用於篩選具有增加受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的紅血球細胞剛性的能力的化合物的...的製作方法

2023-10-04 18:12:49

專利名稱：用於篩選具有增加受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的紅血球細胞剛性的能力的化合物的 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於篩選具有增加受瘧原蟲(Plasmodium)屬原生動物寄生蟲特別是 熱帶瘧原蟲(Plasmodium falciparum)感染的紅血球細胞(RBC)剛性的能力的化合物的方法。本發明還涉及用於過濾RBC的方法，其能在過濾單元中使具有異常和特別是降低 的變形能力的RBC保留。所述方法可以，具體地，分離和/或檢測瘧原蟲感染RBC或與下述 疾病相關的異常RBC:後天或遺傳性球形紅細胞症、敗血症、血紅蛋白病(α或β地中海貧 血、鐮狀細胞疾病和鐮狀細胞性狀)、自免疫溶血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖 6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它紅血球酶)，和與來自患者的血液樣本的脾腫大有關的其 它紅血球細胞疾病，或體外分析患者的脾功能。本發明進一步涉及所述方法的應用，用於篩選選擇性地與受瘧原蟲屬原生動物寄 生蟲感染的紅血球細胞相互作用並適合增加它們剛性的化合物。
背景技術：
瘧原蟲屬的原生動物寄生蟲引起人和很多動物種類中的疾病(瘧疾)。在人類 中，瘧疾主要由熱帶瘧原蟲、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)禾口間日皰原蟲(Plasmodium vivax)引起。熱 帶瘧原蟲是最主要的病因並且是所有瘧疾病例中約80 %病例的發病原因，並且還是人類瘧 疾死亡中約90%的病因。寄生蟲瘧原蟲還感染動物，包括鳥、爬蟲和哺乳動物，特別是猴、 猩猩和齧齒動物。由幾種瘧原蟲的猿猴種類，即諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲(Plasmodium inui)、食蟹猴皰原蟲(Plasmodium cynomomlgi)、似卵形皰原蟲(Plasmodium simiovale)、 巴西瘧原蟲(Plasmodium brazilianum)、許氏瘧原蟲(Plasmodium schwetzi)和吼猴瘧原 蟲(Plasmodium simium)引起的人類感染也已經有記載。熱帶瘧原蟲首先感染肝臟，但是然後轉移進入血液，在其中擴增並在紅血球細胞 (也稱作RBC、紅血球或紅細胞)中持續保持無性複製循環。在侵入紅血球細胞後，熱帶瘧 原蟲經過連續的表型變化和幾輪有絲分裂。在約48小時後，受感染的紅血球細胞破裂並釋 放游離寄生蟲(裂殖體)，其或者侵入另一個紅血球細胞，或者快速(在半小時內)通過各 種機制離開血流。瘧疾的發病機理與多種寄生蟲和宿主因子有關^脾過濾和免疫功能對於實驗模 型中瘧原蟲感染的過程有重要影響2』3。在瘧疾流行的國家中，脾切除術容易引起發燒、更頻 繁和更高的寄生蟲感染量(包括寄生蟲的循環成熟形式)，並且可能再次激活潛伏的瘧原 蟲感染4』5。除了相對較少的已發表數據(在5中進行了綜述)，臨床醫生將瘧疾包括在證明 在脾切除非免疫患者中日益引起重視的感染性疾病名單中6。因為動物和人類瘧原蟲感染 之間的關鍵特徵可能不同，並且因為人類脾臟的深入探索受到倫理和技術的限制7，所以僅對熱帶瘧原蟲感染紅血球細胞(iRBC)和人脾臟微循環結構之間的精確相互作用進行了間 接或通過驗屍而進行探索「1。因此，在人瘧疾期間推定的脾臟保護或發病作用下的機制主 要仍然是推測性的。人脾臟可以感受RBC變形能力中的適度變化，所述機制導致衰老或異常RBC的選 擇性生理保留/破壞"』48。在幾種病理狀態中，RBC保留與脾腫大相關。同樣的機制下，脾 切除術減輕了患有各種紅血球細胞疾病的患者中的貧血，所述疾病包括遺傳性球形紅細胞 症，和遺傳的RBC疾病49。遺傳性球形紅細胞症由RBC膜(包括其皮質細胞骨架)的結構 組織改變而表徵，並且脾臟隔離是RBC(球形紅細胞)壽命減少的主要機制。遺傳性球形紅 細胞症疾病的嚴重性與膜表面積的降低程度直接相關，並且因此導致變形能力的降低5°。通過其紅髓(RP)的特殊微循環結構進行RBC變形能力的脾臟特異性感應。最廣 為人知的變形能力-感應結構是紅髓竇壁中的內皮間間隙(IES)。這是動態的0. 2-2μπι寬 (如同從人脾臟樣本的光學和超結構顯微鏡圖片所估計的)，0. 5-3 μ m長的間隙，位於2個 串狀內皮細胞之間，通過所述間隙，離開脾紅髓索的RBC必須經過擠壓，到達竇腔和靜脈循 環"』21』51。IES可能是體內最嚴緊的RBC變形能力-感應結構。為了穿過靜脈竇中狹窄的 IES，RBC經過相當程度的變形如果細胞不能充分變形，會保留在靜脈竇壁的上遊「。期望 這種RBC-處理功能作用於RBC上寄生的瘧原蟲上12。RBC是熱帶瘧原蟲的主要宿主細胞(無性和有性紅細胞階段)52。裂殖子侵入RBC， 在其中發育48小時，然後產生新一代裂殖子。RBC內部寄生蟲的發育導致宿主細胞膜的改 變，表現為新結構、功能和抗原性質，其中有些性質與罕見的嚴重熱帶瘧原蟲感染有關13』14。 根據廣泛接受的範例，熱帶瘧原蟲的RBC寄生無性形式(iRBC)在侵入後循環16-20小時 (環狀階段)，然後在紅細胞循環內的最後觀-32小時過程中隔離在脈管系統中(營養共生 和裂殖體階段)36。因此，環狀-iRBC是循環中發現的主要熱帶瘧原蟲形式，與細胞粘附的 成熟-iRBC的組織隔離相反。成熟-iRBC的變形能力顯著下降，將導致在「經典」血管床中 那些逃逸隔離的脾臟中保留15。此外，獲得自瘧疾患者血液，然後在活體外加熱僵化、標記 並為相同患者重新注射的RBC(熱帶瘧原蟲感染RBC)，由脾臟快速清除39。在本上下文中，定量的脾循環框架是對於瘧疾發病原因一致理解的基本先決條 件。先前對朝向動物中開放式循環的過濾床的脾血流的比例經實驗確定從90% 16至10% "，確保指導對人的體內探索。我們在本文(和在54中)利用兩種概念上相關的方法健康志願者的體內成像，和 用培育的iRBC刺激活體外的人脾臟灌注系統，報導人脾臟生理和瘧疾發病原因的互補方 面。我們在本文中首先提供人脾臟內雙室血液循環的體內證明，慢室佔流量的10%。體外 培養中超過50%的熱帶瘧原蟲環狀感染RBC (環狀)由離體-灌注的人脾臟保留，並沿著竇 壁的近端積累(即，內皮間間隙的上遊54)。我們表明，在每次脾臟傳代時，環狀-iRBC中先 前忽略的子群體中的10%保留在人脾RP的緩慢、開放式循環結構中，最有可能的是通過機 械過程實現。這些結果揭示了環狀階段寄生蟲的不均勻性，並為由脾臟進行的RBC過濾提 供新視角，為瘧疾患者中寄生蟲擴增和RBC損失的控制帶來曙光。不同於攜帶未成熟配子體的RBC-其為固著的-攜帶成熟配子體的RBC (後文稱作 成熟配子體)在外周血液中循環53。因為成熟配子體循環，所以可為嗜血的瘧蚊所利用。當 成熟配子體包含於瘧蚊的血液大餐中時，會啟動寄生蟲有性階段的完全發育，這是由熱帶瘧原蟲傳播到其他人類所必需的步驟。因此，人外周血液中RBC寄生環或成熟配子體的存在是脾臟中具有這些熱帶瘧原 蟲發育階段的RBC部分同時保留或不同時保留的指示。RBC變形能力(和脾中RBC的保留)依賴(至少)3個因素膜粘彈性、細胞質粘 性，和細胞的幾何尺度，其標誌是表面積與體積的比例28』5°。可以根據有/沒有同滲容摩變 化(雷射衍射計，Lorca)時的切應力下RBC群體的伸長指數估計RBC變形能力50。經過過 濾膜的時間也可以在群體水平反映RBC變形能力。因此這些工具的應用限於研究佔全部的 比例小於10%的子群體(最常見的是臨床或培育樣品中的Pf-iRBC)。在先技術中公開的 微量吸管和微流體設備可以測量RBC在有限表面上變形或者流過狹窄如1 μ m(但是通常> 5μπι長)的通道的能力55。因為它們的讀數是在單細胞水平，所以這些工具不適用於大型 (> IO3細胞)RBC群體的快速分析。因為通過現有工具不能適當地模擬RBC和Pf-iRBC體 內通過IES時的罕見變形，所以沒有經過驗證的、能預測脾保留的RBC變形能力的標誌-包 括嚴緊的「內皮間間隙通過刺激」。本發明通過提供用於過濾RBC的方法克服了上述困難，所述方法使過濾單元中具 有異常特別是降低的變形能力的RBC保留。本方法能用於從來自患者的血液樣本檢測瘧原 蟲感染RBC或變形能力改變的RBC (例如球形紅細胞)的存在，或者用於患者脾生理狀況的 體外分析。此外，可以從珠層取得僵化的RBC，在細胞、子細胞和分子水平進一步比較分析，所 述分析用不同子群體進行。還易於自動化，並允許進行僵化RBC的清除和濃縮，在遺傳或後 天的RBC疾病中具有廣泛的潛在實驗和醫療應用。


