識別cd3或4－1bb的抗體或基因介導的腫瘤反應性淋巴細胞活化的製作方法

2023-10-05 11:09:29

專利名稱：識別cd3或4－1bb的抗體或基因介導的腫瘤反應性淋巴細胞活化的製作方法
技術領域：
本發明涉及產生腫瘤反應性T淋巴細胞的方法，腫瘤疫苗及其相關組合物，製備這類疫苗及其相關組合物的方法，以及使用這些疫苗及其相關組合物的方法，例如體內治療應用。
背景技術：
以下的說明書包括了對理解當前這項發明有用的信息。這並不是承認此處提供的任何信息為現有技術，或者與當前描述或要求的發明有關，或者明確引用的或無意間引用的任何出版物或者文件為現有技術。
人體腫瘤會表達多種腫瘤抗原，其中大多數抗原也存在於一些正常的組織中，儘管其表達水平很低(Hellstrom and Hellstrom，AdvCancer Res，12，167-223，1969；Cheever et al.，Immunol Rev，145，33-59，1995；Finn et al.，Immunol Rev，145，61-89，1995；Boon et al.，ImmunolToday，18，267-8，1997；Hellstrom and Hellstrom，Handbook ofExperimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。許多這些抗原在患腫瘤患者體內是具有免疫原性的。例如，SEREX技術可以檢測多種腫瘤相關抗原的IgG抗體(Old and Chen，J.Exp.Med.，187，1163-1167，1998)，通過使用四聚物法能證實T細胞識別腫瘤抗原(Cassian et al.，J.Immunol.，162，1999)，通過在體外產生腫瘤選擇性T細胞克隆同樣可以證實這種識別(Boon，Coulie et al.，Immunol Today，18，267-8，1997)。這便為患者提供了進行多種免疫治療的機會，包括給患者使用在體外擴增的免疫T淋巴細胞(Rosenberg，Biologic Therapy of Cancer(Chapter 19)，487，1995)和治療性的腫瘤疫苗(Nestle et al.，Nat Med，4，328-32，1998；Rosenberget al.，Nat Med，4，321-7，1998；Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Melief and Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Pardoll，Curr Opin Immunol，8，619-21，1996；Hellstrom and Hellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。
小鼠腫瘤為開發更加有效的免疫治療提供了實用的疾病模型。它們會表達腫瘤破壞性免疫應答的反應對象，儘管這需要通過特定的實驗操作來獲得能夠抵抗多數自發腫瘤的有效免疫應答。(Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Ken-and Mule，J.Leuko.Biol.，56，210-214，1994；Cheever，Disis et al.，Immunol Rev，145，33-59，1995；Finn，Jerome et al.，Immunol Rev，145，61-89，1995；Meliefand Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Pardoll，Cun-Opin Immunol，8，619-21，1.996；Boon，Coulie et al.，Immunol Today，18，267-8，1997；Hellstrom and Hellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。
T淋巴細胞(CD8+和CD4+)在腫瘤破壞性的免疫應答產生(通常也在完成)過程中發揮著關鍵的作用，自然殺傷細胞和抗體，巨噬細胞也同樣參與了這個過程(Hellstrom and Hellstrom，Adv CancerRes，12，167-223，1969；Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Meliefand Kast.Immunol Rev，145，167-77，1995；Hellstrom andHellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。由骨髓中的造血幹細胞和血液中的單核細胞分化而來的樹狀突細胞(DC)的抗原遞呈是正常的(Huangct al..Science，264，961-5，1994)，在特定的情況下，這種抗原遞呈也可以由腫瘤細胞自身來完成(Chen et al..Cell，71，1093-102，1992；Schoenberger et al..Cancer Res，58，3094-100，1998)。促進樹狀突細胞(DC)表達腫瘤抗原的操作步驟對獲得有效的腫瘤免疫至關重要，最近的數據表明，這種免疫使得對特定的人類腫瘤進行更有效的治療成為了可能(參見，例如，(Kugler et al..Nature Medicine，6，332-，2000))。有著體外細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性的CD8+T淋巴細胞，與生成淋巴因子的輔助性T細胞的結合，對多數腫瘤的清除都是必要的(Hellstrom and Hellstrom，Handbook of ExperimentalPharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。儘管Th1和Th2應答都是有利的(Rodolfo et al.，T Immunol，163，1923-8，1999)，但是Th1應答在腫瘤的免疫清除方面仍舊扮演著主要的角色(Hu etal.，J Immunol，161，3033-41，1998)。
要誘導免疫應答，就要進行共刺激，特別是通過抗原遞呈細胞(APC)上的CD80和/或CD86，和T淋巴細胞上的CD28之間的相互作用，是這種誘導過程所必需的(Schwartz，Cell，57，1073-81，1989；June et al.，Immunol Today，11.211-6，1990；Linsley and Ledbetter，Annu Rev Immunol，11，191-212，1993)。這導致白介素-2，幹擾素-γ和其他促進免疫應答的淋巴因子持續生成(Thompson et al.，Proc NatiAcad Sci USA，86，1333-7，1989)，用編碼淋巴因子的基因轉染腫瘤細胞可以達到上述相同的目的(Pardoll，Curr Opin Immunol，8，619-21，1996)。沒有通過CD28產生的二級信號，即便T細胞受體(TCR)與抗原相接觸，也不會誘發免疫應答，甚至會導致無反應。多數腫瘤不表達CD80或CD86(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992；Yang et al.，J Immunol，154，2794-800，1995)，在抗原達到腫瘤轉移的淋巴結，並被表達CD80和CD86的樹狀突細胞(DC)識別、加工並遞呈之前，不會誘發有效的免疫應答(Huang，Golumbek et al..Science，264，961-5，1994；Yang et al.，J Immunol，158，851-8，1997)。這便可以解釋為什麼腫瘤在長成團塊之前通常在「在不被察覺的情況下通過」免疫系統的監控。CD80和CD86不僅能與CD28結合，其與被激活的T細胞上的CTLA4之間的親和力更高。後面的這種結合會誘發一種能中止免疫應答的負性信號(Thompson，Lindsten et al.，ProcNati Acad Sci USA，86，1333-7，1989；Walunas et al.，Immunity，1，405-13，1994；Krummel and Allison，J Exp Med，183，2533-40，1996；Leach et al..Science，271，1734-6，1996；Walunas et al.，J Exp Med，183，2541-50，1996；Allison et al.，Novartis Found Symp，215，92-8，1998)，這說明其與CD28的結合是有治療意義的，與CTLA4的結合則沒有。
儘管免疫系統有誘導抗腫瘤免疫性的潛能，但它對消除已經形成的腫瘤還是相對無效的。通過常規腫瘤疫苗，或通過在體外轉化的、具有抗腫瘤活性的免疫T細胞誘導的免疫應答，很難破壞數百萬個腫瘤細胞。已證實這種現象與一些逃避機制有關，這些逃避機制可以保護腫瘤細胞免受免疫系統的攻擊(Hellstrom and Hellstrom，Handbookof Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999；Kiessling et al..Cancer Immunol.Immunother.，48，353-362，1999)。這些機制包括腫瘤抗原決定簇(Maeurer et al.，J Clin Invest，98，1633-41，1996)和/或可將這些抗原遞呈給腫瘤殺傷性T淋巴細胞(CTL)的I類主要組織相容性抗原(MHC)分子(Restifo，1993；Maeurer，1996；Hellstrom，1997；Garrido，1997；Johnsen，1998)的丟失，和通過細胞凋亡實現的腫瘤反應性淋巴細胞的消除(Hahne et al.，Science，274，1363-1366，1996；Shirald et al.，Proc Nati Acad Sci USA，94，6420-5，1997；Bennett et al.，J Immunol，160，5669-75，1998；Kume etal.，Int J Cancer，84.339-43，1999)(Chappell and Restifo，CancerImmunol Immunother，47，65-71，1998)。然而，能夠表達免疫原性腫瘤抗原，且未誘導反應性淋巴細胞發生凋亡的腫瘤，通常會從免疫監控下逃脫。這歸功於各種由腫瘤和/或宿主細胞產生的「阻斷因子」，直接地，或者通過有、或沒有抗原決定簇選擇的抗原遞呈細胞(APC)，間接地作用於T細胞發揮作用。這些阻斷因子包括可溶性的腫瘤抗原和免疫複合物，以及轉化生長因子-β(TGF-β)，前列腺素，一氧化氮(NO)等等(Hellstrom and Hellstrom，Adv Immunol，18，209-77，1974；Kehrl et al..J Exp Med，163，1037-50，1986；Sulitzeanu，AdvCancer Res，60，247-267，1993；Kiessling et al..Springer Semin.Immunopathol.，18，227-242，1996；Kiessling，Wasserman et al..CancerImmunol.Immunother.，48，353-362，1999)。在從發生能破壞腫瘤的Th1反應(Hu.Urba et al.，J Immunol，161，3033-41，1998)向發生Th2反應(Fiorentino et al.，J Exp Med，170，2081-95，1989)轉變的過程中，由腫瘤細胞釋放的抗原單獨或與抗體形成免疫複合物所導致免疫應答的下調，並可能會伴隨產生TGF-β，繼而產生例如IL-10這樣的Th2淋巴因子(Wilbanks et al.，Eur J Immunol，22，165-73，1992；D′Orazioand Niederkom，J Immunol，160，2089-98，1998)。被激活的T淋巴細胞上的CTLA4與APC上的CD80/CD86或被激活的T細胞之間的相互作用也會導致這種下調(Leach，Krummel et al.，Science.271，1734-6，1996；Allison，Chambers et al.，Novartis Found Symp，215，92-8，1998)，TGF-β也可以介導這種下調(Chen et al.，J Exp Med，188，1849-57，1998)。已證實巨噬細胞在下調過程中所扮演的角色是生成一氧化氮(NO)和前列腺素(Kiessling，Wasserman et al..CancerImmunol.Immunother.，48，353-362，1999)。
許多報告中指出，在腫瘤浸潤的T淋巴細胞中，T細胞信號傳導機制通常會發生缺陷，這反應了T細胞反應性被抑制(Mizoguchi etal.，Science，258，1795-8，1992；Nakagomi et al..Cancer Res，53，5610-5612，1993；Kiessling，Wasserman et al..Cancer Immunol.Immunothcr.，48，353-362，1999)，把淋巴細胞從體內取出後這種抑制可以恢復。
