的凋亡。
pi染色法考察100％irv/stat3-sirna對細胞周期的影響
細胞培養
取對數生長期的a549細胞，先用pbs洗三遍，加1ml胰酶，消化1min30s後，2000rpm離心3min。用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×105個/ml，每孔加2ml於六孔板中，設三個復孔，培養24h，棄掉培養基，加入2ml含有100nm100％irv/stat3-sirna和stat3-sirna的不含血清的1640培養基,空白組加入2ml的不含血清的1640培養基，轉染4h，棄去培養基，每孔加2ml含有10％fbs的新鮮培養基。繼續在37℃，5％co2條件下培養。
細胞的固定
分別於12h，24h，48h收集細胞。用不含edta的胰酶消化洗脫並與培養基上清的懸浮細胞合併，2000rpm離心3min,然後用預冷的pbs洗滌三次，將離心細胞團塊完全懸浮在0.5mlpbs中，逐漸滴入於已準備好的9.5ml80％的乙醇溶液中，4℃保存待用。
染色
將上一步收集到的各個時間段的細胞離心(8000rpm)，棄去上清液，並且用冷的pbs洗三遍,將細胞分散在500μlpbs裡(含5μlrnase原液和濃度為1mg/ml的pi染液)，37℃避光染色30min,上機檢測。
實驗結果
從圖5中我們可以看出，與空白組和裸stat3-sirna組相比較，100％irv/stat3-sirna組隨時間增加，g2/m期的細胞數目增多,而g1期的細胞數目減少，表現出g2/m期阻滯現象。可以看出stat3-sirna被irv成功遞送進入細胞，將細胞阻滯在g2/m期，抑制細胞增殖，進而誘導細胞凋亡。
實施例4100％irv/stat3-sirna的蛋白水平沉默效率評價
細胞培養
取對數生長a549細胞，胰酶消化後,用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×105個/ml，每孔加2ml於24孔板中，設三個復孔，培養24h，當細胞密度長至80％左右時，棄去上清液，加入2ml含有100nmstat3-sirna,100％irv/nc,100％irv/stat3-sirna,lipo2000/stat3-sirna和lipo2000/nc的無血清1640培養基，空白組加入2ml無血清1640培養基，轉染4h後換成新鮮的含10％fbs的1640培養基，繼續培養44h。
提取蛋白
冰上操作：棄掉上清液，然後每孔用pbs洗3次，棄去上清液，加入500μl蛋白裂解液，冰浴中裂解30min，提取到離心管中，離心(10000rpm，10min)取上清即可。
bcaproteinassaykit定量裂解液中蛋白濃度
將上一步提取的蛋白裂解液稀釋十倍，每組設置三個復孔,根據bca工作液試劑盒操作步驟,測定每組蛋白濃度，做下記錄,求每組樣品總蛋白濃度平均值。
humanstat3elisa試劑盒測定樣品蛋白中stat3的含量
蛋白上樣量為20μg，根據蛋白濃度，加入相應體積的蛋白提取液並用depc水定容到50μl,根據試劑盒步驟操作最後在450nm下測定od值。上述實驗重複三次。
實驗結果
蛋白定量結果
繪製標準曲線
不同濃度的標準蛋白的od值
標準方程為y＝0.01x+0.215。r2＝0.992
各組蛋白樣品中總蛋白量
elisa
各組蛋白樣品中stat蛋白的相對含量
從圖6中我們可以看出，裸stat3-sirna組與空白組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，即裸stat3-sirna不能影響a549細胞stat蛋白的表達；100％irv/nc和lipo2000/nc與空白組相比較，沒有明顯性差異(p>0.05)，表明載體材料對stat蛋白的表達沒有影響；而100％irv/stat3-sirna與空白組相比有明顯性差異(p0.05)，說明100％irv將stat3-sirna遞送進入細胞並成功下調stat蛋白的表達。
實施例5.100％irv/stat3-sirna的mrna水平沉默效率評價
細胞培養