圖1 人脾軟細胞組織中血液循環的超聲分析。(a)接收Sonovue微 氣泡恆定灌注的人志願者的脾中超聲信號強度的增強。(bl)對子囊區域[(a)中的白 線]信號強度在超聲誘導下的降低43研究了 >8秒。用雙指數曲線(TC)獲得了對於 得到的實驗信號-時間曲線(EC)的最佳擬合，如同這個典型實例所示(在全部16個 志願者中，關聯繫數R2> 0.96)。(b2)信號強度對時間的雙指數數學模型N(t)= V1 (C0Oexp (- β…)+V2 (B+ (C0-B) exp (- β )的圖示，其中第一和第二項分別對應於慢室和 快室。(c)源自這些觀察的人脾軟組織細胞中血液循環的示意圖。圖2 通過離體-灌注的人脾清除iRBC。(a)在用離體-灌注人脾的6個獨立實驗 之一的120分鐘灌注過程中，熱帶瘧原蟲FUP裂殖體-iRBC( Δ )和環狀_iRBC(·)的寄生 蟲感染量(全部6個實驗如圖7al-6所示)。(b)末端實驗脾樣本的透射電鏡，表示紅髓竇 內腔(SL，bl)中有結節的裂殖體-iRBC[S，bl-2，(橫槓=1) (b2，箭頭)，和索(Co，bl)中 的無結節環狀iRBC(R，bl-3)。保留的環狀-iRBC的另一個實例如圖4所示(dl_2)。圖3 在「循環」和「循環-再循環」實驗過程中環狀-iRBC清除的模擬。發現兩個 環狀-iRBC子群體。(a)灌注液中環狀-iRBC寄生蟲感染量的模擬，通過理論實例由圖形 闡述沒有殘留寄生蟲感染量的單室(al)、沒有殘留寄生蟲感染量的雙室(a2，直線對應於 雙指數曲線，虛線對應於單指數曲線)，和有殘留寄生蟲感染量的單室(平臺期，a3)。根據 赤池信息準則(AIC)、參數評價的變異性(VC) (AIC和VC值越小，模型越差)和測量濃度和 預測濃度之間權重差相對於時間的隨機分布，評價擬合程度和估計的參數。個體數值如表1 所示。對於雙室模型和有殘留寄生蟲感染量的1-室模型，AIC低於沒有殘留寄生蟲感染量的單室模型。然而，對於雙室模型，第二個半衰期參數的變異係數不顯著(> 100%)。所 以，有殘留寄生蟲感染量的單室模型是最好的模型。(b) 「循環-再循環」實驗。將為脾刺 激製備的部分iRBC和RBC群體(「脾原初」群體)在灌注培養基中保持在37°C，而其它部 分灌注脾臟。(bl)灌注開始四十分鐘後，從循環灌注液獲得iRBC和RBC( 「脾傳代」群體， bl)。使用PKH46或PKH-76差異標記兩個群體，然後合併並在初始灌注步驟後110-120分 鍾重新引入灌注液。使用流式細胞儀建立的每個iRBC子群體的清除動力學，表明清除了脾 「原初」環狀-iRBC，同時先前進行約40次脾傳代的iRBC則沒有清除。「脾原初」群體動力 學的最差的模型還是有殘留寄生蟲感染量的單室。來自兩個獨立實驗的平均(個體數值) AIC和半衰期與前面6個「循環」實驗( )觀察的結果相似。對於「脾傳代」群落的最差模 型是沒有清除的殘留寄生蟲感染量(參見表1)。圖4 人脾中熱帶瘧原蟲iRBC沉積的分析。(al-2)對於環狀_iRBC(R，PFZ中，RP 中)、裂殖體-iRBC(S，PFZ中，RP中)或紅細胞外寄生蟲剩餘(EER，PFZ中，RP中)毛囊周 區域(PFZ)或紅髓(RP)中的平均(SEM) iRBC數目/100個RBC (來自6個離體灌注人脾實 驗的平均值，吉氏染色部分，WP =白髓，橫槓=50_m)。每個寄生蟲發育階段的典型方面如 插入部分所示(中間柱)。(a3)PFZ或RP中環狀-iRBC (R)或裂殖體_iRBC(Q的保留指數 [RI= (a2中的「iRBC數目/100RBC」/(相應實驗末期的循環寄生蟲感染量)]。保留至少 為1(黑色斷線)對應於沒有保留。(bl-2)與al-2中相同的方法，但是使用PAS-染色(a =主動脈)。(cl)紫色PAS-染色部分(橫槓=5 μ m)，表示紅髓靜脈竇的基底膜。脾髓中 RBC沉降的工作分類在竇內腔(SL)中，在與竇壁基底膜直接接觸的索中(索近腔，CoA), 或者在不接觸基底膜的索中(嚴格意義上的索，Co)。(W)使用cl中定義的RP中RBC沉 積的工作分類，對於環狀iRBC的保留指數。(dl-d2)人離體-灌注脾樣本的透射電鏡，分 別表示內皮間間隙(黑箭頭)上遊和下遊的環狀iRBC(白星形)和未感染RBC(黑星形)。 這種布局反映了紅髓中RBC從索(Co)到竇內腔(SL)的循環。環狀iRBC的無結節基底膜 與竇壁基底膜(白箭頭)非常接近。對於圖a、b和c :*、**、#分別表示統計學上的顯著差 異，ρ < 0. 05，ρ <= 0. 01，ρ < 0. 0001。圖5 :iRBC的變形能力。(a)在不同切應力測量的紅血球細胞的伸長指數(EI) (al-2)。(U)在30帕斯卡增加寄生蟲感染量時培育的環狀iRBC和裂殖體iRBC的EI (4個 獨立實驗的平均值和標準偏差(SD))。在100%寄生蟲感染量時環狀iRBC的外推EI的平 均值[95%置信區間(Cl)]是0.47 W. 43-0. 51]。(b)在灌注末期處理的脾樣本的掃描電 鏡。竇壁的腔內視圖，顯示內皮細胞典型的串狀方面，其中含突入竇內腔的核(N)。細胞從 內皮間間隙生出(箭頭，橫槓=3μπι)。左上方四方形擠壓通過內皮間間隙的RBC的顯著 變形。圖6 在灌注人脾的快和慢循環腔室中的熱帶瘧原蟲感染RBC。使用由人志願者體 內成像提取的循環特徵為框架(圖1)，用培育的iRBC刺激活體外人脾臟模型中觀察結果 的示意圖(參見圖2-幻。環狀和裂殖體iRBC的主要表型特徵不同，環狀-iRBC在體外未 表現出細胞粘連性質，並且沒有可見的表面修飾。在快室中，對應於組織切片上的濾泡周圍 區域，只保留了裂殖體-iRBC，而環狀和裂殖體-iRBC都保留在慢室中，對應於紅髓(b)。這 導致顯著不同的清除率。流向慢室的血液比例(10.2% )和在相同的腔室中保留的可保留 環狀-iRBC的比例(11%)之間的相似性是驚人的。脾微循環框架的量化尺度很重要。因為，5%的心輸出量去往脾，指定的RBC將每20分鐘進入脾臟一次。慢室僅佔脾血漿流的 10%，相當於脾紅血球細胞流的10-20% (依賴於血漿撇取效應的強度「)。因此，指定RBC 的變形能力的性質控制每100-200分鐘發生一次。這與健康對照中先前觀察到的僵化的加 熱RBC 60分鐘的半衰期相吻合％。這些先前臨床觀察的數量級與我們的框架完美吻合。圖7 (al-6)在120分鐘灌注過程中灌注液中熱帶瘧原蟲FUP裂殖體_iRBC( Δ三 角)和環狀_iRBC( ·圓點)的寄生蟲感染量(6個獨立實驗)。圖8. (a)使用來自成年非洲患者的超免疫血清池(1/100稀釋)，對於為實驗制 備的培育裂殖體-iRBC(al)和環狀_iRBC(a2)群體進行的表面免疫螢光，並用Hoechst 計數染色。典型的吉氏染色部分如插入部分所示。大多數裂殖體-iRBC可強烈染色，而 環狀-iRBC未染色(橫槓=ΙΟμπι)。(U)來自表面碘化的培育裂殖體-iRBC(Q和環 狀-iRBC(I )的Triton-SDS提取物的PAGE自動放射攝影。僅在裂殖體-iRBC提取物中觀 察到正確地對應於PfEMPl的^OkDa條帶(箭頭)。圖9.能夠用於篩選可增加熱帶瘧原蟲環狀感染RBC的剛性的化合物的實驗步驟 示意圖。圖10.用多孔通道膜進行的重力驅動過濾常用裝置和實驗步驟。1.將柱充滿過 濾培養基(補加4%白蛋白和5%Plasmion 的RPMI，或補加人白蛋白的PBS) ；2.過 濾前將過濾單元(包含補加溶解白蛋白的懸浮培養基)阻斷10分鐘；3.將樣品(過濾培 養基中血細胞比容為2% -2. 5% )載入柱；4.過濾步驟；5.從過濾單元的上遊和下遊取得 樣本；6.處理樣本用於Pf-iRBC濃度和紅血球溶解的定量。圖11.多孔通道膜過濾。A-C，E.使用的過濾單元；A.使用的聚碳酸酯膜的類型； B.膜模具；C.膜；E.與柱連接的過濾單元(不斷過濾)；D.在穿過Merlitech。聚碳酸酯 膜時RBC的理論性狀改變；F.在分別通過2和3 μ m寬通道連接的膜下遊的樣本的上清液 顏色。2 μ m樣本表現出溫和至中等的紅血球溶解。圖12和13.珠層過濾。A.珠來源；B.用於保持珠層的吸頭(Barrier吸頭1000 ； Neptune) ；C.在傾析前(Cl)和傾析後((^)用尺度減小的珠載入吸頭；D.吸頭中珠層的示 意圖；E. 7-mm 5_25珠層的圖。圖14和15.通過自然和人工內皮間間隙時RBC的形狀變化。圖14. Al.脾紅髓中的索(Co)和竇內腔(si) ；A2-3.在通過竇壁時RBC發生擠壓 (箭頭)(離體-灌注人脾的吉氏染色塗片)。B和C.在離體-灌注人脾中從索到竇內腔 通過內皮間間隙時RBC發生擠壓(箭頭)(投射和掃描電鏡)。D1-2.通過聚碳酸酯膜通道 (Dl)或珠間空間(D2)時RBC擠壓的示意圖。圖15. A.在人脾紅髓中的內皮間間隙觀察到的RBC和內皮細胞(EC;虛線)的形 狀(透射電鏡)；B.在珠間空間(相同尺寸的珠的混合物)中最窄處的最大直徑的幾何計
笪弁。圖16.用於過濾的注射密封迴路參照方法-原理。圖17.用於過濾的注射密封迴路參照方法-三次過濾的裝置。1.具有控制屏幕的 電子注射泵(從左到右)，可顯示流量(ml/分鐘)、終體積(ml)和壓力；2. 3-三通管；3.過 濾膜(箭頭)；4.收集管。圖18.基於離心的過濾。1. Eppendorf管中過濾單元的裝置；2.離心前過濾單元中的上遊樣本；3.離心機中的過濾單元和Eppendorf管；4.第一輪離心結束時的過濾單元； 5.第一輪離心結束後的收集管(下遊樣本)。圖19.用於定量寄生蟲感染量的基於液相螢光的方法-螢光強度和寄生蟲感染量 之間的線性關聯，如根據吉氏染色塗片或液相螢光所平行確定的。對10%寄生蟲感染量的 培育樣品進行梯度2倍稀釋的三次重複分析。圖20.用於定量寄生蟲感染量的基於液相螢光的方法-基于吉氏染色和基於螢光 對寄生RBC濃度降低(或增加)的估計值之間的線性關聯。上遊到下遊(下半部)或上遊 到珠層(上半部)分析。X軸過濾器中的保留率，如根據吉氏染色塗片所估計的；Y軸過 濾器中的保留率，如通過螢光所估計的。圖21.來自圖20中用於定量寄生蟲感染量的基於液相螢光的方法的子部分-上 遊到下遊保留率的詳細分析，確證寄生蟲階段對於過濾器中保留具有強烈依賴性。X軸過 濾器中的保留率，如根據吉氏染色塗片所估計的；Y軸過濾器中的保留率，如通過螢光所 估計的。
具體實施方式