這裡列舉了一些很大的腫瘤被免疫系統排斥時情況的圖解，例如，關於使用T細胞活化分子4-1BB治療小鼠腫瘤的報告(Melero etal.，Nat Med，3，682-5，1997；Melero et al.，Eur J Immunol，28，1116-21，1998)。但是，更驚人的實例可能來自對腎移植早期的觀測，在一些接受腎移植患者體內，由取自屍體腎臟的腫瘤細胞發展而來的大轉移灶在去除免疫抑制之後完全痊癒了(Wilson et al.，N Engi J Med，278，479-83，1968；Matter et al.Transplantation，9，71-4，1970)。
細胞表面分子4-1BB，在活化的、而不是在天然的T細胞上表達(DeBenedette et al.，J Exp Med，181，985-92，1995；Shuford et al.，J ExpMed，186，47-55，1997)。4-1BB的參予可以放大已經被誘導的免疫應答。有報導說4-1BB與抗4-1BB的單克隆抗體相接觸後可以刺激被抗原激活的、有腫瘤特異性殺傷活性的CD8+T淋巴細胞增殖，刺激幹擾素-γ(IFN-γ)和其他Th1型的細胞因子(白介素-2(IL-2)，腫瘤壞死因子(TNF-α))的生成/釋放，並刺激對抗細胞凋亡的T細胞的保護(Hurtadoet al.，J Immunol，158，2600-9，1997；Kirn et al.，Eur JImmunol，28，881-90，1998；Natoli et al.，Biochem Pharmacol，56，915-20，1998；Takahashi et al.，J Immunol，162，5037-40，1999；Tsushima et al.，Exp Hematol，27，433-40，1999)。另外，4-1BB有免疫調節效應，包括對NK 1.1細胞的調節(Melero et al..Cell Immunol，190，67-72，1998)。
也有報導指出，4-1BB的單克隆抗體有對抗小鼠體內，包括低免疫原性的腫瘤在內的已經長成的腫瘤(直徑大約10毫米)的活性，用抗4-1BB單克隆抗體治療的小鼠的淋巴細胞已經生成了溶細胞活性增高的CD8+腫瘤特異性殺傷T細胞(Melero，Shuford et al.，NatMed，3，682-5，1997)。淋巴細胞與被轉染整合4-1BB配體(4-1BBL)的腫瘤細胞相接觸，該配體與4-1BB相結合，也可以顯著放大CD8+T淋巴細胞的應答，將4-1BBL轉染的腫瘤細胞當作疫苗用於小鼠模型時是有治療活性的。然而，用抗4-1BB的單克隆抗體進行治療的療效明顯優於用表達4-1BBL的腫瘤細胞做疫苗治療的效果。抗體治療對於治療非免疫原性的肉瘤Ag104是非常有效的(Melero，Shuford etal.，Nat Med，3，682-5，1997)，將Ag104細胞轉染並表達4-1BBL，再與表達CD80的細胞結合，便可獲得對抗這種腫瘤的療效(Melero，1998)。
有一種可選擇的增加腫瘤免疫性的方法，就是給患者使用一次抗-CD3單克隆抗體，這樣可以使多克隆T細胞活化，包括激活任何腫瘤反應性T淋巴細胞，已報導在一些用小鼠模型進行的研究中，有一些採用這種方法治療的成功經驗(Ellenhom et al.，Science，242，569-71，1988)。
腫瘤反應性T淋巴細胞可以在體外生成後用於體內，通過淋巴細胞實現的腫瘤免疫性的轉移，預防來自各個腫瘤新生物的移植細胞過度生長(Klein et al.，Cancer Res，20，1561-1572，1960)。以前曾有有關在免疫淋巴細胞過繼轉移之後排斥小的、已形成腫瘤的報導(Hellstrom et al.，Transplant Proc，1，90-4，1969)。過繼轉移的淋巴細胞會優先定位在腫瘤周圍(Mule*et al.，J.Immunol.，123，600-606，1979)，將已被賦予免疫性的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)用於治療這項發明已擴大了其體外應用範圍(Rosenberg，Biologic Therapy ofCancer(Chapter 19)，487，1995)。儘管已經在少數患者身上看到了激動人心的臨床反應，但在治療小鼠體內的直徑超過幾毫米的腫瘤，以及對人進行治療時，成功的程度通常不夠理想(Greenberg，AdvImmunol，49，281-355，1991；Chen，Ashe et al..Cell.71，1093-102，1992；Meliefand Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Hellstrom andHellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。這種失敗是由於先前討論的「逃逸」機制和/或浸入腫瘤實體的淋巴細胞錯誤定位導致的。
因此需要對包括構建能夠誘導更強免疫應答的腫瘤疫苗和生成用於治療腫瘤患者的T淋巴細胞在內的方法進行。
發明概要本發明涉及體外生產腫瘤反應性T淋巴細胞的方法，在體內治療性應用的腫瘤疫苗以及相關的組合物。
一種方法是將取自外周血或腫瘤的單核淋巴細胞，例如取自腫瘤患者的單核淋巴細胞，在特異性CD3和CD28固相化抗體存在下與自體腫瘤細胞共同培養。經過一個4-5天的周期便可完成這樣的培養。可將細胞擴增至能夠用於治療的水平，例如在去除附著有固相化抗體的磁珠之後在10μl/ml的白介素-2中。這些方法對促進用於治療腫瘤的腫瘤反應性淋巴細胞的生產是很有用的。在沒有被任何特別的理論或機制束縛的情況下，可以將該發明的操作理解為下述過程表達低水平CD3的T淋巴細胞被多克隆激活，增生旺盛，產生Th1型淋巴因子，並迅速破壞腫瘤細胞，釋放腫瘤抗原。還可以認為，多克隆T淋巴細胞的激活使培養基中的單核細胞成熟為樹突狀細胞，它會吞噬死亡的腫瘤細胞，加工並提呈腫瘤抗原，誘導腫瘤特異性T細胞，包括CTL的持續擴增。
本發明還提供，例如，編碼在腫瘤細胞表面表達的抗CD3或抗4-1BB單鏈Fv(scFv)分子的基因以及用這些基因轉染的細胞，用於體內癌症的治療。在沒有被任何特別的理論或機制束縛的情況下，可以認為在腫瘤細胞表面表達的抗-CD3 scFv誘導多克隆T淋巴細胞激活，並破壞了腫瘤細胞，釋放腫瘤抗原，促進抗原特異性的腫瘤免疫的轉換，即我們可檢測到相同腫瘤對「野生型」(非轉染)細胞的排斥。也可以認為在腫瘤細胞表面的表達的抗4-1BB scFv分子通過不斷使腫瘤反應性T淋巴細胞擴增和/或通過保護它們不發生凋亡，從而生成腫瘤反應性淋巴因子，例如幹擾素-γ，誘導腫瘤反應性T淋巴細胞的激活/擴增。在用被轉染的、能夠在細胞表面表達抗4-1BB scFv分子的腫瘤細胞免疫之後，在沒有任何特別的理論或機制束縛下，可以認為來自同一腫瘤的野生型細胞可以通過包括自然殺傷細胞和CD4+細胞激活在內的機制被排斥。在細胞表面表達抗4-1BB scFv分子的腫瘤細胞在治療已經長成的野生型腫瘤時是有活性的。
本發明使兩種新的治療腫瘤的方法成為可能。首先，其可以通過例如附著有抗-CD3/抗-CD28/抗-CD40(或抗-CD3/CD28)固相化抗體的磁珠，使「被抑制的」淋巴細胞激活，並使它們增生，生成Th1淋巴因子，同時變得對TGF-β抑制更不敏感。在沒有任何特別的理論或機制束縛下，可以認為活化的淋巴細胞會破壞腫瘤細胞，從而提供腫瘤抗原，並誘導抗原遞呈細胞的成熟。可以認為這種方法會使腫瘤反應性CD8+和CD4+T淋巴細胞和自然殺傷細胞在一定時間內擴增，這便更好地適應了將它們過繼轉移給腫瘤患者的需要。其次，這種方法可以提供基因或多核苷酸，其編碼例如，腫瘤表面的抗-CD3或抗4-1BBscFv，這些分子能有效誘導對抗來自同一腫瘤的野生型細胞的腫瘤破壞性免疫應答。
這項發明的其他方面在下列權利要求中進行了闡述，此處完整引用作為參考。
附圖簡述儘管這項發明的應用範圍廣泛，並不局限於這裡所描述或提到的實施例，參照附圖可以對發明的一些方面有更多的了解。


圖1.取自晚期卵巢癌(OV44)患者的腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的體外增殖。A顯示了用對照磁珠加自體腫瘤細胞刺激淋巴細胞的擴增。B顯示了用抗-CD3/CD28/CD40偶聯磁珠加自體腫瘤細胞共同刺激後淋巴細胞的擴增。C顯示了用不加腫瘤細胞的抗-CD3/CD28/CD40磁珠刺激後淋巴細胞的擴增。
圖2.自體的，而非同種異體的腫瘤細胞和由CD3與CD28組合刺激的磁珠結合誘導取自結腸癌患者的外周血單核細胞增殖。這張圖顯示了在存在有自體(1C)或同種異體(4007)的卵巢癌細胞的情況下，體外刺激五天後，取自腫瘤患者外周血淋巴細胞的擴增。所用的刺激物為A＝對照磁珠；B＝抗-CD28/CD40偶聯磁珠；C＝抗-CD3/CD28偶聯磁珠；D＝抗-CD3/CD28/CD40偶聯磁珠；E＝抗-CD3/CD40偶聯磁珠。
圖3.取自患有結腸癌患者的外周血單核細胞在磁珠存在的情況下，在4小時51Cr釋放分析中顯示其可裂解自體的腫瘤細胞，所述磁珠刺激CD3與CD28，或CD3與CD28和CD40的組合，。這張圖顯示了取自患者1C的外周血淋巴細胞表現出的細胞介導的細胞毒性，在外周血淋巴細胞被自體的腫瘤細胞加抗-CD3/CD28磁珠(A)或被自體的腫瘤細胞加抗-CD3/CD28/CD40磁珠(B)激活之後，在被標記的靶細胞上進行檢測。
圖4.取自患有頭頸部腫瘤患者的外周血單核細胞，在與自體腫瘤細胞和能刺激CD3與CD28的磁珠共同培養後會產生幹擾素-γ。這張圖顯示了取自晚期頭頸部腫瘤患者的外周血淋巴細胞生成幹擾素-γ。培養上清液中幹擾素-γ的水平是如所示通過單獨使用抗-CD3/CD28(A)，抗-CD3/CD28磁珠加自體腫瘤細胞(B)，或對照磁珠加自體腫瘤細胞(C)刺激後，在不同時間測定得出的。
圖5.CD83是在用磁珠刺激的CD3與CD28刺激之後，在取自結腸癌患者的外周血單核細胞上表達的。這張圖顯示了取自晚期腫瘤(38C)患者外周血單核細胞上CD83的表達。將細胞用抗-CD83抗體在刺激之前(0天)直接與藻紅蛋白(PE)偶聯，或在刺激之後1天用抗-CD3/CD28磁珠偶聯。
圖6.通過CD3與CD28共同刺激取自結腸癌患者的外周血單核細胞兩天後所表達的CD83水平，比用CD3與CD28再加CD40共同刺激後CD83的表達水平高。這張圖顯示了取自晚期腫瘤(38C)患者的外周血單核細胞，這些細胞沒有被激活，或用抗-CD3/CD28/CD40磁珠刺激兩天，或如所示用抗-CD3/CD28磁珠刺激兩天。將細胞同時用與抗-CD3偶聯的螢光染料和與抗-CD83偶聯的藻紅蛋白染色。
圖7.經轉染能夠在細胞表面表達抗-CD3scFv(500A2)的K1735黑色素瘤細胞與表達小鼠CD80的K1735細胞及野生型K1735細胞相比有所消退。
圖8.移植到同源小鼠的K-1735野生型細胞的消退，所述小鼠反覆免疫以抵抗K1735-500A2細胞。用K1735M2/500A2(2×106/只小鼠)細胞對C3H/HeN小鼠進行三次免疫，每次免疫間隔七天，再給小鼠以1×106/只小鼠(藍線)的濃度接種K1735M2/500A2野生型細胞。用PBS對C3H/HeN小鼠進行免疫，然後用相同劑量的K1735M2給小鼠接種(紅線)。
圖9.抗-人CD3scFv基因序列，即抗-人CD3scFv-hIgGl-CD80TM合成多核苷酸的序列，能編碼一種在細胞表面表達的產物，能夠用於轉染。
圖10.在逆轉錄病毒基因轉導之後，抗-人CD3 scFv在兩種人體細胞系的細胞表面表達。抗-人CD3 scFv(G19-4)在Reh和T51細胞系的細胞表面通過逆轉錄病毒基因轉導得到表達。在細胞表面表達的G19-4 scFv基因產物可以用相應的螢光抗-人IgG進行檢測，後者可檢測基因產物IgG中的CH2和CH3結構域。在每一個圖面中，與野生型細胞發生的反應用虛線表示，與轉染細胞發生的反應用實線表示。
圖11.與在細胞表面表達抗-CD3 scFv的人細胞系共同培養的人T淋巴細胞的擴增。這張圖顯示了與在表面表達抗CD3 scFv的Reh或T51細胞(而非野生型Reh或T51細胞)培養後所誘導的T細胞增殖。在一個持續三天的培養周期的最後八小時向培養的細胞中加入3H-胸腺嘧啶可以對擴增進行測定。
圖12.靜止的人外周血單核細胞裂解來自兩個在細胞表面表達抗CD3 scFv人細胞系的細胞。這張圖顯示了靜止的外周血單核細胞可快速殺死在腫瘤細胞表面表達抗-人CD3 scFv的Reh和T51細胞，但不會殺死野生型的Reh或T51細胞。51Cr-標記的細胞系與外周血單核細胞按照所示比率孵育8小時(一式三份)，然後測定被釋放的51Cr。可用經典的公式計算特異性殺傷的百分比(實驗釋放量減去自發釋放量，再除以最大釋放量減去自發釋放量)。
圖13.當K1735M2/500A2細胞與野生型K-1735細胞的比例為1∶10時，在細胞表面表達抗-人CD3 scFv的K1735-500A2細胞會抑制與之混合在一起的野生型K-1735細胞形成腫瘤，這證實了「旁觀者效應」。這張圖顯示了在有免疫活性的自體(C3H)小鼠體內，K1735M2/500A2細胞與野生型K-1735細胞的混合物(比例為1∶10)的生長暈被抑制。單獨免疫野生型K1735細胞，或將野生型K-1735細胞與轉染的K1735M2/500A2細胞以10∶1的比例相混合使未轉染的細胞被轉染。將2×106個野生型K1735細胞與2×106個K1735M2/500A2細胞相混合，再將混合後的細胞用於皮下免疫C3H小鼠。每隔5天對腫瘤的生長情況進行檢測。
圖14.取自用K1735-500A2細胞免疫的小鼠的脾細胞在與經照射的野生型K1735細胞結合後會擴增，但在與Ag104細胞結合時則不會。