取對數生長期a549細胞，細胞密度達到80％左右時，用pbs洗滌三遍，加入1ml胰酶消化1min30s,離心(2000rpm，3min)，用含10％胎牛血清的1640培養基調整細胞濃度至2×105個/ml，每孔加2ml於六孔板中，培養24h，設三個復孔，棄去上清，加入2ml含有100nmstat3-sirna,100％irv/nc,100％irv/stat3-sirna和lipo2000/stat3-sirna的無血清1640培養基，轉染4h，換成新鮮含血清的1640培養基，繼續培養44h。
rna的提取
(1)首先棄掉六孔板的上清液，然後用1mlpbs洗滌三次，每孔加入1mltrizol裂解液(每10cm2加入1mltrizol)。吹打均勻並室溫裂解10min，將裂解液轉移至無rnaseep管，靜置5min。
(2)相分離。在每1mltrizol加入0.2ml氯仿，然後劇烈振蕩，室溫放置3分鐘，離心(4℃，12000rpm，15minutes)。液體分成三層，下層的紅色為苯酚-氯仿相，上層是無色的水相。rna存在於水相中，水相約佔總體積的50％。
(3)沉澱rna。小心地將上層水相液體轉移到另一乾淨的無rnaseep管中，然後每管加入0.5ml異丙醇，混勻,室溫靜置10min，然後離心(4℃，12000rpm，10min)。離心後在管的底部可看到絮狀半透明膠樣的rna沉澱。
(4)洗滌rna。小心棄去上清，加入1ml配製好的75％乙醇(depc水配製)，洗滌rna沉澱，振蕩器混勻，離心(4℃，12000rpm，10min)，小心棄去上清。
(5)rna的復溶。將rna沉澱放置10min，待rna沉澱乾燥。但是注意不能將rna沉澱完全乾燥，因為這會極大地降低它的溶解度。用depc水重懸rna沉澱，並且用槍頭反覆吹打幾次，靜置10分鐘，55℃水浴10-15min。立即測定。
(6)測rna濃度：用depc水校正nanodrop-1000後，取2μl混勻後的rna溶液樣品，滴加到測量臂上，選擇rna，點擊measure測量。同法依次測量所有rna溶液樣品。
逆轉錄
(1)樣品準備：逆轉錄rna上樣量為2μg,根據上一步測得的rna濃度，計算出我們所需rna體積。
(2)取microamptmoptical96-wellreactionplate，每個反應孔加10μl2×rtbuffer,1μl20×rtenzymemix，加入相應體積的rna溶液，用depc水補足20μl。用opticaladhesivefilm將板子封口。離心(4℃，1000rpm，1min)，排出聚集在反應孔底部的氣泡。
(3)放入pcrsystem9700中,設置反應條件：94℃-5min,94℃-30s,55℃-30s,72℃-25s,72℃-7min,4℃∞，共30個循環。
(4)測濃度：反應結束後，首先用depc水校正nanodrop-1000，取2μl混勻後的cdna溶液樣品，滴加到測量臂上，蓋上測量臂，選擇dna-50，點擊measure測量。同法依次測量所有cdna溶液樣品，並記錄下測量的結果。按照上樣量進行稀釋，稀釋後用同樣的方法進行測定。-20℃下保存。
rt-pcr
cdna的上樣量為50ng，據此計算所需加入的各cdna樣品的體積。每個反應孔加入25μlgeneexpressionmastermix、2.5μl探針標記的引物(stat3或gapdh或vegf或survivin)、相應體積的cdna樣品，以depc水補齊50μl，搖勻。離心(4℃，1000rmp，1min)，使液體聚集於底部並排出氣泡；放入appliedbiosystems7500real-timepcrsystem中,設置條件。hold:50℃2min,95℃10min，cycle(40cycles)，95℃15s,60℃1min。數據處理中，根據ct值以gapdh為內參，運用2^-△△ct法相對定量各實驗組mrna的量。上述實驗重複三次。
實驗結果
提取的各組rna濃度
提取的各組rna濃度
逆轉錄後各組的cdna的濃度
逆轉錄後各組的cdna的濃度
rt-pcr
rt-pcr後各組2^-△△ct值如下表所示：
genesilencingefficiencyonstat3mrnalevel
從圖7可以看出：
(1)裸的stat3-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的stat3組對stat3-mrna的轉錄沒有影響；