本發明涉及篩選能增加受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的紅血球 細胞(RBC)剛性的化合物的方法，所述方法包括或由下述步驟組成a)培育受所述寄生蟲感染的RBC，並可選地和單獨地培育未感染RBC，每種培育均 在存在和不存在待測試化合物的情況下進行，其中測試化合物增加且具體為選擇性增加受 感染RBC(iRBC)的剛性的能力，和；b)測定在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力，和不存 在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力；和，c)可選地，測量在存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力， 和不存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC相比，在存在化合物的情況下 培育的iRBC的變形能力下降至少5%，優選至少10%，並且更優選至少15% (具體地，剛性 增加至少5%，優選至少10%，並且更優選至少15% )，則表明所述化合物能增加iRBC的剛 性。在具體的實施方案中，所述篩選方法包括或由下述步驟組成a)培育受所述寄生蟲感染的RBC，並可選地和單獨地培育未感染RBC，每種培育 均在存在和不存在待測試化合物的情況下進行，其中測試化合物增加且具體為選擇性增加 iRBC剛性的能力，和；b)測定下述的變形能力-在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC，-不存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC，-在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC，和-不存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC相比，在存在化合物的情況下 培育的iRBC的變形能力下降至少5%，優選至少10%，並且更優選至少15%，則表明所述化 合物能增加iRBC的剛性。本文使用的「化合物」可以是任何化學化合物、免疫球蛋白(Ig)、多肽、肽，或其它能增加iRBC剛性的生物治療劑。化學試劑，在本領域中指「小分子」化合物，其通常是有機、 非肽分子，分子量最高10，000，優選最高5000，更優選最高1000，並且最優選最高500道爾 頓。可以使用已知方法產生Ig，並且Ig可以是示例性多克隆、單克隆、人化或嵌合抗體、單 鏈抗體或Fab片段。「肽」或「多肽」是兩個或更多胺基酸(「肽」是2-20個胺基酸，而「多 肽」是多於20個胺基酸)的任何鏈，包括天然發生或非天然發生的胺基酸殘基和胺基酸殘 基類似物，無論是否進行翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。這種化合物可以從任何合 適的來源獲得或者由任何合適的來源產生，無論來源是否天然。只要適當，可以通過任何化 學或生物合成技術合成所述化合物。根據特定的實施方案，篩選化合物庫。具體地，可以篩選來自Sanofi Aventis的庫。根據特定的實施方案，篩選的化合物能與包括其皮質細胞骨架的RBC膜(至少包 括其皮質細胞骨架的iRBC膜)相互作用和/或進入RBC (至少進入iRBC)，特別是穿過RBC 的脂雙層(至少是iRBC脂雙層)，或者與修飾的脂雙層本身相互作用。根據特定的實施方案，篩選的化合物通過增加其剛性而選擇性地與iRBC相互作 用。通過「選擇性地與iRBC相互作用」，在本文表示篩選的化合物與iRBC相互作用並增加其 剛性，而不增加未感染RBC並優選其它類型細胞的剛性。這意味著人們篩選在化合物存在 的情況下培育的未感染RBC的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的未感染RBC 的變形能力相同或者相差小於5%。在特定的實施方案中，通過「iRBC」，或「瘧原蟲感染iRBC」，在本文表示環 狀-RBC (或環狀-宿主RBC)和/或配子體-宿主RBC，特別是成熟配子體-宿主RBC。根據特定的實施方案，篩選的化合物通過增加其剛性而選擇性地與環狀-iRBC和 /或配子體-宿主RBC特別是成熟配子體-宿主RBC相互作用。通過「選擇性地與環狀-iRBC 和/或配子體-宿主RBC相互作用」，在本文表示篩選的化合物與環狀-iRBC和/或配子 體-宿主RBC相互作用並增加其剛性，而不增加未感染RBC和優選其它類型細胞的剛性。這 意味著人們篩選(1)在化合物存在的情況下培育的裂殖體-iRBC的變形能力，其與在不存 在化合物的情況下培育的裂殖體-iRBC的變形能力相同或者相差小於5%，和(ii)在化合 物存在的情況下培育的未感染RBC的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的未感 染RBC的變形能力相同或者相差小於5%。根據特定的實施方案，篩選的化合物通過增加其剛性而選擇性地與環狀-iRBC和 /或配子體-宿主RBC特別是成熟配子體-宿主RBC相互作用。通過「選擇性地與環狀-iRBC 和/或配子體-宿主RBC相互作用」，在本文表示篩選的化合物與環狀-iRBC和/或配子 體-宿主RBC相互作用並增加其剛性，而不增加配子體階段iRBC(配子體-iRBC)的剛性，也 不增加未感染RBC和優選其它類型細胞的剛性。這意味著人們篩選(1)在化合物存在的情 況下培育的裂殖體-iRBC的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的裂殖體-iRBC 的變形能力相同或者相差小於5%，和(ii)在化合物存在的情況下培育的未感染RBC或其 它類型細胞的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的未感染RBC或其它類型細胞 的變形能力近似相同或者相差小於5%。通過「增加iRBC剛性的能力」，在本文表示將iRBC剛性增加至少5%，優選至少 10%和更優選至少15%的能力。化合物增加iRBC剛性的能力可以特別地通過測量在所述
13化合物存在和不存在的情況下培育的iRBC變形能力而評價。因此，根據特定的實施方案， 「增加剛性」表示「降低變形能力」和特別地「將變形能力降低至少5%，優選至少10%和更 優選至少15%」。通過「由瘧原蟲屬的原生動物寄生蟲感染」，在本文表示包含至少一種瘧原蟲屬的 寄生蟲[即，所述原生動物寄生蟲的子細胞，其是無性繁殖的結果]的紅血球細胞。根據一個實施方案，寄生蟲選自下足熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日 瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似蛋形瘧原蟲、巴西瘧原蟲、許氏瘧原 蟲和吼猴瘧原蟲，優選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、諾氏瘧原蟲和三日 瘧原蟲，和更優選選自下組熱帶瘧原蟲和間日瘧原蟲。在特定的實施方案中，所述寄生蟲是熱帶瘧原蟲，具體為熱帶瘧原蟲的I^lo Alto I菌株。根據特定的實施方案，寄生蟲，特別是包含感染RBC的裂殖體已發育成為環狀；因 此，所述感染RBC處於環狀階段。具體地，可以收集新鮮的環狀-感染RBC (環狀-iRBC)，即 少於14小時的環形-iRBC，少於8天或者8天的RBC (優選少於8天的RBC)。可替換地或者漸漸地，RBC可以是配子體-宿主RBC，並且優選成熟配子體-宿主 RBC。可以通過在發育瘧原蟲寄生蟲時人工同步化而篩選環狀-iRBC和/或配子體-宿 主RBC。本領域中已知幾種方法，例如使用山梨醇或甘露醇處理；用5%山梨醇處理iRBC (例 如37°C 5分鐘)引起包含晚期在內的iRBC裂解，並且優先篩選早期環狀階段的iRBC。可 以重複處理(至少兩次，例如，2、3、4或5次或者多於5次)，例如在34小時後，以進一步篩 選早期階段並促進同步化。其它技術包括分離晚期階段寄生蟲，例如在Plasmagel或結冷 膠中沉降。因此，在一個實施方案中，本發明的篩選方法的步驟a)後面進行iRBC培育物的 同步化的步驟。根據一個實施方案，RBC(未感染和/或感染RBC)是人RBC。還可以使用來自靈長 類猿猴的RBC，但是更優選使用人RBC。所有血型的人RBC都適合於瘧原蟲生長，並且特別 適合於熱帶瘧原蟲生長。0型RBC特別適用，因為它們與所有其它血型的人血清或血漿相容。進行的篩選可以是低通量篩選或高通量篩選。可替換地，本發明的篩選方法可以 包括低通量篩選的一個或幾個步驟和高通量篩選的一個或幾個步驟。可以將RBC或iRBC變形能力定義為在微循環期間不破裂或損失完整性而發生充 分變形的能力，和承受動脈循環切應力的能力。因此，RBC和iRBC變形能力的測量是表型測量。可以在群體細胞水平和/或個體 細胞水平進行。因此，本發明的篩選方法包括在群體細胞水平變形能力分析的一個或幾個 步驟和/或在個體細胞水平變形能力分析的一個或幾個步驟。為了評價iRBC的變形能力，並且特別是評價環狀-iRBC和/或配子體-宿主RBC 的變形能力，通常在37°C或38°C，在RPMI 1640培養基或補加的RPMI 1640培養基中培育 RBC和iRBC，比如完全培養基(RPMI 1640培養基、碳酸氫鹽、25mM穀氨醯胺、0. 2%葡萄糖、 100 μ M次黃嘌呤、10 μ g/ml慶大黴素和10% AB+未活化人血清池)。此外，這些細胞優選 在低氧壓力(低PO2)條件(通常為1-5% O2)中培育，例如，在02、3% 0)2和96% N2的氣氛下培育。RBC和iRBC可以培育0. 1至10小時，優選1至6小時，並且更優選1至3小時，例 如用待測試化合物培育1、2或3小時。因此，在本發明的篩選方法中，步驟b)在步驟a)之 後可以進行0. 1至10小時，優選1至6小時，並且更優選1至3小時，例如1、2或3小時。通常在(i)去除培育物上清液(例如通過在1500轉每分鐘離心5分鐘)和(ii) 將細胞團在白蛋白的PBS溶液或白蛋白的RPMI溶液中重懸後進行變形能力分析。已經提出了測量RBC變形能力中的各種技術，特別是雷射衍射術、檢電術、微流 體、微量吸管吸引術和光鉗的使用。