圖15.被移植入自體小鼠體內的K1735-1D8細胞會被排斥，這是因為CD4+細胞和自然殺傷細胞共同產生的排斥機制所致。這張圖顯示了被移植入C3H小鼠的K1735-1D8細胞被CD4+細胞和自然殺傷細胞所產生的作用機制排斥。a)含有抗-小鼠4-1BB雜交瘤1D8 scFvDNA的病毒載體結構；b)用與藻紅蛋白偶聯的F(ab′)2山羊抗人的免疫球蛋白可檢測出1D8 scFv的表達，這種免疫球蛋白可以識別在K1735-1D8細胞上(陰影區域)表達的免疫球蛋白尾部，但不能識別野生型K1735細胞上的免疫球蛋白(實線)；c)K1735-1D8(○)細胞和野生型K1735細胞(■)細胞在天然小鼠體內的成長動力學；d)小鼠體內的K1735-1D8細胞被CD4+(■)，CD8+(□)，CD4+和CD8+(○)或自然殺傷細胞(△)耗盡的生長動力學，在這個實驗中，給對照組(●)的小鼠注射的是純化後的小鼠IgG。
圖16.用K1735-1D8細胞，而不用經放射線照射的野生型K1735細胞進行免疫，可以對抗被移植的野生型K1735細胞的生長，相信這是由於免疫的記憶和特異性的機製造成的。a)通過用K1735-1D8(○)或經放射線照射的野生型K1735細胞(□)進行皮下移植的方法，或用磷酸鹽緩衝液(PBS)(■)每隔十天對小鼠(10隻/組)皮下免疫兩次。在最後一次免疫十天之後給這些小鼠注射野生型K1735細胞，並在兩個月之後給具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠再次用野生型細胞進行第二次免疫(▲)；b)將Ag104細胞以3×105/只小鼠的濃度移植給已經具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠(■)，並注射兩次野生型K1735細胞，給對照組小鼠注射磷酸鹽緩衝液(PBS)(○)；c)給已經具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠注射野生型K1735細胞後，其背部皮膚會脫色。
圖17.可以將K1735-1D8細胞作為疫苗進行皮下移植，對已經在皮下或肺裡生長形成的野生型K1735腫瘤進行治療。這張圖顯示了用K1735-1D8作為免疫源對已經形成的野生型K1735腫瘤進行治療。a)用皮下注射法，給野生型K1735腫瘤面積達到30平方毫米的小鼠，在移植的前六天，在腫瘤的對側面接種K1735-1D8(○)或經放射線照射的野生型K1735細胞進行免疫(□)；皮下注射磷酸鹽緩衝液(PBS)(■)的小鼠被視為對照組小鼠。在給定的(↓)時間點也要做相同的治療；b)在給未經治療的小鼠移植野生型K1735細胞20天之後(左圖)，或在接受野生型K1735細胞之後第8天時首次接受K1735-1D8免疫時(中圖)，在接受野生型K1735細胞之後第8天時首次注射1D8單克隆抗體時(右圖)要對收集到的腫瘤進行免疫組化分析。每張照片的上、下兩個區域分別代表了同一腫瘤結節中的CD4+和CD8+細胞；c)接受靜脈注射野生型K1735細胞小鼠的腫瘤肺轉移灶。上圖顯示了對照組小鼠的肺臟，下圖顯示了反覆移植K1735-1D8細胞進行免疫的小鼠的肺臟。
圖18.來自經K1735-1D8免疫小鼠的脾細胞在與野生型K1735細胞結合時會擴增，但與抗原性不同的Ag104細胞結合時則不會擴增。這張圖顯示了經K1735-1D8免疫小鼠脾細胞的擴增。a)用取自兩次分別用K1735-1D8或經放射線照射的野生型K1735細胞免疫小鼠的脾細胞，與經放射線照射的野生型K1735(「K1735」)或Ag104(「Ag104」)共同培養三天；將取自天然小鼠的脾細胞作為對照。對氚標記脾細胞的擴增進行測定；b)對已經用CFDA SE標記的CD4+和CD8+的脾細胞進行流式細胞計數分析。
圖19.取自用K1735-1D8免疫小鼠的脾細胞能分泌幹擾素-γ，並具有細胞毒性淋巴細胞的活性。這張圖顯示了幹擾素-γ的分泌和細胞毒性活性。a)在用K1735-1D8細胞兩次免疫天然小鼠後第10天，直接對取自天然小鼠的脾細胞進行幹擾素-γ的ELISPOT分析。將最後一次免疫後10天時收集到的脾細胞加入到幹擾素-γELISPOT培養皿中，孵育24小時；將來自天然小鼠的脾細胞和來自攜帶有野生型K1735腫瘤小鼠脾細胞的檢測結果進行比較；b)在用野生型K1735細胞進行免疫之後的30天時，將在實驗中在體外受到刺激的(■)和未受刺激的(□)脾細胞分泌幹擾素-γ的情況歸納於表1中。下列每組(三隻用同樣方法處理的)小鼠平均的斑點數目(從上至下)都顯示出來用K1735-1D8細胞處理1天前，或用野生型細胞處理4或8天後；用1D8的單克隆抗體處理1天前，或用野生型細胞處理4或8天後。下面兩行給出了取自天然小鼠的對照組脾細胞的ELISPOT數據；c)取自用K1735-1D8細胞免疫小鼠的脾細胞和經放射線照射的野生型K1735細胞共同培養5天，並檢測裂解的野生型K1735細胞(■)，Ag104(□)和YAC-1(○)細胞的4小時51Cr釋放試驗，d)要做一個與圖5c相似的實驗，以除外已經與抗asialo GM1抗體和兔補體共同孵育過的脾細胞，這樣可在與經放射線照射的野生型K1735細胞共同培養和檢測之前去除自然殺傷細胞。它們的能抵抗野生型K1735細胞(■)的細胞裂解活性被I類抗主要組織相容性抗原的單克隆抗體(▲)所抑制。在YAC-1(○)細胞沒有被裂解的時候，可以檢測到抗Ag104(□)較低的溶細胞活性。
圖20.在細胞表面表達抗-4-1BB scFv的K1735-1D8細胞，可以在1D8和野生型細胞的比例為1∶10時抑制混合有野生型K1735細胞的混合物形成腫瘤，這被證實是一種「旁觀者效應」。這張圖顯示了在具有免疫活性的自體(C3H)小鼠體內，K1735-1D8細胞與野生型K1735細胞混合物(比例為1∶10)的生長被抑制。用野生型K1735細胞單獨進行免疫，或將野生型K1735細胞與用K1735-1D8轉染的細胞以未轉染腫瘤細胞與轉染腫瘤細胞的比例，即10∶1的比例混合免疫。將2×106個野生型K1735細胞與2×105個K1735-1D8細胞相混合，用來皮下免疫C3H小鼠。每隔5天對腫瘤的生長進行監測。
圖21.5B9抗人4-1BB scFv序列。這張圖顯示了預測的細胞表面表達5B9Ig的核苷酸和胺基酸序列。
圖22.表1.
圖23.表2.
圖24.表3.
圖25.表4.
發明詳述除非特別說明，此項發明可能採用了分子生物學(包括重組技術)，微生物學，細胞生物學，生物化學，核酸化學和免疫學的多種技術，這些均是包含在所屬技術領域中的技術。各種有用的技術在文獻中均有解釋，例如，分子克隆實驗室手冊，第二版(Sambrook etal.，1989)和分子克隆實驗室手冊，第三版(Sambrook and Russel，2001)，(在此共同和分別參考作為″Sambrook″)；寡核苷酸合成(M.J.Gait，ed.，1984)；動物細胞培養(R.I.Freshney，ed.，1987)；實驗免疫學手冊(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.)；哺乳類動物細胞基因轉移載體(J.M.Miller M.P.Calos，eds.，1987)；分子生物學最新操作手冊(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括2001年全年增刊)；PCR聚合酶鏈反應(Mullis et al.，eds.，1994)；免疫學最新操作手冊(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；免疫測定手冊(D.Wild，ed.，Stockton Press NY，1994)；生物結合技術(Greg T.Hermanson，ed..Academic Press，1996)；免疫分析方法(R.Masseyeff，W.H.Albert，和N.A.Staines，eds.，WeinheimVCH Verlags gesellschaftmbH，1993)；Harlow and Lane(1988)抗體，實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約，and Harlow and Lane(1999)應用抗體實驗室手冊，紐約冷泉港出版社，(在此共同和分別參考文獻作者為Harlow和Lane)，Beaucage et al.eds，核酸化學最新操作手冊，John Wiley Sons，Inc.，New York，2000)；and Agrawal，ed.，寡核苷酸及其類似物合成操作手冊和特性Humana Press Inc.，美國新澤西州，1993)。
本發明涉及能夠從抗腫瘤或抗癌劑獲益的疾病、失常和病症的治療、預防和/或緩解，還涉及其中所用的製劑。
本發明提供了，例如，用於產生抗腫瘤免疫的多種方法和組合物。
一方面，這項發明提供了一種新方法，可在體外獲得腫瘤反應性T淋巴細胞群，這種細胞群通過用固相化CD3與單獨CD28或者與CD28加CD40共同組合來刺激共培養的PBMC和腫瘤細胞PBMC，後者來自癌症患者，包括晚期癌症患者(總體免疫抑制)。在另一方面，例如，這項發明提供組合物，其包括編碼在細胞表面表達的抗CD3 scFv或抗4-1BB scFv的基因或其他多核苷酸。另一方面，這項發明提供了能夠表達這些基因並用於誘導抗腫瘤免疫的轉染細胞。
用固相化在磁珠上的抗CD3和CD28抗體刺激與活化T細胞，均可導致多克隆T細胞的生長和多種細胞因子的產生(Levine et al.，JImmunol，159，5921-30，1997；Garlie et al.，J Immunother，22，336-45，1999)。而從多克隆繁殖到經過抗CD3和CD28抗體刺激後的抗原特異性T細胞的產生和/或增殖的轉換在先前沒有描述。
如此處所述，例如，通過在培養物，尤其是在最初的培養物中加入自體腫瘤細胞可以完成這種轉換。試驗顯示腫瘤細胞在48-72小時之內被活化的T細胞破壞，並且培養物中的單核細胞在同一時期發育成熟為CD83+的樹突狀細胞。這被認為是其暴露在淋巴因子中的結果，這類因子包括由活化的T細胞分泌的幹擾素-γ和腫瘤壞死因子-α。樹突狀細胞吞噬被消滅的腫瘤細胞，並且遞呈腫瘤抗原給活化的T細胞，促進腫瘤特異性T細胞不斷的增殖和生長。
另一方面，本發明提供編碼抗CD3 scFv的基因或其他多核苷酸，這種抗體片段可能對CD3是特異性的。這種基因或者多核苷酸可以被轉染，用於在諸如人或小鼠腫瘤細胞系的表面進行表達。在這兩種情況下，這種轉染的細胞可以活化T淋巴細胞，使其增殖，產生淋巴細胞因子並殺傷腫瘤細胞。
另外進行的體內試驗顯示，在細胞表面表達抗小鼠CD3的小鼠腫瘤細胞會被具有免疫活性的小鼠排斥，並且誘導出現對同一腫瘤野生型細胞的系統免疫力。因此，儘管由抗小鼠或抗人CD3基因編碼的scFv在腫瘤細胞表面表達時可以誘導T細胞活化，本發明證實當將上述基因產物作為一種腫瘤疫苗在體內應用，且體內出現腫瘤細胞時，這種疫苗會誘導體內免疫向抗原特異性免疫轉變。
另一方面，本發明中構建的基因或者其他的多核苷酸可以編碼例如抗4-1BB scFv，對4-1BB具有特異性，例如可以將它們轉染至人和小鼠的腫瘤細胞中，並在這些細胞表面表達。這種被轉染的腫瘤細胞可以活化來自各自種屬的T淋巴細胞。用抗小鼠4-1BB scFv基因轉染的小鼠腫瘤細胞會被具有免疫活性的小鼠排斥，這種基因可作為一種疫苗誘導腫瘤特異性免疫，排斥來自相同腫瘤的野生型細胞。這種免疫反應顯示出了記憶性和抗原特異性，對被研究的生長在皮下或肺轉移的腫瘤細胞(K1735黑色素瘤)具有治療效果。由於K1735表達的I類主要組織相容性抗原分子水平非常低，並缺乏II類主要組織相容性抗原分子，且大多數的人類腫瘤細胞情況也很類似，具有非常低的免疫原性，所以這些結果具有重要的生物學意義。
我們已經製造出了與小鼠和人的CD3和4-1BB可以發生反應的編碼scFv分子的基因。每個基因均包括跨膜結構域和人CD80的細胞質尾。另外，每個基因均編碼鉸鏈區和人IgG1的CH2和CH3結構域，位於scFv結合位點和跨膜結構域之間。這些基因和這些基因轉染的細胞對於治療腫瘤都是有用的。
例如，正如下面的實驗中指出的那樣，編碼在細胞表面表達的抗CD3或者抗4-1BB scFv分子的cDNA可以作為一種DNA質粒轉導給腫瘤患者，或者可以在諸如病毒或者細菌載體中進行轉導。在體外，編碼在細胞表面表達的抗CD3或者抗4-1BB scFv分子的cDNA可以被導入腫瘤細胞，轉染後的腫瘤細胞可以用於治療。可以使用自體的或同種異體的腫瘤細胞。細胞表面表達的scFv基因編碼分子的結合源於其編碼基因的結合，所表達的scFv分子與T細胞表面的受體結合，提供活化或共刺激信號。本發明中還設想了另外一種在體內傳導多克隆活化信號給T細胞的方法，包括給患者注射包含由T細胞表達的表面受體的抗體或配體的緩釋聚合體。
本發明還提供了一種新的方法，在體外生成/擴增腫瘤選擇性T淋巴細胞，通過活化出現自體腫瘤細胞中的這些細胞和CD3和共刺激分子介導的信號，用於例如繼受性轉移給腫瘤患者。本發明有利於在體外產生能夠遞呈腫瘤細胞釋放抗原的樹突狀細胞，以擴大已經存在的腫瘤反應性T細胞群，並有利於產生先前未被認識的針對抗原的免疫反應。在體外生成的T細胞，如發明中描述的那樣，對TGF-β的抑制作用更不敏感，並有較長的生命周期。
本發明還描述了兩種通過轉染編碼抗體衍生分子的scFv基因產生的新型人類腫瘤疫苗，它們可以識別CD3或4-1BB，在檢驗它們抵抗免疫原性較低、且僅少量表達I類主要組織相容性抗原分子而不表達II類主要組織相容性抗原分子的小鼠黑色素瘤時，顯示這些疫苗可以誘導產生腫瘤破壞性免疫反應。本發明中描述的這種方法可用於轉染人類腫瘤細胞，表達抗人CD3或抗人4-1BB scFv用於基於細胞的免疫。另外，其可以較容易地被用於構建基於基因的腫瘤疫苗，其中基因編碼的腫瘤表位可以與基因編碼的抗CD3 scFv或/和抗4-1BBscFv相結合。通過結合可以識別其他的或不同的免疫刺激物受體的scFv和/或編碼上調抗腫瘤免疫反應的淋巴細胞因子的基因可以使本發明的應用範圍擴大。