(2)100％irv/nc組組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明載體材料對stat3-mrna的轉錄沒有影響；
(3)100％irv/stat3-sirna組分別與空白組和100％irv/nc相比較，均有明顯性差異(p0.05)，可以得出100％irv/stat3-sirna能夠下調stat3-mrna的轉錄水平，並且效率和陽性對照組相當。
從圖8中可以看出，100％irv/stat3-sirna能夠下調stat3-mrna的轉錄水平的同時，對下遊基因造成影響，vegf和survivin基因的表達也下調。
實施例6.100％irv/stat3-sirna的體內抗腫瘤活性研究
實驗分組
實驗共分為5組，分別是生理鹽水組(ns)，100％irv/stat3-sirna組，裸stat3-sirna組，100％irv組和鹽酸阿黴素組(dox)。每組10隻小鼠，六組共60隻。
給藥劑量
(1)100％irv/stat3-sirna組：stat3-sirna劑量為0.3mg/kg，按照比例配置100％irv/stat3-sirna複合物。
(2)stat3-sirna組：劑量為0.3mg/kg
(3)100％irv組：劑量和100％irv/stat3-sirna組中使用劑量相當
(4)dox組：劑量為2μmol/kg
(5)ns組：等體積的生理鹽水，即每隻0.2ml
給藥方式：尾靜脈注射
實驗動物：icr小鼠，雄性，體重20±2g(x±sd)，由北京維通利華動物實驗技術有限公司提供。
實驗方案
建立荷s180腹水瘤小鼠模型：取1×107個/ml的s180細胞懸液於健康小鼠腋皮下接種，0.2ml/只，小鼠接種瘤液後養7天至瘤體積(長×寬2/2)為150mm3左右，將全部小鼠隨機分組，分為5組，並編號。測量體重，然後開始給藥，100％irv/stat3-sirna，stat3-sirna組和100％irv組按給藥劑量每天尾靜脈注射給藥一次，每次0.2ml/只，連續給藥5天；陰性對照以等體積的生理鹽水尾靜脈注射給藥，每天給藥一次，0.2ml/只，連續給5天；陽性對照dox組以尾靜脈注射給藥，按給藥劑量每天給藥一次，0.2ml/只，連續給藥5天，每天按編號測量小鼠體重。
實體瘤抑瘤率及臟器指數的測定
每組連續給藥5天後，於第6天脫頸椎處死小鼠，處死前稱取體重，然後將小鼠解剖，取出瘤、腦、心、肝、脾、腎，並稱重，按如下公式計算抑瘤率及臟器指數。
抑瘤率％＝[(生理鹽水組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重]×100％，臟器指數(％)＝臟器重/處死前體重。數據統計均採用t檢驗和方差分析，以(mean±sdg)表示。
從圖9中我們可以看出，100％irv/stat3-sirna組等各組對動物的心、肝、脾、肺、腎、腦都沒有毒性。從圖10中可以看出，裸stat3-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的stat3-sirna對腫瘤的生長無抑制作用；100％irv/stat3-sirna與空白組相比較，有顯著性差異(p0.05)，說明100％irv/stat3-sirna明顯抑制腫瘤的生長，抑瘤率接近於陽性藥dox。100％irv組與空白組有統計學差異(p<0.05)，但與100％irv/stat3-sirna組相比，有統計學差異(p<0.05),說明載體材料有較弱的抗腫瘤作用。
100％irv/stat3-sirna的靶向性研究
將上一步取出的瘤、腦、心、肝、脾、腎各組織，精密稱重，先用pbs洗一遍，洗至無血水。然後加入一定體積(m：v＝1:3)的pbs(ph7.4)，勻漿，離心(6000rpm,10min)，取上層離心液200μl，加入400μl甲醇，渦旋混勻，離心(10000rpm，10min)，取上清600μl，濃縮乾燥，加入200μl色譜甲醇復溶，測定ft-ms。
[m+1]+rgdv的理論值為446.23632，由圖11我們可以看出在空白組的組織提取液中沒有發現rgdv,而在100％irv/stat3-sirna組的腫瘤組織提取液中發現rgdv的[m+1]+峰(446.23250)。由此我們得出100％irv/stat3-sirna具有靶向性，能夠靶向到腫瘤部位發揮抗腫瘤作用。