因此，根據一個實施方案，通過檢電器、雷射衍射器、微 流體設備(特別是毛細管微流體系統)、微量吸管和/或光鉗測量RBC和iRBC的變形能力。雷射衍射器在各種切應力水平下使用雷射衍射分析。這種技術與其它技術相比有 幾點優勢，它的操作相對簡單，具有可接受的精確度，能在各種切應力操作，並且能使用極 小量的血液(少於50 μ 1)快速測量細胞變形能力。自動化的雷射衍射器市場有售。在本 發明的篩選方法中可以使用的模型包括LORCA(雷射輔助光旋細胞分析儀；Mechatronics， Hoorn, Netherlands)和 RHEODYN-S SD(Myrenne, Roetgen, Germany)。雷射衍射器使用激 光衍射儀和圖像分析，通過測定流體切應力下細胞的伸長指數值而提供對細胞變形能力的 測量。處理RBC以增加切應力並記錄通過懸浮液時的雷射衍射模式。隨著切應力值增加， 雷射衍射模式從圓形變成橢圓形。根據這些測量結果，可以獲得細胞的伸長指數。根據特定的實施方案，用於測量RBC和iRBC變形能力的雷射衍射器是商業旋轉類 型的雷射衍射器，L0RCA。使用這種雷射衍射器，將RBC的粘性懸浮液在兩個同軸圓柱體之 間剪切。如實例部分所示，一個圓柱體的旋轉引起RBC的變形(伸長)。用攝像機檢測雷射 束衍射模式並通過計算機將其轉化為數字值，伸長指數(EI)，而進行分析。因此，在一個實施方案中，並且特別是當使用雷射衍射器時，參照伸長指數(EI) 進行變形能力的測量。這種度量，其通常定義為橢圓體衍射模式的兩個軸之間的差和這兩 個軸的和的比例，通常使用橢圓擬合程序根據衍射模式中的強度曲線而確定。在群體細胞 水平分析變形能力時，用於測量RBC變形能力的技術經常得到平均值的指標。此外，在一個實施方案中，並且特別是當使用雷射衍射器時，RBC和iRBC的變形 能力，並且通常是伸長指數，通常在0至35帕斯卡(Pa)的切應力範圍內測量，優選0.3至 30Pa,例如1. 7Pa至30Pa,並且特別是在1. 7Pa和/或30Pao根據特定的實施方案，iRBC的寄生蟲感染量水平為細胞群體的至少20%或30%， 優選細胞群體的至少50%，和更優選細胞群體的至少70%。通過「寄生蟲感染量(parasitemia)」，指用培育物中包含至少一個環狀或配子體 的RBC的百分比表示的寄生蟲的數量含量。可以計數寄生蟲的數量，例如，使用光學顯微 鏡，在薄血液圖片(對於高寄生蟲感染量)或厚血液斑點(對於低寄生蟲感染量)上計數。通常，並且特別是在群體細胞水平測量RBC和iRBC變形能力的時候(例如當使用 雷射衍射器時)，在不同寄生蟲感染量(至少兩個不同寄生蟲感染量)測量EI，例如對於環 狀-iRBC為4%至76%寄生蟲感染量，並且外推至100%寄生蟲感染量。根據一個實施方案，對於在存在待測試化合物的情況下培育的iRBC，在外推至 100%寄生蟲感染量時，在30 ，低於0. 43的EI，更優選低於0. 42的EI，則表明所述化合物 能增加iRBC剛性。
通過用iRBC的培育物，特別是用包含裂殖體階段的iRBC的培育物感染(或再 次感染)所述RBC可以在RBC(未感染或已經感染的RBC)的培育物中誘導或增加寄生蟲 感染量。可以將裂殖體階段的iRBC富集在iRBC培育物中，例如通過懸浮在凝膠狀溶液 (plasmion 處理)中或通過本領域已知的其它技術，特別是使用細胞分離液梯度。根據特定的實施方案，本發明的篩選方法的步驟a)中使用的iRBC群體已經通過 用iRBC培育物，並且特別是其中例如通過plasmion 處理已經富集了裂殖體階段iRBC的 培養物，感染未感染RBC，特別是新鮮的未感染RBC( S卩，小於8天或8天的RBC，優選小於8 天的RBC)。因此在特定的實施方案中，使用僅用於培育而不進行任何其它處理的iRBC測量 變形能力。因此，根據特定的實施方案，本發明的篩選方法包括或由下述步驟組成1)富集iRBC培育物中的裂殖體階段iRBC，例如通過plasmion 處理或通過本領 域中已知的任何其它技術富集；2)用步驟1)的裂殖體富集iRBC培育物感染RBC，特別是新鮮RBC( S卩，小於8天 或8天的RBC，優選小於8天的RBC)(這第二步可以獲得環狀階段的iRBC)；3)培育步驟2、獲得的iRBC，並且，可選地和單獨地培育未感染RBC，每種培育均在 存在和不存在待測試化合物的情況下進行，所述化合物用於測試其增加iRBC剛性的能力， 和；4)測量在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC和在不存在所述化合 物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力；和，5)可選地，測量在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC和在不 存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC的變形能力，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC的變形能力相比，在存在化合 物的情況下培育的iRBC的變形能力降低至少5 %，優選至少10 %，並且更優選至少15 %，則 表明所述化合物能增加iRBC的剛性。這種篩選方法的實例在實例部分中給出(參見實例B)。此外，在上述特定的實施方案中，iRBC培育物的寄生蟲，特別是裂殖體富集的 iRBC培育物的寄生蟲可以通過本領域任何已知的方法同步化，特別是通過本文所引用的任 何同步化方法，例如通過一次或幾次0、3、4或5或多於5次)山梨醇處理。所述同步化步 驟或至少一個同步化步驟優選在裂殖體-富集步驟前進行。根據一個實施方案，本發明的篩選方法進一步包括用離體灌注人脾模型和/或離 體灌注豬脾模型確認篩選的化合物的步驟。所述進一步的步驟通常在變形能力分析的步驟 後進行。根據本發明的特定實施方案，在上文公開的篩選方法中，使用本文定義的用於過 濾RBC的方法進行RBC或iRBC變形能力的測量，優選參照RBC或iRBC保留率或保留比例 (如後文所述)。本發明還涉及本發明的篩選方法的應用，用於篩選選擇性地與iRBC相互作用或 選擇性地與環狀-iRBC相互作用和或與配子體-宿主RBC(特別是與成熟配子體-宿主RBC) 選擇性地相互作用並適合增加其剛性的化合物。本發明還涉及用於過濾RBC的方法，其能在過濾單元中使具有異常具體為降低的變形能力的RBC保留，所述方法包含或由下述步驟組成a)使包含RBC的樣品流過過濾單元；和b)取得流過過濾單元之前所述樣本的等分試樣(上遊等分試樣)和流過過濾單元 之後所述樣本的等分試樣(下遊等分試樣)；和c)可選地取得已經在過濾單元中保留的RBC (保留等分試樣)；和d)可選地分析上遊和下遊等分試樣和，可選地，保留等分試樣，並且特別地確定上 遊和下遊等分試樣，和，可選地，保留等分試樣中RBC或RBC子群體的濃度或密度。本發明用於過濾RBC的方法在過濾單元中使通常可在脾中體內保留的RBC保留， 並因此產生體內發生的脾過濾功能，特別是在人體內發生的脾過濾功能。通過「降低的變形能力」，(或增加的剛性或僵化)，在本文表示變形能力的部分或 全部損失。變形能力通常降低至少5%，優選至少10%和更優選至少15%。在本發明的特 定實施方案中，「降低的變形能力」表示「增加的剛性」。通常將取得的上遊、下遊和保留等分試樣放在微孔板中。密度的確定可以通過自 動化方法平行地對上遊和下遊等分試樣進行。在特定的實施方案中，用於過濾RBC的方法的步驟d)還包括計算過濾單元中RBC 或RBC子群體的保留率(即，保留的RBC或RBC子群體的百分比)，例如使用下述公式(下遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度-上遊等分試樣中RBC或RBC子群體 的密度)/上遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度可替換地，方法可以包括比較下遊和上遊中RBC或RBC子群體的密度的步驟，例如 通過確定保留比例(下遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度/上遊等分試樣中RBC或 RBC子群體的密度)進行比較。在特定的實施方案中，步驟d)包括確定上遊和下遊等分試樣，和，可選地，保留等 分試樣中的紅血球溶解，例如通過從離心後的上遊和下遊等分試樣，和，可選地，從離心後 的保留等分試樣定量上清液中的人乳酸脫氫酶(LDH)濃度而進行。在本發明特定的實施方案中，RBC是人RBC。包含具有異常並且特別是降低的變形能力的RBC的樣品優選用於本發明的過濾 RBC的方法中。這些RBC包括受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的RBC、加熱RBC和來自患 有遺傳或後天的免疫障礙以及遺傳或後天的RBC疾病的患者的RBC，並且優選來自患有遺 傳性或後天的疾病的患者的RBC，例如遺傳性或後天的球形細胞增多症、橢圓形紅細胞增多 症、敗血症、血紅蛋白病(α或β地中海貧血、鐮狀細胞疾病和鐮狀細胞性狀)、自免疫溶 血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它紅血球細胞 酶)1。在特定的實施方案中，步驟d)中分析的RBC或步驟d)中分析的至少一個RBC子群 體是異常RBC或瘧原蟲感染RBC(iRBC)，和特別地環狀-寄生iRBC或配子體-寄生iRBC， 例如成熟配子體-寄生iRBC。當分析iRBC，和特別是環狀-寄生iRBC或配子體-寄生iRBC時，步驟d)通常包 括或由下述組成-確定上遊和下遊等分試樣，和，可選地，保留等分試樣中的寄生蟲感染量百分比； 和