本發明將參照特定的實驗被進一步討論，這些實驗可能僅採用實施例的方式，不以任何方式對本發明進行限制。
實施例1來自晚期癌症患者的CD3介導的腫瘤反應性淋巴細胞的活化外周血單核細胞(PBMC)或腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，在偶聯了與CD28單克隆抗體或者CD28和CD40單克隆抗體結合的CD3單克隆抗體的磁珠存在的情況下，與自體腫瘤細胞共同培養。對培養中發生的一些情況進行表徵，包括培養的腫瘤細胞被破壞，淋巴細胞增殖和淋巴細胞因子的產生，CD83+抗原遞呈細胞的產生和腫瘤反應性細胞毒性淋巴細胞的活化/擴增，以及淋巴細胞對TGF-β抑制作用的敏感性下降。
取自患者的材料。腫瘤取自IV期癌症患者的手術或者惡性滲出物(多數為腹水)。腫瘤和外周血樣品均在知情同意下獲得。大多數的研究採用8名患者，其中5名(1OV，3OV，8OV，44OV，48OV)患卵巢癌，2名(1C，22C)患結腸癌，一名(1HN)患有頭頸部腫瘤。實驗還使用了來自卵巢癌細胞系4007的細胞。
腫瘤和血液樣品的準備。將實體腫瘤懸於培養基中，去除滲出物中的液體部分，然後將細胞垂懸。用Ficoll-Hypaque(PharmaciaBiotech，Upsala，Sweden)去除紅細胞，利用Percoll梯度(Sigma，St Louis，MO)從腫瘤浸潤淋巴細胞中分離腫瘤細胞。淋巴細胞樣本可以直接使用或儲存在液氮中以備日後使用。使用標準的操作步驟將腫瘤樣本移植到體外並建立細胞系。外周血單核細胞包括T淋巴細胞，單核細胞和B細胞，用Ficoll-Hypaque對它們進行純化。在很多最初的實驗中，使用了CD8+T淋巴細胞(純度＞90％)，這些細胞是應用VarioMac磁珠(Miltenyi Biotech公司，Auburn，CA)從腫瘤浸潤淋巴細胞中篩選出來的。
結合淋巴細胞、抗體偶聯的磁珠和腫瘤細胞的培養物的製備。在最初的實驗中，每個腫瘤細胞中加入了5個淋巴細胞，然後混合物在裝有RPMI培養基和10％胎牛血清(Atlanta Biological，Norcross，GA)的Costar(3513)的12-孔培養板(Coming Inc.，Coming，NY)中，在37℃的環境中孵育。隨後，使用一種公開的技術(Levine，Bernstein et al.，J Immunol，159，5921-30，1997；Gariie，LeFever et al.，J Immunother，22，336-45，1999)，將外周血單核細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞與或不與被偶聯在磁珠(Dynal Inc.，Lake Success，NY)上的自體腫瘤細胞共同培養，磁珠上偶聯有CD3，CD28，和/或CD40的單克隆抗體；將沒有偶聯單克隆抗體(或偶聯有不相關的單克隆抗體)的磁珠作為對照。偶聯的單克隆抗體分別是64.1(Martin et al.，JImmunol，136，3282-7，1986)(Martin，Ledbetter et al.，J Immunol，136，3282-7，1986)、9.3(Martin，Ledbetter et al.，J Immimol，136，3282-7，1986)和G28-5(Ledbetter et al.，J Immunol，138，788-94，1987)，它們分別多克隆地刺激淋巴細胞(抗CD3)，共刺激(抗CD28)，或者活化抗原遞呈細胞(抗CD40)。當使用自體腫瘤細胞時，細胞(40,000-75,000/孔)首先需要通過過夜孵育吸附到Costar 24孔培養板上，培養板中加有含有10％胎牛血清的2ml IMDM培養基。然後加入單克隆抗體偶聯磁珠(3×106/ml)，再加入懸浮在含10％胎牛血清RPMI中的淋巴細胞(106/ml)。培養板在37℃含有6％CO2的空氣中孵育4-5天。使用磁鐵除去磁珠，將淋巴細胞置於一個新的含有10U/ml的白介素-2(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的培養板中，然後當濃度達到2×106個細胞/ml後將培養基移至細頸瓶中。觀察培養基尋找腫瘤細胞被破壞的證據。通過細胞計數確定淋巴細胞的擴增情況。從培養基中取樣，分別用WEHI細胞(Espevik and Nissen-Meyer，J Immunol Methods，95，99-105，1986)應用一種生物分析法測量產生的腫瘤壞死因子，用ELISA(EH-EFNG，Endogen，Wobum，MA)法測量幹擾素-γ。TGF-β1購自Sigma公司(St Louis，MO)。所有試驗中都會使用TGF-β1，即便是在去除了單克隆抗體偶聯的磁珠之後，這些分子仍然留在培養基中。
細胞毒性淋巴細胞的檢測。使用經典的4-小時51Cr釋放法進行檢測。為了給效應細胞定性，在實驗時向細胞中加入可以識別I類主要組織相容性抗原分子的框架決定簇(Research Diagnostics Inc.，Flanders，NJ)的單克隆抗體w6/32(10ug/ml)抑制細胞毒性。也可使用自然殺傷細胞標誌抗原CD16和CD56的單克隆抗體(BeckmanCoulter，Brea，CA)，抗CD8單克隆抗體HIT8a(BD Pharmingen，Lexington，KY)，和抗整合素-β2(CD18)的單克隆抗體60.3(Beattyet al.，J Immunol，131，2913-8，1983)。
淋巴細胞的FACS分析。通過FACS(Epics XL，Coulter，Miami，FL)方法評估CD的表達密度，使用PE標記的單克隆抗體，並在細胞達到預設的最小亮度時將它們計為陽性。為了研究淋巴細胞在體外活化之後CD3表達密度增加是否是由於最初CD3高表達細胞選擇性增殖的造成的，用染料CFDA對從腫瘤患者收集的外周血淋巴細胞(den Haan et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)(MolecularProbes，Eugene，OR)進行標記。隨後，在附著有抗CD3/CD28/CD40磁珠的培養液中培養5天，然後去除磁珠，將擴增後的淋巴細胞移至含有10U白介素-2/ml的培養基中。在去除磁珠後的兩個時間點(4小時和3天)時進行FACS分析，分析每個孔的CFDA亮度和CD3的表達。將培養後被標記的淋巴細胞與對照磁珠共同培養用於比較研究。
抗體偶聯磁珠刺激T細胞低反應水平。開始進行了6項實驗，從腫瘤浸潤淋巴細胞中純化的CD8+的T淋巴細胞與腫瘤細胞共同培養，對懸浮液進行腫瘤壞死因子或幹擾素-γ的分析。在一個有代表性的實驗中，將取自一名結腸癌患者，1C，的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞，與1C腫瘤細胞共同培養15天，然後將淋巴細胞取出，並加入一組新鮮的1C細胞中或加入取自一名肺癌患者的腫瘤細胞--3L中。當1C淋巴細胞與1C結合而沒有與3L結合時，僅測得少量的腫瘤壞死因子(1.2pg/ml)，但是當來自3L的腫瘤浸潤淋巴細胞與3L腫瘤細胞結合，但沒有單獨培養時，產生了腫瘤壞死因子和幹擾素-γ(1.5pg/ml)。沒有淋巴細胞增殖的證據。在隨後的實驗中，將除CD8+淋巴細胞之外，還包含有單核細胞，CD4+T細胞和B細胞的腫瘤浸潤淋巴細胞細胞群，與自體腫瘤細胞共同培養10-15天。在13名患者中，有8名患者的培養懸液中檢測到了約10倍高水平的腫瘤壞死因子(4.5-48pg/ml)和幹擾素-γ(高達150pg/ml)。仍然沒有淋巴細胞增殖。
在自體腫瘤細胞和抗CD3偶聯磁珠共同培養時，T細胞增殖和腫瘤細胞破壞的論證。最初的實驗之後進行一項系統實驗，即使用單克隆抗體偶聯的磁性磁珠通過各種淋巴細胞受體(Levine，Bernstein etal.，J Immunol，159，5921-30，1997；Garlie，LeFever et al.，JImmunother，22，336-45，1999)誘導產生信號。在偶聯有CD3單克隆抗體，和CD28和/或CD40單克隆抗體磁珠存在的培養基中，將外周血單核細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞與自體腫瘤細胞共同培養。還包括含有淋巴細胞但不含有腫瘤細胞的相同分組。作為對照，含有或不含有腫瘤細胞的淋巴細胞與未經偶聯的對照磁珠共同培養。3-5天後，去除磁珠，將淋巴細胞和腫瘤細胞在10U/ml的白介素-2中分別孵育2-21天。
圖1顯示OV44患者腫瘤浸潤淋巴細胞在抗CD3/CD28/CD40偶聯磁珠中培養4天時旺盛增殖的實驗結果。缺乏CD3信號刺激的淋巴細胞不會增殖，使用抗CD28和/或CD40磁珠培養的淋巴細胞也不會增殖(未顯示數據)。自體腫瘤細胞最初與通過CD3誘導信號的磁珠共同培養時增殖較多(圖面B)。抗CD3/CD28偶聯磁珠誘導的增殖與抗CD3/CD28/CD40偶聯磁珠相同(數據未顯示)。
圖2顯示來自患者1C的外周血淋巴細胞和各種單克隆抗體偶聯磁珠與自體腫瘤細胞或同種異體(4007)細胞培養5天的實驗結果。當CD3/CD28(圖面C)或抗CD3/CD28/CD40(圖2D)活化的淋巴細胞與1C腫瘤細胞共同培養時，每個培養孔中淋巴細胞的數量比其與4007細胞共同培養時要高，結果與圖1中所示相同。FACS分析顯示，＞90％的活化的淋巴細胞表達CD3，大約70％是CD8+，少於5％表達CD16或CD56。另一方面，在磁珠不提供任何CD3介導的信號的情況下(圖2A和B)，加入異源腫瘤細胞後增殖水平較高，可能是由於對在4007細胞上表達的異體抗原產生免疫反應。
大多數腫瘤細胞在與存在抗CD3/CD28或抗CD3/CD28/CD40偶聯磁珠的情況下培養的自體淋巴細胞接觸24-48小時之內被破壞，常常會留下含有完全由有著淋巴細胞形態細胞構成的培養基。為了研究這種腫瘤破壞是否具有免疫特異性，進行了四項實驗，首先對來自腫瘤患者的外周血淋巴細胞(106-105/份樣本)進行梯度稀釋，將它們與自體腫瘤細胞或來自同種異體供者的腫瘤細胞或纖維母細胞共同培養。在兩項實驗中，與自體腫瘤共同培養的細胞懸液中存在大約10倍多的腫瘤壞死因子，但是自體或同種異體腫瘤細胞或同種異體纖維母細胞共同培養基之間在殺傷細胞的數據上沒有差異。由此推斷，在淋巴細胞活化24-72小時之後出現的腫瘤細胞的破壞不具有抗原特異性，或許是由於大量活化的T淋巴細胞和淋巴細胞因子不能辨別特異性的組分。
腫瘤選擇性細胞毒性淋巴細胞的產生。I類主要組織相容性抗原限制性的細胞毒性淋巴細胞是由腫瘤細胞加上抗CD3/CD28或抗CD3/CD28/CD40磁珠活化的淋巴細胞產生的。圖3顯示用取自患者1C的外周血淋巴細胞(在圖2顯示的實驗中已被活化)所做的一個實驗，在經腫瘤細胞和單克隆抗體偶聯磁珠活化之後，將磁珠去除，並將淋巴細胞在缺乏腫瘤細胞和磁珠的10U白介素-2/ml培養基中擴增培養超過3周。被1C和抗CD3/CD28磁珠活化的外周血淋巴細胞對1C細胞有著很強的細胞溶解性，CD8單克隆抗體和I類主要組織相容性抗原單克隆抗體w6/32可以抑制這種溶解作用(圖3A)。50∶1的E/T僅僅能殺死20％的同種異體4007細胞，相比之下98％的1C細胞會被50∶1的E/T溶解(圖3A)。圖3B提供了被抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激的外周血淋巴細胞的類似數據。4007細胞的溶解與存在有單克隆抗體w6/32時培養的1C處於同樣低的水平。相比之下，抗CD3/CD28/CD40磁珠活化的外周血淋巴細胞可以殺傷1C和4007兩種細胞，這種情況也出現在CD8單克隆抗體或單克隆抗體w6/32存在的情況下(數據未顯示)。圖3B中顯示在實驗中使用的從細胞群中濃縮得到的CD8+細胞以20/1的E/T比率溶解了25％的1C細胞，相比較來自4007細胞系溶解了0％的細胞，來自同種異體B細胞系也溶解了0％的細胞。在這項實驗中，使用單克隆抗體w6/32培養1C細胞的溶解率為5％，使用抗CD18單克隆抗體60.3培養時的溶解率為5％，使用CD16和CD56單克隆抗體聯合培養時，溶解率僅僅從25％減少到18％。通過與4007細胞和任何一種磁珠聯合培養活化的淋巴細胞並不會選擇性的溶解1C或4007細胞。重複細胞毒性淋巴細胞分析法兩次，均獲得同樣的結果。
Th1型淋巴因子的產生。CD3介導活化的淋巴細胞培養上清中可見檢測到大量的幹擾素-γ。圖4中對此進行了說明，這也說明在培養開始的4-5天期間還存在自體腫瘤細胞時產生的幹擾素-γ較高。
表1顯示了六個額外的，有代表性的實驗，表明外周血淋巴細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞的增殖和淋巴細胞因子的產生在取自患者的細胞或在一輪的體外磁珠活化之後均可被檢測出來。抗CD3，抗CD3/CD28，抗CD3/CD40和抗CD3/CD28/CD40磁珠均能強烈地促進淋巴細胞的增殖，它們之間的效果並沒有差別。相比較而言，單獨使用抗CD28，抗CD40和抗CD28/CD40磁珠，並不比對照磁珠更能增加淋巴細胞的增殖和淋巴因子的產生，這表明CD3介導的信號非常重要。腫瘤壞死因子和幹擾素-γ的產生有相關性。當淋巴細胞在沒有腫瘤細胞和磁珠的情況下生長3-5天時，它們的含量降低到背景水平。如圖1和4所示，誘導有效的淋巴細胞增殖和淋巴因子產生需要CD3信號。