-可選地(i)使用下述公式確定過濾單元中的RBC保留率(下遊等分試樣中的寄 生蟲感染量百分比-上遊等分試樣中寄生蟲感染量百分比)/上遊等分試樣中寄生蟲感染 量百分比或(ii)保留比例(下遊等分試樣中寄生蟲感染量百分比/上遊等分試樣中寄生 蟲感染量百分比)。在本發明特定的實施方案中，寄生蟲選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧 原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似卵形瘧原蟲、巴西瘧原蟲、 許氏瘧原蟲和吼猴瘧原蟲，優選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、諾氏瘧原 蟲和三日瘧原蟲，和更優選選自下組熱帶瘧原蟲(Pf)和間日瘧原蟲，例如熱帶瘧原蟲的 Palo Alto I 菌株。在本發明的特定實施方案中，樣品的RBC已經經過(已知或新)化合物的處理，特 別是可能調節並優選增加RBC剛性的化合物，並且例如可以特異性調節和優選地增加iRBC 剛性的化合物(特別是特異性作用於環狀-寄生iRBC和/或配子體-寄生iRBC的化合 物)。在本發明的過濾方法中通常使用小體積樣本，例如1-100微升積壓紅血球細胞的 樣本。樣本通常優選懸浮在懸浮培養基中，其包括、由或主要由補加4%白蛋白和5% Plasmion 或 1 % albumax II ⑧的 PBS 或 RPMI 組成。通過「主要由組成」，在本文表示可以在樣本中加入少量成分而不具有顯著影響。在本發明特定的實施方案中，已經從血液樣本(例如全血樣本)並優選從外周血 液樣本取得RBC，所述樣品先前獲得自患者。在本發明特定的實施方案中，未從血液樣本獲取RBC，但是優選通過稀釋血液樣本 (例如全血樣本)和優選稀釋外周血液樣本而區的RBC，所述樣品先前獲得自患者。本發明的過濾方法中使用的RBC和特別是iRBC可以從患者的血液樣本收集，所述 患者已經用具有調節和優選如本文所述增加RBC剛性的能力的化合物治療。例如，可以在 用所述化合物治療幾小時後收集所述RBC。可替換地，或累積地，本發明的過濾方法中使用的RBC和特別是iRBC可以通過體
外培育而獲得。特別地，可以在體外接觸具有調節和優選如本文所述增加RBC剛性的能力的化合 物後，特別是在存在所述化合物的情況下體外培育RBC和特別是iRBC(例如環狀-寄生 iRBC和/或配子體-寄生iRBC)後，收集用藥物處理的RBC。當使用包含iRBC的樣本時，可以通過用iRBC，特別是用其中已經富集配子體-階 段iRBC的iRBC培育物，感染RBC，優選小於8天的RBC，製備iRBC培育物，所述富集例如通 過plasmion 處理進行。在本發明的特定實施方案中，過濾單元的孔(或通道)的直徑在1至ΙΟμπι之間， 並且優選在1. 85至9. 4 μ m或1至3或1至2 μ m之間，例如直徑2 μ m。在本發明的特定實施方案中，過濾單元的通道的厚度小於Μμπι，並且優選小於 5 μ m0在本發明的特定實施方案中，由重力、衝洗(例如通過施加恆壓)、吸引或通過離 心驅動經過過濾單元的流動。
過濾單元通常放在柱(例如當經過過濾單元的流動是由重力或衝洗驅動時)或管 (例如當經過過濾單元的流動是由離心驅動時)中。在本發明的特定實施方案中，樣品的血細胞比容較低，例如小於5%，和更優選在 2% -2. 5%的範圍內。在本發明的特定實施方案中，過濾單元包含或由多孔通道膜組成，例如聚碳酸酯 多孔通道膜。來自Merlitech Corporation的多孔通道膜特別合適，其中通道直徑在1至 3 μ m範圍內，並且通道長度是M μ m。例如，可以使用來自Merlitech Coporation的2 μ m 寬和Mym厚的聚碳酸酯多孔通道膜。當使用多孔通道膜時，經過過濾單元的流動通常是重力驅動。特別地，步驟a)可 以是重力驅動並在恆壓下，例如80-85cm水的恆壓，和優選在約34-37°C的溫度進行。可替換地，過濾單元可以包含或由一個或幾個珠層組成，並且優選錫珠，其中過濾 單元中存在的珠的直徑在2-25 μ m或5-25 μ m的範圍內，並且其中由過濾單元內的珠間空 間形成的通道(孔)優選在0. 74禾口 9. 4 μ m或1. 85 μ m禾口 9. 4 μ m之間變化。在本發明的特定實施方案中，過濾單元中存在的每個珠層至少厚0.5-10 μ m，過濾 單元中珠的總厚度至少為5mm，優選7mm。例如，厚度至少為5mm和優選7mm的層，由等重的 珠的混合物組成，其直徑在5至15 μ m的範圍內，並且可以使用直徑在15至25 μ m範圍內 的珠。在特定的實施方案中，使用直徑從5至25μπι的珠的7mm厚的層。在另一個特定的 實施方案中，過濾單元包含直徑從5至25 μ m的珠的7mm厚的層和包含小於5 μ m的較小直 徑的珠的上層。在過濾單元中，珠層堆積在適於保留珠的過濾膜上，並且其不影響過濾單元 的保留能力。當使用珠層時，通常使用注射壓力流或通過離心(例如通過在1500_2500g離心 1-2分鐘)實現經過過濾單元的流動。例如，可以使用電泵在8分鐘內(即終體積為8ml) 產生經過層的懸浮培養基(例如PBS+1 ^Albumax II)的恆定Iml/分鐘流體。壓力上限 可以是例如999mbar。可替換地，也可以使用其它技術實現經過過濾單元的流動，並且可以 是，例如，重力驅動。在本發明的特定實施方案中，使用珠層並在恆壓下，例如80-85cm水的恆壓，和優 選在約20-25°C的溫度進行步驟a)。當本發明用於過濾RBC的方法包括取得已保留在珠層中的RBC的步驟c)時，這個 步驟可以例如通過差異傾析(例如，在通過重力傾析1-3分鐘的幾個步驟後)進行。使用本發明用於過濾RBC的方法，在群體細胞水平上進行RBC分析，特別是iRBC 分析。在本發明的特定實施方案中，步驟d)和具體的RBC密度或寄生蟲感染量確定，通 過液相螢光定量方法或在吉氏染色後進行。加熱RBC或感染寄生蟲的RBC的螢光定量可以 通過分別用PKH-沈或STOR-I染色而進行。通常使用計數器定量螢光強度，例如FLX-800 計數器。本文公開的任何方法可以體外進行。在另一個方面，本發明涉及本文公開的用於過濾RBC方法的應用，其用於篩選能 調節RBC和特別是受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的RBC變形能力，並且特別是誘導或增 加其剛性的化合物，例如在如本文所公開的篩選能增加瘧原蟲-iRBC的剛性的化合物的方
19法中的應用。在優選的實施方案中，根據增加受感染RBC的保留率或保留比例的能力篩選 化合物。本發明的過濾方法允許進行低通量篩選或中或高通量篩選。在本篩選方法的特定實施方案中，篩選的化合物能與包括其皮質細胞骨架的RBC 膜相互作用(至少是包括其皮質細胞骨架的iRBC膜)和/或進入RBC (至少是進入iRBC)， 特別是穿過RBC脂雙層(至少是iRBC脂雙層)，或者與修飾的脂雙層本身相互作用。在本發明的特定實施方案中，這種用於篩選化合物的方法包括或由下述步驟組 成-將本發明用於過濾紅血球細胞的方法用於包含RBC的樣品的兩個等分試樣，其 中只有一個等分試樣先前已經接觸過待測試化合物，其中要測試化合物調節和優選增加 RBC剛性的能力(未接觸的等分試樣作為內部對照)；和-比較兩個樣本等分試樣確定的RBC保留率或保留比例，其中RBC保留率的絕對數 值或保留比例之間至少5%，優選至少10%和更優選至少15%的變化說明所述化合物能調 節RBC的剛性/變形能力，並且其中與未接觸化合物的樣本等分試樣所獲得的RBC保留率 或保留比例相比，接觸化合物的樣本等分試樣所獲得的RBC保留率(絕對數值)或保留比 例至少5%，優選至少10%和更優選至少15%的增加說明所述化合物能增加RBC的剛性/ 降低RBC的變形能力。在另一個方面，本發明涉及本文公開的用於過濾RBC的方法的應用，其用於篩選 可以選擇性與受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的紅血球細胞(iRBC)相互作用，並且特別 地與環狀-iRBC和/或配子體-宿主RBC，特別是成熟配子體-宿主RBC相互作用，並且適 合於調節和特別地增加其剛性(降低其變形能力)和還適合於根據本發明增加這些iRBC 在過濾單元中的保留率或保留比例的化合物。因此，本發明的過濾方法可以用於篩選能特異性地降低環狀-宿主RBC和/或配 子體-宿主RBC(特別是成熟配子體-宿主RBC)的變形能力(即，增加剛性)並且因此誘 導、增加和/或加快這些細胞在脾中的保留並可能從循環血液將這些細胞進行脾依賴性的 清除。因此篩選的化合物可用於治療瘧疾。活性定義為化合物誘導或增加過濾介導的iRBC 保留的能力。在另一個方面，本發明涉及本文公開的過濾RBC的方法的應用，用於分離和/或檢 測具有異常並且特別是降低的變形能力的RBC的應用，例如用於與異常RBC變形能力和特 別地RBC變形能力降低有關的臨床病症的體外診斷/檢測。在本發明的特定實施方案中，如本文所公開的用於過濾RBC的方法，用於分離和/ 或檢測來自患者的血液樣本中的iRBC和特別是環狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC (例 如成熟配子體-宿主RBC)，所述患者已經受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲(例如熱帶瘧原蟲) 感染。在本發明的另一個特定實施方案中，如本文所公開的用於過濾RBC的方法，用於 分離和/或檢測與後天或遺傳疾病相關的RBC，診斷或預診斷影響RBC變形能力的後天或遺 傳疾病，例如遺傳性或遺傳的球形紅細胞症(即，用於分離和/或檢測球形紅細胞症)、橢 圓形紅細胞增多症、敗血症、血紅蛋白病(α或β地中海貧血、鐮狀細胞疾病和鐮狀細胞性 狀)、自免疫溶血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它 紅血球細胞酶)。