通過單克隆抗體-偶聯磁珠活化的淋巴細胞上CD3和其他標誌物的上調。在與腫瘤細胞和抗CD3/CD28/CD40磁珠一起培養3到5天之前和之後，用FACS測量在淋巴細胞群上CD抗原的表達密度，然後的3到7天則為不加磁珠培養的擴增期。為了反應CD受體表達密度的變化，報告每一群細胞的百分比，它們的密度等於選定的設定值亮度，或者高於設定值(表2)；分析來自6名健康供者(年齡在30到65歲)未被刺激的外周血淋巴細胞作為比較。來自腫瘤患者的未被刺激的外周血淋巴細胞的CD3，CD4和CD28的水平較低。5名患者中的4名CD3密度也較低，而CD86的密度高於健康供者未被刺激的外周血淋巴細胞水平。與對照磁珠共同培養的外周血淋巴細胞CD3表達部分增加，但CD28的表達增加不明顯。相比較之下，使用抗CD3/CD28/CD40磁珠培養的細胞CD3和CD28的表達量都能恢復到正常的水平，並且使高CD8表達密度的細胞數量加倍。對5名患者的TIL研究CD3的表達密度。分別為2.9％，40.2％，96％，42.8％和40.1％，顯示也更為多變，並且通常高於外周血單核細胞。腫瘤浸潤淋巴細胞的CD3表達高於外周血單核細胞，並且從61.4％增加到87.3％。腫瘤浸潤淋巴細胞中CD28表達的相應值為39.3％和52.8％。
為了研究淋巴細胞在體外活化之後CD3表達密度的增加是否是由於最初高CD3表達的細胞選擇性增值的結果，可使用染料CFDA(Molecular Probes，Eugene，OR)對從腫瘤患者濃縮得到的外周血淋巴細胞進行標記。使用腫瘤浸潤淋巴細胞進行實驗，40.2％最初表達CD3，應用染料CFDA(den Haan，Lehar et al，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)進行標記。通過抗CD3/CD28/CD40磁珠活化之後，CD3表達增加至95％。使用CFDA和PE-標記的抗CD3作為探針進行FACS分析，結果顯示沒有最初CD3高表達外周血淋巴細胞亞群的選擇性增殖。
在使用抗CD3/CD28磁珠活化之後培養細胞的CD83的表達。為了研究使用抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激外周血單核細胞(發現其中10-20％表達單核細胞標誌物CD14)是否可以促進樹突狀細胞的成熟，在刺激之後的不同時間點對CD83的表達進行了測量。CD83是由成熟之後的樹突狀細胞表達的，未成熟的樹突狀細胞和血單核細胞並不表達。圖5說明了一個典型的實驗，顯示早在應用抗CD3/CD28磁珠刺激PBMC之後的24小時，在35％的細胞中就可以檢測到CD83的表達。在刺激外周血單核細胞的第0天(刺激之前)未檢測到CD83的表達。
為了確定外周血單核細胞刺激之後什麼細胞表達CD83，在使用抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激之後的第2天，使用螢光素標記的抗CD3對PE-標記的抗CD83兩種顏色進行染色。圖6顯示在缺乏磁珠刺激的細胞沒有CD83的表達，抗CD3/CD28偶聯磁珠誘導CD3陰性細胞群(13.9％)CD83的表達，且CD3陽性細胞中也有相當的比例表達CD83。相比之下，抗CD3/CD28/CD40偶聯磁珠可以活化誘導CD83的表達，但是所誘導的CD3陰性細胞和CD3陽性細胞表達CD83的水平比抗CD3/CD28磁珠的誘導要低。這些結果顯示，表達樹突狀細胞標誌物CD83的細胞是在經過抗CD3和抗CD28單克隆抗體偶聯磁珠刺激之後從外周血單核細胞快速誘導而來的。抗CD3，抗CD28，和抗CD40單克隆抗體偶聯磁珠的刺激作用，沒有抗CD3和抗CD28單克隆抗體偶聯磁珠單獨用於刺激CD83的表達那樣有效。
通過單克隆抗體偶聯磁珠產生的活化信號增加對TGF-β1抑制作用的抗性。表3顯示了5個有代表性的實驗，研究TGF-β1對淋巴因子產生和淋巴細胞增殖的抑制效果是否可以通過與可以誘導CD3介導信號的磁珠共同培養而被改變。使用對照磁珠，腫瘤壞死因子和幹擾素-γ水平很低，並且它們的水平被TGF-β1進一步抑制。相比之下，使用抗CD3/CD28/CD40磁珠時，他們的水平增加到了沒有TGF-β1時出現的水平。同樣，當使用抗CD3/CD28/CD40磁珠時，TGF-β1對於淋巴細胞增殖的抑制作用更小，在患者1HN甚至根本未發現抑制作用。當TGF-β1的劑量增加到20ng/ml，且當淋巴細胞的濃度減少到105/樣本時(數據未顯示)，也可以見到T細胞的增殖和淋巴因子的產生出現相對排斥。當磁珠通過CD28，CD40單獨或共同進行刺激時，並不會抵抗TGF-β1的作用(數據未顯示)。
因此，伴隨著腫瘤細胞的殺傷，與腫瘤細胞共同培養的淋巴細胞活化導致了抗原的釋放。培養基中的單核細胞吞噬腫瘤抗原，分化成CD83陽性的抗原遞呈細胞遞呈抗原決定簇，使腫瘤反應性T細胞選擇性增殖。治療疫苗可以基於同樣的原理，活化和增殖腫瘤攜帶個體中的受抑制的淋巴細胞，也可以促進針對亞顯性抗原決定簇的免疫反應的產生。總體而言，產生腫瘤反應性T細胞的培養體系將包括四部分。它們是1)來源於癌症患者的T細胞，2)來自患者的抗原遞呈細胞，3)與抗CD3和抗CD28抗體，或抗CD3，抗CD28和抗CD40抗體偶聯的磁珠，和4)來自患者的腫瘤細胞這些組成部分可以有很多種變化，這下變化可被預測或進行評價。包括任何四種組成部分加入時間的變化，還有四種組成部分來源的不同。例如，患者T細胞可以從外周血或腫瘤浸潤淋巴細胞中分離。抗原遞呈細胞，在實施例中是存在於外周血單核細胞部分中的，但是可以有其他來源，例如骨髓。實施例中在培養基中使用的是自體腫瘤細胞，但是也可以加入同種異體腫瘤細胞或腫瘤抗原或用其替代自體腫瘤細胞，這是因為腫瘤抗原是通過自體抗原遞呈細胞來遞呈的。抗CD3和抗CD28抗體偶聯磁珠可以被其他途徑固相化的抗體替代，也可以由針對其他細胞表面受體所產生的固相化抗體或者特異性的配體組成，促進多克隆T細胞的活化和腫瘤反應性T細胞的增殖。
這些操作方法也使CD3陽性淋巴細胞的產生成為可能，持續在體外培養超過10周，即可用於過繼免疫治療。這可能是由於通過CD28的聯合刺激減少了淋巴細胞凋亡的可能性(Boise et al..Immunity，3，87-98，1995；Daniel et al.，J Immunol，159，3808-15，1997)，在體外的生命周期延長(Levine，Bernstein et al.，J Immunol，159，5921-30，1997)。與在高劑量白介素2存在的情況下淋巴細胞存活期延長有所不同，共刺激的淋巴細胞在轉導回患者自體之後存活周期也會延長(Ranga et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，95，1201-1206，1998)。值得注意的是，CD3介導的T細胞的刺激作用是與CD28單獨結合或與CD24一起結合完成的，可以防止大約50％的TGF-β1介導的對淋巴細胞增殖和腫瘤壞死因子及幹擾素-γ產生的抑制作用，即使當使用的TGF-β1在培養液中的濃度處於20ng/ml的飽和水平時也是如此。
實施例2含有編碼抗人和抗小鼠CD3 scFv的載體的構建，轉染，並且證實在細胞表面表達抗CD3 scFv可誘導T細胞的多克隆刺激，使其增殖，並產生Th1型淋巴因子，具有體內溶細胞性及抗腫瘤活性的上面描述的實驗顯示，在含有自體腫瘤細胞和外周血單核細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞的培養基中，由抗CD3單克隆抗體偶聯磁珠提供的信號使腫瘤反應性淋巴細胞活化並擴增。這裡提到的基因是指構建的用於腫瘤治療的基因，可以在腫瘤細胞表面表達具有活性的抗CD3單克隆抗體scFv(scFv)衍生物。用雜交瘤500A2構建了與小鼠CD3具有反應性的抗CD3 scFv，用雜交瘤G19-4構建了與人CD3具有反應性的抗CD3 scFv(Ledbetter et al.，J.Immunol.，136，3945-3952，1986)。
scFv的構建。通過克隆來自雜交瘤RNA(Hayden et al.，TherImmunol，1，3-15.1994；Gilliland et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996)的抗體可變區輕鏈和重鏈構建scFv(scFvs)的細胞表面構型。雜交瘤生長在RPMI溶液[10％胎牛血清，4mM穀氨酸鹽，1mM丙酮酸鈉，和50u/ml青鏈黴素，(均購自Life Technologies，Gaithersburg MD)]中，在收穫細胞前保持對數生長方式數天。通過離心懸浮培養液收集細胞，應用Trazol或使用QIAGEN RNA柱抽提的方法(LifeTechnologies，Gaithersburg MD，and QIAGEN，Valencia，CA)按照生產商提供的說明，或者使用一種改良的NP-40溶解技術(Gilliland，Norris et aL，Tissue Antigens，47，1-20，1996)，從2×107個細胞中提取RNA。使用Superscript II反轉錄酶(Life Technologies)和隨機六聚體(Takara Shuzo，Otsu Shiga，Japan)，及1微克的總RNA進行隨機引物法合成cDNA第一鏈。在逆轉錄後，用dGTP和末端轉移酶使cDNA片段具有多聚G尾，這種酶可以催化三磷酸脫氧核苷酸在一條DNA鏈末端的3′-OH基團加上一個脫氧核苷酸。cDNA具有錨定尾，可增加在一端具有未知前導肽的mRNA克隆的效率。如所述，5′端引物是一個修飾的ANCTAIL引物，包括一個多聚C尾，用於T細胞受體核酸鏈序列的聚合酶鏈擴增反應(Loh et aL，Science，243，217-20，1989)，其還具有SacI，XbaI，和EcoRI位點，方便進行克隆。這一序列如下5』-cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatgagtccccccccccccc-3』cDNA的3』端引物來自重鏈或輕鏈的恆定區，並結合跨越J-C連接區的大約50個鹼基。每個3』端引物包含有HindIII，BamHI，和SalI克隆位點。因此，用於起始片段亞克隆的限制性位點作為這些起始PCR擴增引物的一部分，消化擴增的PCR片段並亞克隆到pUC19，pSL1180，或TOPO載體(Invitrogen，San Diego，CA)用於測序。使用pUC，T7，或Ml3通用和反向引物，以及BigDye末端中止循環測序試劑盒(PE Biosystems，Foster City，CA)，用ABI Prism 310(PE Biosystems)測序儀對miniprep DNA(QIAGEN.Valencia，CA)進行DNA測序。
一旦分離到可變區並且在至少三個相同的克隆得到了相同的序列，便可使用重疊寡聚核苷酸通過PCR擴增構建scFv，致使編碼輕鏈和重鏈可變區的cDNA融合。加入一種(gly4ser)3連接子作為重疊寡聚核苷酸的一部分的方法，使得輕鏈和重鏈可變區在這種縫合聚合酶鏈反應期間連接到一起(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996)。將裝配完畢的scFv分子亞克隆到按照閱讀框融合人CD80跨膜區和細胞質尾的人IgG1鉸鏈區，CH2，和CH3結構域的上遊(Winberg et al.，Immunol Rev，153，1996)。完整的表達盒編碼輕鏈V區域的天然的引導肽鏈，或來自能與scFv可變區的SalI位點融合的L6VK輕鏈的分泌性信號肽。scFv由HindIII-BclI，或SalI-BclI盒編碼，其第一個限制性位點與開放型閱讀框相符，與此同時，第二個限制性位點在與融合蛋白相關的編碼框之外。然後將該盒與編碼區位於BstBI-ClaI區段上的人IgG1野生型Fc結構域相融合。CD80的跨膜區域和細胞質中的尾部均可通過聚合酶鏈反應(PCR)的方法從人扁桃體RNA擴增而來，其編碼區位於BstBI-ClaI區段上，其中包括一個恰處於ClaI位點上遊的終止密碼子。將每一個亞片段都用亞克隆的方法插入人工的多連接子/多克隆位點當中，這些位點事先已被插入至經修飾的pCDNA3載體當中。一旦編碼細胞表面scFv的完整融合蛋白結構組裝完畢，便可將整個表達盒作為一種HindIII-ClaI片段轉移至逆轉錄表達載體pLNCX當中去(Miller and Rosman，Biotechniques，7，980-2，984-6，989-90，1989)(圖9)。
轉染。質粒DNA是由重組的反轉錄載體製備而來的，並用CaPO4沉澱技術(Winberg，et aL，(1996)Immunol Rev.153209-223.)轉染PT67雙嗜性包裝細胞(Clontech，Palo Alto，CA)。簡言之，將細胞以約25％的融合度，加入含有10％胎牛血清、4mM穀氨酸鹽、2倍濃度的DMEM非必須胺基酸和青黴素-鏈黴素的DMEM培養基(這種配方在下文中被稱為DMEM-C，所有的試劑均購自LifeTechnologies公司)中，在轉染之前培養過夜。將質粒DNA加入0.5ml濃度為0.25M的CaCl2溶液中，再逐滴加入0.5ml 2倍濃度的HEBS緩衝液(pH 7.1)。在37℃的環境下，5分鐘後會析出沉澱，然後將溶液逐滴加入生長在加有DMEM-C培養基(8ml)的、直徑為100mm的培養皿內的細胞中。將經轉染的細胞孵育過夜，然後用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗兩遍，再倒入新鮮的培養基。從被轉染的細胞中收集病毒上清，並在24小時之後將其用於轉導。或者，將經轉染的，能夠表達細胞表面scFv的貼壁PT67細胞與B細胞系的細胞在懸浮液中共同培養。幾次傳代之後，將培養基中的包裝細胞稀釋，用固相化在培養瓶上的山羊抗人IgG1對細胞表面表達scFv的B細胞系進行陶選。表達高水平細胞表面scFv的細胞在培養瓶上的固定程度較為牢靠，不能表達該抗體的或抗體表達水平較低的細胞會被從培養瓶上洗脫。用在培養瓶表面刮拭的方法將高水平表達的細胞分離，在用於生物學分析之前重新培養數日。