在本發明的另一個特定的實施方案中，如本文所公開的用於過濾RBC的方法，用 於分離具有異常特別是降低的變形能力的RBC進行實驗研究。本發明的用於過濾RBC的方法還可以用於分析和/或分離RBC子群體，和特別是 iRBC，特別是環狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC。在本發明的另一個特定的實施方案中，如本文所公開的用於過濾RBC的方法用於 測試對患者施用的抗瘧疾藥物的效果。在用藥幾小時或幾天後，對從患者收集的接觸藥物 的瘧原蟲感染RBC使用過濾方法，觀察到的用藥前和用藥後取得的瘧原蟲-iRBC樣本的保 留率或保留比例的變化說明藥物降低由脾進行的瘧原蟲-iRBC的變形能力-依賴性的瘧原 蟲-iRBC保留或消除。最後，因為實驗RBC過濾是脾過濾功能最好的替代品，所以可以提供體外分析患 者脾功能的有用的測試基礎，並且特別是分析患有遺傳或後天免疫障礙以及遺傳或後天 RBC疾病的患者脾功能的有用的測試基礎。
實施例實施例A.在人脾的慢速、開放微循環中熱帶瘧原蟲環狀-感染紅細胞的保留患者、材料和方法人類志願者的超聲造影。根據下述入選標準招募16名18-50歲健康男性志願者 無動脈粥樣化風險因素(即，動脈壓力正常，不抽菸或無抽菸史，血清膽固醇水平正常)，無 腹部外科手術史，無重大健康問題或過去無重大健康問題(體檢正常，血清肌酸酐、AST和 膽紅素水平正常，和無HIV、HBV和HCV抗體)，通過傳統超聲和Doppler評價為脾微血管結 構正常，和無紅血球細胞疾病的臨床或生物症狀-包括血細胞數、血清觸珠蛋白和血紅蛋 白電泳正常。研究得到Necker醫院研究審查委員會的批准，書面的知情同意書可從所有 參加人員處獲得。以Iml/分鐘的恆定注射速率皮下注射超聲造影劑(Sonovue。，Bracco, Mi Iano, Italy)。使用 Philips HDI 5000 (Philips US, Bothell, WA, USA)進行超聲造影。 使用反向脈衝成像以低機械指數用線性變換器(LlO-幻將脾成像，使微泡破壞降至最小17， 成像在灌注開始後2分鐘開始。每次圖像獲取重複3次，並且將原始數據傳送至PC進一 步定量。使用HDILab (Philips US, Bothell, WA, USA)為每個回放片段定量，HDI Lab是考 慮了壓縮圖並且允許以線性單位定量的軟體。根據位於被膜下區域中的感興趣區域(ROI) 計算信號強度。移動ROI位置，以補償呼吸移動和皮下假象。將時間-強度曲線導出至 Deltagraph(Red Rock軟體，&ilt Lake City，UT，USA)。使用雙指數模型擬合數據。使用 數據和模型之間的關聯繫數估計擬合的質量。人脾的取得。如述7取得並處理脾臟。未修改治療和外科手術護理，並且獲得患 者書面知情同意書。計劃由Ile-de-France II研究調查委員會批准。出現與外科手術有 關的30至90分鐘的熱缺血時，一旦病理學家對脾臟進行了肉眼檢查，並且在需要時進行了 實驗前切片處理，即可向脾臟主動脈中插管。為轉移至實驗室，脾臟中充滿冷的Krebs-白 蛋白溶液。寄生蟲。如述19培育熱帶瘧原蟲I^alo-Alto (FUP-CB13)、D10W和FCR-3。重複進行 人無黑色素的黑素瘤細胞(C32)2°的盤選分離(panning)，直至獲得多於5個iRBC每個C32 細胞的細胞粘連率。擴增細胞粘連iRBC，並粗略地通過凝膠浮選同步化，直至歷時少於16小時發生完全的再侵入，然後儲存在液氮中，每份等分試樣> :3ml。在脾臟刺激前7天內，將 等分試樣解凍，並允許寄生蟲再侵入未感染RBC。在脾臟刺激前14小時內，通過凝膠浮選 方法消除環狀，並且成熟形式可以在剛剛收集(< 7天)和洗滌過的RBC中再次侵入，獲得 2-7%寄生蟲感染量的7-40ml積壓的RBC，其在導入灌注液前在RPMI中洗滌一次。活體脾灌注。如述7在由受調節暖空氣維持在37°C的Plexiglas腔室中進行離 體-灌注脾實驗。簡而言之，在實驗室中(冷缺血時間，60-90分鐘)，將脾臟與灌注設備相 連接，並通過將Krebs-白蛋白培養基流量歷時40-60分鐘從Iml/分鐘增加至50_150ml/ 分鐘而進行從6-10°C至337°C的漸進式加溫。在這個適應階段，將患者的RBC從脾臟衝 出(在加溫末期血細胞比容<0. )。當脾臟溫度到達35°C時，加入未感染的0+RBC(最 終的血細胞比容水平為5-10% )並使其循環30至60分鐘。使用Ktat設備(Abbott實 驗室，abbott Ppark, ILL, USA)，每10-30分鐘監控靜脈、動脈和儲備庫中的葡萄糖、Na和 K濃度、02和0)2分壓，和？扎在穩態時，關鍵的生理標誌維持在下述範圍灌注液流速 0. 8-1. 2ml/克灌注脾軟細胞組織/分鐘，脾被膜的溫度為36. 7-37. 2°C,Na為135_148mEq/ 1，K為4-5mEq/l，葡萄糖4-12mmol/l, pH 7. 2-7. 35，血細胞比容4-10%，而動-靜脈氧分 壓延遲為60-120mmHg。最後，在將正常RBC衝出5_10分鐘後(引入iRBC前的血細胞比容
32小時的裂殖體_iRBC(侵入後40士8小時)和
<14小時的環狀_iRBC(侵入後7士7小時)的混合物引入循環系統2小時。在用Hoechst 33342(1 1000 稀釋；Molecular Probes, LSR, Becton-Dickinson，France)為 iRBC 染色 後，根據吉氏染色薄塗片或通過流式細胞儀分析而定量寄生蟲感染量。使用CELLQuest軟 件(B ecton-Dickinson, France)分析數據。寄生蟲分階段和計數。完全如述1固定並處理脾臟組織。脾臟組織內的個體寄生 蟲核、細胞質和瘧疾色素易於鑑別。根據下述標準劃分iRBC階段。環狀-iRBC:淺褐色點 (核)< 1 μ m，薄的藍色細胞質或灰色圓形區域lym或>1( )，厚的藍色細胞質的褐色點彡1/2紅細胞大小。紅細胞外寄生蟲殘 餘褐色點周圍沒有紅色染料。對於每個脾臟切片，在濾泡周圍帶和鄰近> 3個濾泡的紅髓 中計數RBC。選擇可以清晰地與白髓相區分的紅髓、鄰近的濾泡周和紅髓進行計數。計數環 狀和裂殖體-iRBC並且每個脾臟位於約150張照片(至少4000個RBC)上。透射和掃描電子顯微鏡。在灌注末期，將脾臟樣本(Imm3)在4°C於補加 CaC12(0. 05% )的0. 08M甲次砷酸鹽緩衝液中的2. 5%戊二醛和多聚甲醛中過夜固定。 對於TEM，將固定的樣本用0. IM甲次砷酸鈉緩衝液漂洗三次，用四氧化餓、1. 5%鐵氰酸 鉀的0. IM甲次砷酸鈉緩衝液溶液在室溫後固定1小時，並再用0. IM甲次砷酸鈉緩衝液洗 滌。將樣本通過梯度系列的乙醇浴(25%至100% )並於室溫在Epon812/氧化丙烯混合 物中過夜，使樣本脫水。在嵌於Epon 812中後，將樣本在60°C聚合48小時。使用Leica ultracut UCT薄片切片機製備超薄片，並用在SOkV操作的JEOL 1200 EX電子顯微鏡檢查。 對於SEM，將固定切片在0. IM甲次砷酸鈉緩衝液中洗滌三次，每次10分鐘，在(w/v)四 氧化餓、1. 5%鐵氰酸鉀的0. IM甲次砷酸鈉緩衝液的溶液中後固定1小時。在25^^50%, 75%和90%梯度系列的丙酮溶液中脫水10分鐘(每次)。然後將樣品在100%丙酮中脫水 3X10分鐘，之後用C02進行臨界點乾燥。用22nm金鈀為乾燥的切片鍍膜，用在5kV或7kV 操作的JEOL JSM 6700F場發射掃描電子顯微鏡檢查並拍照。用上方的SE檢測器(SEI)和下方的二級檢測器(LEI)獲得圖像。RBC變形能力的測量。使用雷射輔助光旋細胞分析儀(LORCA ;MeChatr0niCS， Hoorn, The Netherlands)，如前所述21，通過雷射衍射器測量RBC和iRBC變形能力。RBC變 形能力的單位，即伸長指數(Ε. I.)，定義為橢圓體衍射模式的兩個軸之間差和這兩個軸之 和之間的比例。在切應力(0.3至30帕斯卡)的範圍內評價紅血球細胞變形能力，所述範 圍包括1. 7Pa,其近似對應於循環14動脈側的靜脈壓力，和30Pa，其在RBC需要擠壓通過小 的細胞間間隙時出現在脾的正弦曲線中。紅細胞表面免疫螢光試驗。如述，進行該試驗以檢測表面iRBC寄生蟲蛋白。從 培育物製備PBS中懸浮的iRBC。用來自過免疫非洲成年人的血清(由P. Druilhe惠贈；用 PBS/1% BSA 1 100稀釋)進行RBC表面寄生蟲抗原的標記，然後用結合Alexafluor 488 的羊抗人親和純化IgG(l 200稀釋；Molecular Probes，Eugene，OR)標記。寄生蟲核用 Hoechst 33342(1 1000 稀釋；Molecular Probes)染色。將玻片插在 Vectashield 培養基 (Vector 實驗室，BurIingame，CA)中。使用由 Zeiss Axiovision 軟體控制的 Axiocam HRc 照相機，在kiss Axiovert 200M顯微鏡上獲得圖像(全部來自Carl Zeiss,Heidelberg, Germany)。iRBC的表面碘化。將先前通過盤選過程在細胞C32上篩選的高度同步化的成熟階 段iRBC，通過結冷膠浮選技術富集至80 %，然後用新鮮紅細胞稀釋(即，小於8天或8天的 紅細胞，優選小於8天的紅細胞)，在下一循環獲得約20%的環狀-iRBC。使用乳糖過氧化 酶方法μ進行表面碘化。在再侵入後14小時培育停止。依次用Triton X-10,2% SDS 提取蛋白質。如述μ進行樣品的蛋白酶處理(TPCK-處理的trypsin和a-chymotrypsin TLCK(Sigma))。在5_17. 5%梯度丙烯醯胺凝膠上分離碘化的樣品。使用Kodak Bio Max MSl膜進行自放射線照相。預染色的蛋白質標記物購自Life Technologies (Gaithersburg, Maryland)禾口 NewEngland BioLabs Inc. (Beverly, Massachusetts)。細胞粘連試驗。如前所述2°，研究了 iRBC對C32細胞的細胞粘連，其表達推定的 受體分子CD36和胞內粘連分子1 (ICAM-I)。總而言之，在25cm3的細胞培育搖瓶(Corning Incorporated,USA)中製備單層C32細胞。將以5xl06iRBC/ml的濃度懸浮於pH 6. 8的細 胞粘連培養基中的RBC加入細胞培育搖瓶並通氣(1 %02,3% CO2和96%隊)15秒，並每5分 鍾輕輕搖動，在37°C孵育15分鐘。在孵育結束時，輕輕將細胞培育搖瓶在RPMI 1640培養 基中漂洗四次。單層固定在甲醇中，用2%吉氏染色劑染色，並通過顯微鏡檢查。計數1000 個黑素瘤細胞上粘連的iRBC的數目。用100個C32細胞上粘連的iRBC數目表示結果。統計分析。我們使用student成對t_測試進行統計分析；ρ值< 0. 05認為顯著。 使用 WinNonLin 軟體(5. 1 版本；Pharsight Corp.，Moutain View, CA, USA)進行分區數據 分析。結果人脾中的循環腔室使用超聲造影在16名志願者中研究人脾的循環模式。開始注入造影劑後兩分鐘 (即，一旦獲得微泡的穩定濃度)，使用低機械指數脈衝反向成像研究脾臟。除了使用這種 較低的聲能外，隨著脾臟持續接觸超聲波束，一定量的微泡被破壞。時間-強度曲線反映了 信號強度的下降(圖1，材料與方法部分)。顯示出對於16名志願者中實驗延遲的最佳擬