小鼠和腫瘤細胞系。購買了6到8周的老年雌性C3H/HeN小鼠(Taconic，Germantown，New York)。K1735是一種C3H/HeN發生的惡性黑色素瘤，選擇了一種轉移克隆M2(Fidler and Hart，CancerRes，41，3266-3267，1981)。與先前的發現一致，發現其MHC I類表達非常低(數據未顯示)。動物設施是經過ALAC認證的並且實驗方法是經過相應的公共動物協會認可的。
抗體。R-藻紅蛋白(PE)-偶聯單克隆抗體GK1.5(抗小鼠CD4)，53-6.7(抗小鼠CD8a)和純化的AF3-12.1(抗H-2KK)購自Pharmingen公司(San Diego，California)，R-PE偶聯的山羊F(ab′)2抗人IgG購自Biosource International公司(Camarillo，California)。單克隆抗體169-4(抗CD8)來自R.Mittler博士(Emory University，Atlanta，Georgia)。GK1.5(抗CD4)是來自ATCC雜交細胞瘤產生的。
載體和K1735細胞的轉染。描述了可變區克隆，scFv構建，和scFv表達產生的方法(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996；Hayden et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。本發明採用來自抗CD3雜交瘤500A2或者抗4-1BB雜交瘤1D8可變區的基因來使得細胞結合500A2 scFv或者1D8 scFv在細胞表面表達(Hayden，Grosmaire et al..Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，ImmunolRev，153，1996)。為了表達scFv，使用了來自CD80的跨膜結構域和細胞質尾，因為其介導了細胞骨架的附著和細胞與細胞接觸時的交聯(Doty and dark，J Immunol，157，3270-9，1996；Doty and Clark，JImmunol，161，2700-7，1998)。將scFv基因融合到pLNCX中，通過CaPO4沉澱方法轉染RetroPackTMPT67包裝細胞(ClontechLaboratories.Inc，Palo Alto，California)。使用來自這些細胞的培養基轉染K1735-WT細胞。使用PE標記的羊抗人IgG對G418抗性克隆進行標記用於scFv細胞表面的表達。
動物研究。小鼠，5或10隻/組，後背一側皮下移植2×106個野生型K1735細胞或K1735-500A2細胞或γ-射線照射的(12,000拉德)野生型K1735細胞。使用野生型K1735細胞(2×106細胞/小鼠)或Ag104(3×105細胞/小鼠)刺激免疫小鼠。通過應用測徑器測量兩個最大的垂直直徑來評估腫瘤的大小，並報告平均腫瘤面積(mm2)±SD。將腫瘤皮下移植的部位的毛剃除有利於腫瘤的測量。
CD4+和/或CD8+T淋巴細胞和自然殺傷細胞在體內的消耗。T細胞消耗如文中所述(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992)，給小鼠腹腔注射CD4單克隆抗體(GK1.5，小鼠IgG2b)或CD8(169-4，小鼠IgG 2a)或二者的混合成分，3次劑量為0.5mg/小鼠，連續注射3天。隨後每3天使用每種單克隆抗體0.5mg，以維持這種消耗。通過每4天腹腔以30ul/只小鼠的劑量注射抗asialo GM1抗體維持NK細胞的消耗。在第12天，用FACS分析每組的脾細胞來證實消耗的效率。隨後，給小鼠皮下移植腫瘤細胞。
增殖方法。將脾細胞在96孔平底培養板(1×105個細胞/孔)與5×105個自體的，經射線照射後的(3,000拉德)脾細胞(作為抗原遞呈細胞)和腫瘤細胞共同培養。在孵育了72小時之後，將一式三份的培養物用1μCi3[H]標記的胸腺嘧啶脈衝16-18小時(AmershamPharmacia，Biotech Piscataway，New Jersey)，並測量攝入量。
為了研究哪些T細胞在體外增殖，按照生產商提供的方法(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，將脾細胞在2μM的CFDASB(5-(和-6)-羧基螢光素雙乙酸琥珀酸脂)(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)中進行了孵育標記，在野生型K1735細胞存在和不存在的情況下培養了三天，並用FACS進行分析。
細胞毒性淋巴細胞活性檢測方法。K1735-1D8移植後2-4周處死小鼠，並製備脾細胞懸浮液。按照規定，使用抗asialo GM1抗體加上兔補體(Cedarane，Ontario，Canada)去除NK細胞，在一個24孔培養板中(Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts)將5×106個脾細胞與用1×105□-照射的(12,000拉德)野生型K1735細胞細胞培養5天。應用一種4小時51Cr釋放方法，在不同的E/T比率檢測細胞的活性。
ELISPOT方法。按照生產商提供的方法使用小鼠IFN-γELISPOT試劑盒(RD Systems，Minneapolis，Minnesota)，並通過平板掃描裝置對平板進行計數(Cellular Technology Ltd.，Cleveland，Ohio)。
有多克隆活性的人T細胞擴增產生Th1型淋巴因子並使細胞裂解。圖10顯示了抗人CD3 scFv在Reh細胞和T51細胞表面的表達，其中，前者為一種網狀內皮細胞系的細胞，後者為一種淋巴細胞系的細胞。圖中顯示，被轉染的細胞抗CD3 scFv基因產物的表達水平很高。
通過與取自正常捐獻者的PBMC共同培養並檢測得知，被轉染的Reh和T51細胞與野生的Reh和T51細胞的能力相比，前者可以誘導T細胞的擴增。用絲裂酶素C對野生型的和被轉染的細胞系進行處理，以預防它們在培養期間擴增。被轉染的能夠表達抗CD3 scFv的Reh和T51細胞以劑量依賴的模式誘導T細胞的擴增，野生型的Reh和T51細胞則不會(圖11)。
進行試驗以檢測在腫瘤細胞表面表達的抗CD3 scFv是否能夠刺激來自外周血單核細胞的T細胞快速地殺死被轉染的細胞。將野生型的或被轉染的Reh和T51細胞分別用51Cr進行標記，用取自正常捐獻者的外周血單核細胞進行8小時51Cr釋放試驗。圖12顯示了靜止的T細胞快速殺死被轉染細胞，而非野生型細胞，並導致劑量依賴性的51Cr的顯著釋放。
K1735-500A2細胞被有免疫活性的自體小鼠排斥。如在圖7中所見到的，已被轉染並表達抗小鼠CD3 scFv的K1735-500A2細胞一過性地在小鼠體內生長，隨後便遭到排斥。表達CD80的細胞生長迅速，儘管比未經轉染的細胞要慢一些，但這與先前被報導的發現是一致的(Chen et al，J Exp Med，179，523-532，1994)。
有10隻小鼠被移植了3次，分別間隔7天，每次用2×106個抗CD3(500A2 scFv)轉染細胞進行移植(沒有接種任何腫瘤)。對9隻對照組小鼠僅注射磷酸鹽緩衝液(PBS)。然後，對兩組小鼠都用106個野生型K1735細胞進行刺激。野生型K1735細胞在所有對照組小鼠體內形成腫瘤，在10隻實驗組小鼠中，有6隻小鼠體內沒有形成腫瘤。有4隻經免疫的小鼠體內形成了腫瘤，但腫瘤形成的時間比未經免疫(對照)組小鼠晚。在任何一隻小鼠體內均沒有出現毒性或免疫抑制的證據，包括已經重複注射抗CD3 scFv轉染的腫瘤細胞的小鼠。
在將K1735-500A2細胞與野生型K1735細胞混合式出現旁觀者效應的證據。為了證實表達抗CD3 scFv的腫瘤細胞，例如，作為體內轉染的結果，是否會誘導也能有效抗野生型腫瘤細胞的免疫應答，共進行了兩項將野生型K1735細胞與K1735-500A2細胞相混合的試驗。第一項試驗顯示，當兩種類型的細胞等量混合的時候，腫瘤會在體內經過短時間的生長後發生退化。在第二項試驗中是將2×106個野生型K1735細胞與2×105個K1735-500A2細胞相混合。如圖13顯示，與單獨移植時相比，野生型細胞的生長被抑制了。
用K1735-500A2細胞免疫導致腫瘤選擇性T細胞增殖。收集拒絕移植的K1735-500A2細胞的小鼠的脾細胞。圖14顯示這種脾細胞的增殖，脾細胞當在體外與經放射照射的野生型K1735細胞共同培養時，比脾細胞與經放射照射的抗原性迥異的自體肉瘤Ag104細胞共同培養時增殖的程度更大。射線照射K1735-500A2細胞免疫小鼠脾細胞並不比天然小鼠脾細胞(對照)增殖旺盛。
因此，抗CD3 scFv在腫瘤細胞表面的表達誘導快速殺傷腫瘤細胞，並導致T細胞增殖。這些特性促進了腫瘤特異性免疫，因為腫瘤細胞的破壞以及T細胞的多克隆活化產生腫瘤抗原，後者由在T細胞產生的細胞因子的影響下成熟的樹突狀細胞吞噬。T細胞通過多克隆抗CD3激活作用首先被致敏，然後隨著他們識別由抗原遞呈細胞遞呈的腫瘤抗原，腫瘤特異性T細胞繼續增殖。活化的T細胞形成的1型淋巴因子，以及T細胞本身，可以破壞旁觀腫瘤細胞，說明在體內腫瘤細胞的轉染，表達抗CD3 scFv可能具有治療效果。
實施例3抗4-1BB scFv用於癌症基因治療為了製成能夠刺激免疫系統的疫苗，要用現有的技術(Hayden，Grosmaire et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaireet al.，Immunol Rev，153，1996)構建一個能夠編碼來源於雜交瘤1D8(一種抗-4-1BB單克隆抗體)(Melero，Shuford et al.，Nat Med，3，682-5，1997)的細胞結合型scFv的載體。將這種載體轉染至來源於K1735黑色素瘤的細胞當中(Ward et al.，J.Exp.Med.，170，1989)，這種細胞的免疫源性較低，且I型主要組織相容性抗原的表達水平較低。被轉染的細胞會誘發一種強烈的Th1型免疫反應，CD4+、而非CD8+的T淋巴細胞對這種反應是必需的，自然殺傷細胞也參與了這種反應。經接種的小鼠能夠排斥野生型K1735腫瘤在皮下長成結節或在肺中生長。這項發明的方法將可以有效地對抗人類患者出現微型腫瘤轉移灶，包括，例如I型主要組織相容性抗原的表達水平較低的那些腫瘤。
小鼠和腫瘤細胞系。購買了6到8周齡的雌性C3H/HeN小鼠(Taconic，Germantown，New York)。K1735是一種C3H/HeN發生的惡性黑色素瘤，選擇了一種穩定克隆M2(Fidler and Hart，CancerRes，41，3266-3267，1981)。與先前的發現一致，發現其MHC I類表達非常低(數據未顯示)。Ag104(Ward，Koeppen et al.，J.Exp.Med.，170，1989)是長在C3H/HeN小鼠身上的一種自發性纖維肉瘤。YAC-1購自American Type Culture Collection(Rockville，Maryland)。動物設施是經過ALAC認證的並且實驗方法是經過相應的公共動物協會認可的。
抗體。R-藻紅蛋白(PE)-偶聯單克隆抗體GK1.5(抗小鼠CD4)，53-6.7(抗小鼠CD8a)和純化的AF3-12.1(抗H-2KK)購自Pharmingen公司(San Diego，California)，R-PE偶聯的山羊F(ab′)2抗人IgG購自Biosource International公司(Camarillo，California)。單克隆抗體169-4(抗CD8)來自R.Mittler博士(Emory University，Atlanta，Georgia)。GK1.5(抗CD4)是來自ATCC雜交細胞瘤產生的。兔抗asialo GM抗體購自Wako純化試劑工廠(Richmond，Virginia)，純化的兔IgG購自Sigma和Rockland公司(Gilbertsville，Pennsylvania)。
載體和K1735細胞的轉染。描述了可變區克隆，scFv構建，和scFv表達產生的方法(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996；Hayden et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。本發明採用來自抗CD3雜交瘤500A2或者抗4-lBB雜交瘤1D8可變區的基因來獲得細胞結合500A2 scFv或者1D8 scFv的細胞表面的表達(Hayden，Grosmaire etal..Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。為了表達scFv，使用了來自CD80的跨膜結構域和細胞質尾，因為其介導了細胞骨架的附著和細胞與細胞接觸時的交聯(Doty and dark，J Immunol，157，3270-9，1996；Doty andClark，J Immunol，161，2700-7，1998)。將scFv基因整合到pLNCX中，通過CaPO4沉澱方法轉染RetroPackTMPT67包裝細胞(ClontechLaboratories.Inc，Palo Alto，California)。使用來自這些細胞的培養基轉染野生型K1735細胞。使用PE標記的羊抗人IgG對G418抗性克隆進行標記，用於scFv在細胞表面的表達。