23合的模型包括兩個指數項(所有案例中的關聯繫數R2> 0.96)。雙指數函數可以表示為 N (t) = V1 (C0exp (- β⑷)+V^ (B+ (C0-B) exp (- β 2t))，其中第一和第二項分別對應於慢速和 快速流動腔室。Ctl指初始微泡濃度，並且認為在兩個腔室中相等。V1和V2表示相對分數體 積(Vi+V2 = 1)，並且^和β 2分別表示每個腔室中的微泡平均粘度。對實驗曲線的分析 得到下述數值每個單腔室指數曲線的Y截距(Ylc^PYA)對應於CtlV1和CtlV2，其中l/β工和 1/β2對應於指數-特徵時間。在慢室中，慢室的平均(SD，範圍)相對分數體積是70.6% (9.6,51.5-84. 4)並且平均(SD，範圍)相對分數流量是 10. 12% (4. 40，3. 99-16. 47)(圖 1)。總之，這些觀察結果強烈支持人脾雙重微循環組織的存在(圖1)，其中約10%的血液 輸入經過慢室流動(圖1和6)。通過離體-灌注人脾清除iRBC用處於裂殖體階段(侵入後40士8小時)或環狀階段(侵入後7士7小時)的高 度同步化寄生蟲培育物灌注離體-灌注人脾。對灌注液的連續吉氏染色薄膜顯示，循環的 裂殖體-iRBC和出人意料的，環形-iRBC寄生蟲感染量迅速降低。在10和20分鐘內，裂 殖體-和環形iRBC寄生蟲感染量分別降至其初始數值的4. 5% (範圍0-12.9)和沈.3% (範圍22. 9-35. 4% )(圖加)。裂殖體-iRBC的完全清除很迅速，儘管環狀-iRBC寄生蟲 感染量下降的速率更慢並且到達平臺期(圖加)。與裂殖體-iRBC相反，環形-iRBC在其表 面既未顯示出結節寄生蟲蛋白，也未顯示出碘化寄生蟲蛋白質(圖8)，並且在C32人黑素瘤 細胞上和脾組織學檢查都未注意到有細胞粘連(數據未給出)(圖4)。脾臟刺激揭示的環狀-iRBC的不均一性環狀-iRBC的部分清除反映它們通過脾臟的較慢循環或其在脾臟中穩定的保留。 為了闡釋這個問題，將環狀-iRBC製備物分開，一部分立即灌注進入脾臟，而第二部分在 Krebs-白蛋白培養基中保持37°C (對照「脾原初」細胞)。開始灌注後四十分鐘(即40次 脾臟傳代)，從灌注液收集未保留的細胞。這些「脾傳代」和「脾原初」群體各自用不同的 PKH標記、匯集並重新引入脾臟。接著使用流式細胞儀分析來自灌注系統的連續樣本(圖 3)。「脾原初」環狀-iRBC的評價(SD)半衰期(5. 7士3. 1分鐘，兩次獨立實驗)與先前6次 試驗中觀察到的結果相似(參見結果的下一部分「iRBC清除的模型建立」)。相反，「脾傳 代」環狀-iRBC未清除(圖:3b，c)。這表明環狀-iRBC事實上由兩個不同的子群體組成，一 個保留在脾中而一個流走。環狀-iRBC群體的這種與脾臟保留有關的不均勻性在我們的培 育條件下長時間穩定，並且與灌注脾中引入的初始寄生蟲感染量無關(圖加)。它還與寄生 蟲菌株無關，因為用DlO獲得了相似的結果。
權利要求
1.篩選能增加受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的紅血球細胞(RBC)剛性的化合物的 方法，所述方法包含下述步驟或由下述步驟組成a)培育受所述寄生蟲感染的RBC，並可選地和單獨地培育未感染RBC，每種培育均在存 在和不存在待測試化合物的情況下進行，其中測試所述化合物增加且具體為選擇性增加受 感染RBC(iRBC)的剛性的能力；和，b)測定在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力，和不存在所 述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力；和，c)可選地，測量在存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力，和不 存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC相比，在存在化合物的情況下培育 的iRBC的變形能力下降至少5%，優選至少10%，並且更優選至少15%，則表明所述化合物 能增加iRBC的剛性。
2.根據權利要求1的方法，其中所述iRBC是環狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC， 特別是成熟配子體-宿主RBC。
3.根據權利要求1或2的方法，其中步驟a)使用的iRBC通過下述步驟獲得-用iRBC，特別是用其中裂殖體階段iRBC已經富集的iRBC培育物，感染RBC，優選小於 8天的RBC，所述富集例如通過用凝膠溶液例如plasmion 處理而進行。
4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中步驟a)和/或權利要求3的步驟之前進 行下述步驟-例如通過一次或幾次山梨醇處理而進行iRBC的寄生蟲或裂殖體富集iRBC培育物的 寄生蟲的同步化，。
5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其中-篩選在存在所述化合物的情況下培育的未感染RBC的變形能力，其與在不存在所述 化合物的情況下培育的未感染RBC的變形能力相同或者相差小於5%，和-可選地，篩選在存在所述化合物的情況下裂殖體-iRBC的變形能力，其與在不存在所 述化合物的情況下裂殖體-iRBC的變形能力近似相同或者相差小於5%。
6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其中進行的所述篩選是低通量篩選或高通量 蹄選。
7.根據權利要求1至6中任一項的方法，其中在群體細胞水平和/或個體細胞水平測 定RBC和iRBC的變形能力。
8.根據權利要求1至7中任一項的方法，其中RBC和iRBC的變形能力通過檢電器、激 光衍射計、微流體設備、微量吸管和/或光鉗測定。
9.根據權利要求8的方法，其中雷射衍射計是商業自動化儀器，優選為雷射輔助光 旋轉細胞分析儀(LORCA ;Mechatronics，Hoorn, Netherlands)或 RHEODYN-SSD(Myrenne， Roetgen, Germany)，並且更優選 LORCA。
10.根據權利要求8或9的方法，其中RBC和iRBC的變形能力在從0.3至30帕斯卡 (Pa)的切應力範圍內測定，包括1. 71 和30Pao
11.根據權利要求1至10中任一項的方法，其中iRBC的寄生蟲感染量水平是佔細胞 群體的至少20%或30%，優選為佔細胞群體的至少50%，並且更優選為佔細胞群體的至少70%。
12.根據權利要求1至11中任一項的方法，其中通過參照伸長指數(EI)進行變形能力 的測定。
13.根據權利要求12的方法，其中在100%寄生蟲感染量，30 外推時，對於在存在所 述化合物的情況下培育的iRBC，EI低於0. 43，更優選低於0. 42，則表明所述化合物能增加 iRBC的剛性。
14.根據權利要求1至13中任一項的方法，其中所述未感染和感染RBC是人RBC。
15.根據權利要求1至14中任一項的方法，其中所述寄生蟲選自下組熱帶瘧原蟲、間 日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似卵形瘧 原蟲、巴西瘧原蟲、許氏瘧原蟲和吼猴瘧原蟲，優選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵 形瘧原蟲、諾氏瘧原蟲和三日瘧原蟲，和更優選選自下組熱帶瘧原蟲和間日瘧原蟲。
16.根據權利要求1至15中任一項的方法，其中所述寄生蟲是熱帶瘧原蟲，具體為熱帶 瘧原蟲的I^alo Alto I菌株。
17.根據權利要求1至16中任一項的方法，其還包括用離體灌注人脾模型和/或離體 灌注豬脾模型驗證篩選的化合物的步驟。
18.根據權利要求1至17中任一項的方法，其中所述篩選的化合物能與包括其皮質細 胞骨架的iRBC膜相互作用和/或進入iRBC，特別是穿過iRBC脂雙層，或者與修飾的脂雙層 本身相互作用。
19.根據權利要求1至18中任一項方法的應用，其用於篩選選擇性地與受瘧原蟲屬原 生動物寄生蟲感染的紅血球細胞(iRBC)進行相互作用或者選擇性地與環狀階段的iRBC和 /或配子體-宿主RBC特別是成熟配子體-宿主RBC進行相互作用，並且適合於增加它們的 剛性的化合物。