動物研究。小鼠，5或10隻/組，後背一側皮下移植2×106個野生型K1735細胞或K1735-500A2細胞或經γ-射線照射的(12,000拉德)野生型K1735細胞。使用野生型K1735細胞(2×106細胞/小鼠)或Ag104(3×105細胞/小鼠)刺激免疫小鼠。通過應用測徑器測量兩個最大的垂直直徑來評估腫瘤的大小，並報告平均腫瘤面積(mm2)±SD。將腫瘤皮下移植的部位的毛剃除，利於腫瘤的測量。
在第一項試驗中，給小鼠在尾側靜脈靜脈注射3×105野生型K1735細胞，以造成肺部轉移灶(Kahn et al.，J Immunol，146，3235-3241，1991)。三天之後，在小鼠背部的一側皮下移植K1735-1D8細胞，每周移植一次，共移植四次。移植野生型細胞37天之後，將小鼠處死。給小鼠氣管內注射印第安墨水(以15％的濃度溶於磷酸鹽緩衝液中)，將肺臟取出，未著色的轉移灶在黑色的正常組織襯託下肉眼可見(Estin et al.，Proc Nati Acad Sci USA，85，1052-6，1988)。
CD4+和/或CD8+T淋巴細胞和自然殺傷細胞在體內的消耗。T細胞消耗如文中所述(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992)，給小鼠腹腔注射CD4單克隆抗體(GK1.5，小鼠IgG2b)或CD8(169-4，小鼠IgG 2a)或二者的混合成分3次，以0.5mg/小鼠連續注射3天。隨後每3天使用每種單克隆抗體0.5mg，以維持這種消耗。通過每4天腹腔以30ul/只小鼠的劑量注射抗asialo GM1抗體維持NK細胞的消耗。在第12天，用FACS分析每組的脾細胞來證實消耗的效率。隨後，給小鼠皮下移植腫瘤細胞。
增殖方法。將脾細胞在96孔平底培養板(1×105個細胞/孔)與5×105個自體的，經射線照射後的(3,000拉德)脾細胞(作為抗原遞呈細胞)和腫瘤細胞共同培養。在孵育了72小時之後，將一式三份的培養物用1μCi3[H]標記的胸腺嘧啶脈衝16-18小時(AmershamPharmacia，Biotech Piscataway，New Jersey)，並測量攝入量。
為了研究哪些T細胞在體外增殖，按照生產商提供的方法(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，將脾細胞在2μM的CFDASB(5-(和-6)-羧基螢光素雙乙酸琥珀酸脂)(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)中進行了孵育標記，在野生型K1735細胞存在和不存在的情況下培養了三天，並用FACS進行分析。
細胞毒性淋巴細胞活性檢測方法。K1735-1D8移植後2-4周處死小鼠，並製備脾細胞懸浮液。按照規定，使用抗asialo GM1抗體加上兔補體(Cedarane，Ontario，Canada)去除NK細胞，在一個24孔培養板中(Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts)將5×106個脾細胞與用1×105□-照射的(12,000拉德)野生型K1735細胞細胞培養5天。應用一種4小時51Cr釋放方法，在不同的E/T比率檢測細胞的活性。
ELISPOT方法。按照生產商提供的方法使用小鼠IFN-γELISPOT試劑盒(RD Systems，Minneapolis，Minnesota)，並通過平板掃描裝置對平板進行計數(Cellular Technology Ltd.，Cleveland，Ohio)。
免疫組化。在注射腫瘤後10-30天將組織取出，用10％福馬林固定，封閉，製作4-6μm的切片，並用Vector ABC試劑盒(加利福尼亞，柏林蓋姆，Vector實驗室)染色，再按照操作手冊檢測CD4+和CD8+的T細胞。這部分操作也可採用H-E染色。
通過需要CD4+T細胞和自然殺傷細胞參與的機制排斥K1735-1D8細胞。將細胞結合的抗4-1BB scFv克隆至逆轉錄載體pLNCX中(圖15a)。將這個構建體轉染至取自K1735的轉移M2克隆的細胞(Fidlerand Hart，Cancer Res，41，3266-3267，1981)(被稱為野生型K1735細胞)。被轉染的細胞系，即K1735-1D8細胞，會在其表面表達高水平的抗4-1BB scFv(圖15b)。
野生型K1735細胞在皮下(s.c.)移植給天然自體(C3H)小鼠後生長迅速。儘管用與上述皮下移植相同劑量的K1735-1D8細胞已經在開始時形成面積約為30mm2的腫瘤，但在皮下移植後第20天時，這些腫瘤消退並消失了(圖15c)。用以同樣方法構建的，編碼抗人CD28scFv的對照載體轉染野生型K1735細胞，轉染後的細胞在C3H小鼠體內的生長速率與野生型K1735細胞相同。
為了研究CD4+和CD8+的T淋巴細胞以及自然殺傷細胞在K1735-1D8細胞消退過程中的作用，給天然小鼠腹腔內注射單克隆抗體以去除CD8+，CD4+，或CD4+和CD8+的T細胞，或腹腔內注射抗-asialo GM1兔抗體，以去除自然殺傷細胞。給對照組的小鼠注射大鼠IgG。12天之後，在對取自相同小鼠的脾細胞進行FACS分析顯示大量靶細胞已經耗盡的時候，給每個組的小鼠均皮下移植K1735-1D8細胞。在被注射抗CD8單克隆抗體或對照大鼠IgG，去除了CD4+T細胞或/和CD8+T細胞的小鼠體內，K1735-1D8細胞的生長動力學是相同的，這使得K1735-1D8細胞的生長狀況與野生型K1735細胞相同。細胞可以在所有自然殺傷細胞被耗盡的小鼠體內生長，儘管這種生長的速度比在CD4被耗盡的小鼠體內的速度要慢很多(圖15d)。
用K1735-1D8細胞進行免疫，利用免疫的記憶性和特異性誘導針對野生型K1735細胞的免疫。將C3H小鼠分為每組10隻，每隔10天皮下移植兩次K1735-1D8細胞或經放射線照射的野生型K1735細胞；給對照組的小鼠皮下注射磷酸鹽緩衝液(PBS)。10天之後，給小鼠注射野生型細胞。經K1735-1D8細胞免疫、但沒有接受經放射線照射的野生型K1735細胞免疫的小鼠抑制了野生型細胞(圖16a)。單獨用K1735-1D8細胞免疫足以保護機體對抗移植的野生型K1735細胞。
抑制野生型細胞兩個月後，經免疫能夠排斥K1735-1D8細胞的小鼠可以再次排斥被注射移植的野生型細胞(圖16a)。與此形成對比的是，來自無抗原相關性的肉瘤Ag104細胞在「排斥型」小鼠體內與在天然對照體內生長的一樣好(圖16b)。
在經過兩次對抗K1735-1D8的免疫，並在此後能夠排斥被移植的野生型細胞的小鼠中，約有20％會在長於4個月的隨診期間出現皮膚退色(圖16c)。沒有其他自身免疫的體徵。
K1735-1D8細胞作為一種治療用疫苗是有效的。進行了三項給已經形成野生型K1735腫瘤的小鼠體內移植K1735-1D8細胞的試驗。第一項是在已有表面積約為30mm2皮下腫瘤的小鼠體內做的試驗。給其中一組在每四周的第一周時在背部、野生型腫瘤的對側注射K1735-1D8細胞。給另一組移植經照射的野生型K1735細胞，給第三組皮下注射磷酸鹽緩衝液(PBS)。在所有對照組的小鼠和所有用經照射的野生型K1735細胞免疫的小鼠體內均形成了野生型腫瘤，與此形成對比的是，在被免疫抗K1735-1D8細胞的小鼠中，五隻小鼠中的四隻小鼠體內的腫瘤消退了(圖17a)，在三個月之後試驗終止時，這四隻小鼠仍沒有腫瘤，也沒有中毒的體徵。第五隻小鼠腫瘤結節的大小也減小了，只要該小鼠接受K1735-1D8細胞移植。
在第二項試驗中，是在用野生型K1735細胞移植前1天或移植後的4或8天開始，給小鼠每周皮下注射K1735-1D8細胞。在相同的用藥時機給其他組別的小鼠腹腔內注射1D8單克隆抗體用作比較。給對照組腹腔內注射磷酸鹽緩衝液(PBS)。如表4中所顯示的，必須在接受野生型細胞移植之後49天內處死所有對照組的小鼠，因為它們體內已經出現了≥100mm2的腫瘤。與此形成對比的是，在移植野生型細胞的前一天開始用K1735-1D8細胞接種或給予1D8單克隆抗體的小鼠，在移植野生型細胞之後70天試驗結束時小鼠體內沒有腫瘤。在用野生型細胞移植之後的第4或第8天開始，被免疫的抗K1735-1D8的小鼠，在進行觀察的前28天期間沒有可檢測出來的腫瘤，但在不再注射疫苗之後，這10隻小鼠中的4隻出現了腫瘤。WT細胞形成腫瘤後8天注射單克隆抗體的小鼠發生腫瘤的時間比相應的K1735-1D8組小鼠要早，但兩組小鼠的存活率沒有區別。將移植野生型細胞後20天收穫的腫瘤分成幾個部分，並進行HE染色和免疫組化評估。一個取自磷酸鹽緩衝液(PBS)對照組小鼠的腫瘤結節包括有許多腫瘤細胞和少量的CD4+和CD8+的T淋巴細胞，並對接受單克隆抗體注射第8天的一隻小鼠進行同樣的分析。與此對應的是，在取自首次進行抗K1735-1D8免疫第8天小鼠的腫瘤結節中，含有大量的CD4+和CD8+的T淋巴細胞，而僅含有極少量的腫瘤細胞(圖17b)。
第三項試驗也是五隻小鼠/組，在這項試驗中我們給小鼠靜脈注射3×105個野生型K1735細胞以形成肺部轉移。三天之後，每周皮下移植K1735-1D8細胞，共持續一個月；給對照組的小鼠靜脈注射磷酸鹽緩衝液(PBS)。在有一隻對照組小鼠死亡，或在接受野生型K1735細胞三十七天之後試驗中止。在那時，每個對照組小鼠的肺臟均有超過500個轉移灶，相比較之下，經免疫的小鼠肺臟中這樣的轉移灶少於10個(圖17c)。
用K1735-1D8細胞免疫可誘發Th1型免疫應答。通過氚標記的胸腺嘧啶的攝取進行測定，取自經免疫抗K1735-1D8小鼠的脾細胞的增殖程度大約為取自天然小鼠的或經放射線照射的野生型K1735細胞免疫的小鼠的脾細胞的兩倍(圖18a)。取自用K1735-1D8免疫的小鼠的脾細胞在與經放射線照射的野生型K1735細胞共同培養之後會增加大約4倍，與Ag104細胞共同培養則不能。也可以對取自天然小鼠和經免疫抗K1735-1D8的小鼠的脾細胞進行增殖實驗，脾細胞在與或不與經放射線照射的野生型K1735細胞共同孵育之前用CFDA SE(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)進行標記。取自K1735-1D8免疫小鼠的CD4+和CD8+脾細胞擴增迅猛(圖18b)，最強烈的擴增出現在野生型K1735細胞中。取自天然小鼠的脾細胞不出現擴增。
來自經免疫抗K1735-1D8小鼠的脾細胞比來自天然小鼠成攜帶K1735-WT腫瘤(圖19a)的小鼠的脾細胞，在ELISPOT分析中產生IFN r的要多。在表4的試驗中，用脾細胞進行的ELISPOT分析證實了在移植野生型K1735之前一天或之後四天，用K1735-1D8免疫的小鼠是有反應活性的，當先與野生型K1735細胞共同培養3天時反應活性較高(圖19b)。最強烈的反應活性出現在野生型細胞前一天免疫的組，這可能是由於腫瘤負荷較小的。來自用抗4-1BB單克隆抗體注射的小鼠或天然小鼠的脾細胞沒有表現出反應活性。
將取自被免疫抗K1735-1D8的小鼠的脾細胞與經照射的野生型K1735細胞共同孵育5天，然後用4小時51Cr釋放實驗進行分析。沒有先行去除自然殺傷細胞，K1735、Ag104和YAC細胞會以幾乎相同的量被裂解(圖19c)。然而，如果先將脾細胞與兔抗asialo GM1抗體加補體共同孵育去除自然殺傷細胞，那麼與Ag104或YAC細胞相比，其會明顯地表現出對抗野生型K1735細胞的細胞毒性淋巴細胞活性，儘管這種活性是較低的，這種活性還能被抗I類主要組織相容性抗原的單克隆抗體所抑制(圖19d)。
在K1735-1D8細胞與野生型K1735細胞混合式時出現旁觀者效應的證據。為了研究在體內表達抗4-1BB scFv的腫瘤細胞，例如作為一種體內轉染的結果，是否會誘發一種免疫應答，這種應答也具有對抗野生型腫瘤細胞的效應，現已進行了兩項將野生型K1735細胞與K1735-1D8細胞混合後進行研究的試驗。第一項試驗顯示了在兩種細胞等量混合之後，腫瘤在體內短暫生長之後便發生了消退。在第二項試驗中，將2×106個野生型K1735細胞與2×105個K1735-1D8細胞相混合。如圖20顯示，與它們單獨被移植時的情況相比，野生型細胞的生長被抑制了。
因此，源自抗-4-1BB雜交瘤1D8的，能夠表達細胞結合scFv的K1735-1D8細胞會被自體小鼠排斥，CD4+T淋巴細胞，自然殺傷細胞，而非CD8+的T淋巴細胞都是排異所必需的。另外，抗K1735-1D8的免疫會誘發針對野生型K1735的具有免疫記憶和特異性的系統免疫反應。與此相反，反覆用經放射線照射的野生型K1735細胞免疫的小鼠不會對野生型細胞的侵襲表現出保護作用。這與顯示K1735在轉染並表達CD80之後仍有著低免疫源性的數據是一致的。體外分析顯示，被免疫小鼠的脾細胞能夠對抗K1735-1D8細胞。給腫瘤攜帶小鼠接種疫苗不管是在腫瘤生長於皮下或肺中時都是具有療效的。
所觀察到的對抗野生型K1735這種低免疫源性的，I型主要組織相容性抗原表達量極低的腫瘤的治療效果提示，將腫瘤細胞轉染，使其表達抗4-1BB scFv，然後作為自體或同種異體疫苗使用可以破壞癌症病人在接受傳統治療後所剩餘的微小轉移灶。
人4-1BB特異性scFv來自雜交瘤5B9，加工過程與上面描述的G19-4，500A2和1D8 scFv的加工過程是一致的。圖21顯示了5B9 scFv序列與人IgG1鉸鏈、CH2和CH3結構域以及人CD80的跨膜結構域和胞漿尾相融合。
***參考文獻Allison，J.P.，C.Chambers，et al.(1998).「A role for CTLA-4-mediated inhibitorysignals in peripheral T cell tolerance？」Novartis Found Symp21592-8.