20.用於過濾紅血球細胞(RBC)的方法，其使具有異常並且特別是降低的變形能力的 RBC在過濾單元中保留，所述方法包含下述步驟或由下述步驟組成a)使包含RBC的樣品流過過濾單元；禾口b)取得在流過過濾單元之前所述樣本的等分試樣(上遊等分試樣)和在流過過濾單元 之後的所述樣本的等分試樣(下遊等分試樣)；和c)可選地取得保留在過濾單元中的RBC(保留等分試樣)；和d)可選地分析上遊和下遊等分試樣和，可選地，保留等分試樣，並且特別地確定RBC或 上遊和下遊等分試樣和可選地保留等分試樣中RBC子群體的密度。
21.根據權利要求20的方法，其中步驟d)還包括計算⑴過濾單元中的RBC保留率， 例如使用下述公式(下遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度-上遊等分試樣中RBC或 RBC子群體的密度)/上遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度，或(ii)過濾單元中的RBC 保留率，使用下述公式下遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度/上遊等分試樣中RBC或 RBC子群體的密度。
22.根據權利要求20或21的方法，其中步驟d)包括確定上遊和下遊等分試樣中的紅 血球溶解，以及可選地，確定保留等分試樣中的紅血球溶解，例如通過定量離心後的上遊和 下遊等分試樣，以及可選地，離心後的保留等分試樣上清液中人乳酸脫氫酶(LDH)的濃度。
23.根據權利要求20至22中任一項的方法，其中樣品包含具有降低的變形能力的 RBC，特別是選自下述的RBC:-受寄生蟲感染的RBC，優選瘧原蟲屬的原生動物寄生蟲，和特別為環狀-寄生iRBC或 配子體-寄生iRBC，例如成熟配子體-寄生iRBC ；-經加熱的RBC，和-來自患者的RBC，所述患者患有遺傳或後天的免疫機能障礙以及遺傳或後天的RBC疾 病，和優選來自患有下述疾病的患者的RBC 遺傳性或後天的球形紅細胞症、橢圓形紅細胞 增多症、敗血症、血紅蛋白病(α或β地中海貧血、鐮狀細胞疾病和鐮狀細胞性狀)、自免疫 溶血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它紅血球酶)。
24.根據權利要求23的方法，其中所述寄生蟲選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵 形瘧原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似卵形瘧原蟲、巴西瘧 原蟲、許氏瘧原蟲和吼猴瘧原蟲，優選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、諾 氏瘧原蟲和三日瘧原蟲，和更優選選自下組熱帶瘧原蟲和間日瘧原蟲，例如熱帶瘧原蟲的 Palo Alto I 菌株。
25.根據權利要求20至M中任一項的方法，其中步驟d)中分析的RBC或步驟d)中分 析的至少一個RBC子群體是異常RBC或瘧原蟲感染RBC (iRBC)，和特別是環狀-寄生iRBC 或配子體-寄生iRBC，例如成熟配子體-寄生iRBC。
26.根據權利要求25的方法，其中步驟d)包括或由下述組成-確定上遊和下遊等分試樣中寄生蟲感染量的百分比，以及可選地，保留等分試樣中寄 生蟲感染量的百分比；和-可選地，計算(i)過濾單元中的RBC保留率，例如使用下述公式(下遊等分試樣中 RBC或RBC子群體的密度-上遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度)/上遊等分試樣中 RBC或RBC子群體的密度，或(ii)過濾單元中的RBC保留率，使用下述公式下遊等分試樣 中RBC或RBC子群體的密度/上遊等分試樣中RBC或RBC子群體的密度。
27.根據權利要求20至沈中任一項的方法，其中所述RBC是人RBC。
28.根據權利要求20至27中任一項的方法，其中樣本的RBC已經接觸過化合物，特別 是能調節和優選增加RBC剛性的化合物，和例如可以特異性調節和優選增加iRBC剛性的化 合物。
29.根據權利要求20至觀中任一項的方法，其中已從血液樣本獲得RBC，並且優選獲 得自先前從患者獲得的外周血樣本。
30.根據權利要求觀或四的方法，其中RBC先前已經在體外接觸化合物，例如，通過在 存在所述化合物的情況下體外培育RBC。
31.根據權利要求20至30中任一項的方法，其中過濾單元的通道的直徑在1至10μ m 的範圍中，並且優選在1.85至9.4μπι或1至3μπι的範圍中，例如直徑2 μ m。
32.根據權利要求20至31中任一項的方法，其中過濾單元的通道的厚度小於Mym， 和優選小於5 μ m。
33.根據權利要求20至32中任一項的方法，其中由重力、衝洗、吸引或離心驅動通過過 濾單元的流動。
34.根據權利要求20至33中任一項的方法，其中樣品的血細胞比容較低，例如小於.5 %，並且更優選在2 % -2. 5 %的範圍內，所述樣品優選懸浮在懸浮培養基中，所述培養基 包含、由下述組成或主要由下述組成補加4%白蛋白和5%Plasmion 或1 % albumaxII 的 PBS 或 RPMI。
35.根據權利要求20至34中任一項的方法，其中過濾單元包含或由多孔通道膜組成， 例如聚碳酸酯多孔通道膜。
36.根據權利要求35的方法，其中步驟a)由重力驅動並在恆壓下進行，例如80-85cm 水的恆壓，並且優選在約34-37°C的溫度進行。
37.根據權利要求20至35中任一項的方法，其中過濾單元包含或由一層或多層珠組 成，並且優選錫珠，其中過濾單元中存在的珠的直徑在2-25 μ m或5-25 μ m的範圍內，並且 其中在所述過濾單元中由珠間空間形成的通道優選在0. 74和9. 4 μ m之間或1. 85 μ m和 9. 4μπι之間變化。
38.根據權利要求20至35或37中任一項的方法，其中過濾單元中存在的每層珠至少 為0. 5-10 μ m厚，過濾單元中珠總厚度至少為5mm，優選7mm。
39.根據權利要求37或38的方法，其中通過過濾單元的流動是壓力注射流或通過離心 引起的流動。
40.根據權利要求37至39中任一項的方法，其中步驟a)在恆壓下進行，例如80-85cm 水的恆壓，並且優選在約20-25 °C的溫度進行。
41.根據權利要求20至40中任一項的方法，其中步驟d)和特別是密度或寄生蟲感染 量確定通過液相螢光定量方法進行或者在吉氏染色後進行。
42.根據權利要求20至41中任一項的方法在用於篩選化合物調節變形和具體為誘導 或增加紅血球細胞(RBC)剛性的能力，特別是受瘧原蟲屬原生動物寄生蟲感染的RBC剛性 的能力的方法中，例如在根據權利要求1至18中任一項的方法中的應用。
43.根據權利要求42的應用，其中化合物的篩選包括或由下述步驟組成-將根據權利要求20至41中任一項的用於過濾RBC的方法，應用於包含RBC的樣本的 兩個等分試樣，其中只有一個等分試樣先前已接觸過待測試其調節和優選增加RBC剛性能 力的化合物；和-比較兩個樣本等分試樣確定的RBC保留率或保留比例，其中兩個RBC保留率或保留比 例之間至少5%，優選至少10%和更優選至少15%的差異表明所述化合物能調節RBC的剛 性，並且其中與未接觸化合物的樣本等分試樣獲得的RBC保留率(絕對數值)或保留比例 相比，對於已接觸化合物的樣本等分試樣獲得的RBC保留率(絕對數值)或保留比例中至 少5%，優選至少10%和更優選至少15%的增加表明所述化合物能增加RBC的剛性。
44.根據權利要求1至18中任一項的篩選方法，其中RBC或iRBC的變形能力的測量使 用根據權利要求20至41中任一項的過濾RBC的方法進行，優選參照RBC或iRBC保留率或 保留比例。
45.根據權利要求20至41中任一項的過濾RBC的方法的應用，其用於分離和/或檢 測具有異常和特別是降低的變形能力的RBC，特別是用於實驗研究和/或診斷或檢測瘧原 蟲感染RBC是否存在，例如環狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC，或者診斷或預知影響 RBC變形能力的後天或遺傳的疾病，例如後天或遺傳性球形紅細胞症。
46.根據權利要求20至41中任一項的過濾RBC的方法的應用，其用於患者脾功能的體外分析，和特別是具有遺傳或後天的免疫功能障礙以及遺傳或後天的RBC障礙的患者脾功 能的體外分析。
全文摘要
本發明涉及篩選能增加受瘧原蟲屬原生動物具體為熱帶瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的寄生蟲感染的紅血球細胞(RBC)剛性的化合物的方法。本發明還涉及過濾RBC的方法，其能在過濾單元中使具有異常具體為降低的變形能力的RBC保留，以此代替脾過濾功能。所述方法具體為分離和/或檢測瘧原蟲感染RBC或與由來自患者的血液樣本的獲得或遺傳性球形紅細胞性貧血有關的紅細胞，或體外分析患者的脾功能。本發明還涉及所述方法的應用，用於篩選可以選擇性與iRBC相互作用或者選擇性與環狀-iRBC相互作用，並且適合於增加其剛性的化合物，或者涉及所述方法用於過濾RBC，分離和/或檢測具有異常並且特別是降低的變形能力的RBC的應用。這種新過濾方法還易於自動化，並且允許進行粘結RBC的清除或濃縮，在遺傳或後天的RBC異常(包括瘧疾)中具有廣泛的實驗和醫療應用。
文檔編號G01N33/50GK102112874SQ200980129709
公開日2011年6月29日 申請日期2009年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者吉納維夫.米隆, 因諾森特.薩福伊奎諾比西, 奧迪爾.普伊杰倫, 弗朗索瓦.拉科斯特, 彼得.戴維, 瓦倫丁.布勞斯, 皮埃爾.A.巴菲特, 紀堯姆.德普萊恩, 納拉.莫漢達斯, 西爾維.佩羅特 申請人:公共救濟事業局-巴黎醫院, 國家科學研究中心, 巴斯德研究院, 皮埃爾與瑪麗·居裡-巴黎第六大學