Beatty，P.G.，J.A.Ledbetter，et al.(1983).「Definition of a common leukocyte cell-surface antigen(Lp95-150)associated with diverse cell-mediated immune functions.」J Immunol131(6)2913-8.
Bennett，M.W.，J.O′Connell，et al.(1998).「The Fas counterattack in vivoapoptoticdepletion of tumor-infiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by humanesophageal carcinoma.」J Immunol160(11)5669-75.
Boise，L.H.，A.J.Minn，et al.(1995).「CD28 costimulation can promote T cell survivalby enhancing the expression of Bcl-XL.」Immunity3(1)87-98.
Boon，T.，P.G.Coulie，et al.(1997).「Tumor antigens recognized by T cells.」ImmunolToday18(6)267-8.
Cassian，Y.，P.A.Savage，et al.(1999).「Isolation of high avidity melanoma-reactiveCTL from heterogeneous populations using peptide-MHC tetramers.」J.Immunol.162(2227-2234).
Chappell，D.B.and N.P.Restifo(1998).「T cell-tumor cella fatal interaction？」CancerImmunol lmmunother47(2)65-71.
Cheever，M.A.，M.L.Disis，et al.(1995).「Immunity to oncogenic proteins.」ImmunolRev14533-59.
Chen，L.，S.Ashe，et al.(1992).「Costimulation of antitumor immunity by the B7counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4.」Cell71(7)1093-102.
Chen，L.，P.McGowan，et al.(1994).「Tumor immunogenicity determines the effect ofB7 costmulation on T cell-mediated tumor immunity.」J Exp Med179523-532.
Chen，W.，W.Jin，et al.(1998).「Engagement ofcytotoxic T lymphocyte-associatedantigen 4(CTLA-4)induces transforming growth factor beta (TGF-beta)production by murineCD4(+)T cells.」J Exp Med188(10)1849-57.
Daniel，P.T.，A.Kroidl，et al.(1997).「Costimulatory signals through B7.1/CD28 preventT cell apoptosis during target cell lysis.」J Immunol159(8)3808-15.
DeBenedette，M.A.，N.R.Chu，et al.(1995).「Role of 4-1BB ligand in costimulation ofT lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP.」J Exp Med181(3)985-92.
den Haan，J.M.M.，S.M.Lehar，et al.(2000).「CD8+but not CD8-dendritic cells cross-prime cytotoxic T cells in vivo.」J.Exp.Med.1921685-1695.
D′Orazio，T.J.and J.Y.Niederkom (1998).「A novel role for TGF-beta and IL-10 in theinduction of immune privilege.」J Immunol160(5)2089-98.
Doty，R.T.and E.A.Clark (1996).「Subcellular localization of CD80 receptors isdependent on an intact cytoplasmic tail and is required for CD28-dependent T cellcostimulation.」J Immunol157(8)3270-9.
Doty，R.T.and E.A.Clark (1998).「Two regions in the CD80 cytoplasmic tail regulateCD80 redistribution and T cell costimulation.」J Immunol161(6)2700-7.
Ellenhorn，J.D.，R.Hirsch，et al.(1988).「In vivo administration of anti-CD3 preventsmalignant progressor tumor grovth，」Science242(4878)569-71.
Espevik，T.and J.Nissen-Meyer (1986).「A highly sensitive cell line，WEHI 164 clone13，for measuring cytotoxic factor/tumor necrosis factor from human monocytes.」J ImmunolMethods95(1)99-105.
Estin，C D.，U.S.Stevenson，et al.(1988).「Recombinant vaccinia virus vaccine againstthe human melanoma antigen p97 for use in immunotherapy.」Proc Natl Acad Sci U S A85(4)1052-6.
Fidler，I.J.and I.R.Hart (1981).「Biological and experimental consequences of the zonalcomposition of solid tumors.」Cancer Res413266-3267.
Finn，O.J.，K.R.Jerome，et al.(1995).「MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunityand cancer vaccines.」Immunol Rev14561-89.
Fiorentino，D.F.，M.W.Bond，et al.(1989).「Two types of mouse T helper cell.IV.Th2clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones.」J Exp Med170(6)2081-95.
Garlie，N.K.，A.V.LeFever，et al.(1999).「T cells coactivated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potential immunotherapy for cancer.」J Immunother22(4)336-45.
Gilliland，L.K.，N.A.Norris，et al.(1996).「Rapid and reliable cloning of antibodyvariable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments.」TissueAntigens47(1)1-20.
Greenberg，P.D.(1991).「Adoptive T cell therapy of turmorsmechanisms operative inthe recognition and elimination of tumor cells.」Adv Immunol49281-355.
Hahne，M.，D.Rimoldi，et al.(1996).「Melanoma cell expression of Fas (Apo-1/CD95)ligandimplications for tumor immune escape.」Science2741363-1366.
Hayden，M.S.，L.S.Grosmaire，et al.(1996).「Costimulation by CD28 sFv expressed onthe tumor cell surface or as a soluble bispecific molecule targeted to the L6 carcinoma antigen.」Tissue Antigens48(4 Pt1)242-54.
Hayden，M.S.，P.S.Linsley，et al.(1994).「Single-chain mono-and bispecific antibodyderivatives with novel biological properties and antitumour activity from a COS cell transientexpression system.」Ther Immunol1(1)3-15.
Hellstrom，I.，K.E.Hellstrom，et al.(1969).「Studies on immunity to autochthonousmouse tumors.」Transplant Proc1(1)90-4.
Hellstrom，K.E，and I.Hellstrom (1969).「Cellular immunity against tumor specificantigens.」Adv Cancer Res12167-223.
Hellstrom，K.E.and I.Hellstrom (1974).「Lymphocyte-mediated cytotoxicity andblocking serum activity to tumor antigens.」Adv Immunol18209-77.
Hellstrom，K.E.and I.Hellstrom (1999).Cancer Vaccines，Handbook of ExperimentalPharmacology.P.Perlmann and H.Wigzell.Heidelberg，Springer.Vaccines (Chapter 17)463-478.
Hu，H.M.，W.J.Urba，et al.(1998).「Gene-modified tumor vaccine with therapeuticpotential shifts tumor-specific T cell response from a type 2 to a type 1 cytokine profile.」JImmunol161(6).3033-41.
Huang，A.Y，P.Golumbek，et al.(1994).「Role of bone marrow-derived cells inpresenting MHC class I-restricted tumor antigens.」Science264(5161)961-5.
Hurtado，J.C.，Y.J.Kim，et al.(1997).「Signals through 4-1BB are costimulatory topreviously activated splenic T cells and inhibit activation-induced cell death.」J Immunol158(6)2600-9June，C H.，J.A.Ledbetter，et al.(1990).「Role of the CD28 receptor in T-cellactvation.」Immunol Today11(6)211-6.
Kahn，M.，H.Sugawara，et al.(1991).「CD4+T cell clones specific for the human p97melanoma-associated antigen can eradicate pulmonary metastases from a murine tumorexpressing the p97 antigen.」J Immunol146(9)3235-3241.
Kehrl，J.H.，L.M.Wakefield，et al.(1986).「Production of transforming growth factorbeta by human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth.」J ExpMed163(5)1037-50.
Kerr，W.G.and J.J.Mule′(1994).「Gene therapycurrent status and future prospects.」J.Leuko.Biol.56210-214.
Kiessling，R.，K.Kono，et al.(1996).「Immunosuppression inhuman tumor-hostinteractionrole of cytokines and alterations in signal-transducing molecules.」Springer Semin.Immunopathol.18227-242.
Kiessling，R.，K.Wasserman，et al.(1999).「Tumor-induced immune dysfunction.」Cancer Immunol.lmmunother.48353-362.
Kim，Y.J.，S.H.Kim，et al.(1998).「Human 4-1BB regulates CD28 co-stimulation topromote Thl cell responses.」Eur J Immunol28(3)881-90.
Klein，G.，H.O.Sjgren，et al.(1960).「Demonstration of resistance againstmethylcholanthrene-induced sarcomas in the primary autochthonous host.」Cancer Res201561-1572.
Krummel，M.F.and J.P.Allison (1996).「CTLA-4 engagement inhibits IL-2accumulation and cell cycle progression upon activation of resting T cells.」J Exp Med183(6)2533-40.
Kugler，A.，G.Stuhler，et al.(2000).「Regression of human metastatic renal cellcarcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids.」Nature Medicine6332-.
Kume，T.，K.Oshima，et al.(1999).「Relationship between Fas-ligand expression oncarcinoma cell and cytotoxic T-lymphocyte response in lymphoepithelioma-like cancer of thestomach.」Int J Cancer84(4)339-43.
Leach，D.R.，M.F.Krummel，et al.(1996).「Enhancement of antitumor immunity byCTLA-4 blockade.」Science271(5256)1734-6.
Ledbetter，J.A.，C.H.June，et al.(1986).「Valency of CD3binding and intemalization ofthe CD3 cell-surface complex control T cell responses to second signalsDistinction betweeneffects on protein kinase C，cyplasmic free calcium，and proliferation.」J.Immunol.1363945-3952.
Ledbetter，J.A.，G.Shu，et al.(1987).「Augmentation of normal and malignant B cellproliferation by monoclonal antibody to the B cell-specific antigen BP50(CDW40).」J Immunol138(3)788-94.
Levine，B.L.，W.B.Bemstein，et al.(1997).「Effects of CD28 costimulation on long-term proliferation of CD4+T cells in the absence of exogenous feeder cells.」J Immunol159(12)5921-30.
Linsley，P.S.and J.A.Ledbetter (1993).「The role of the CD28 receptor during T cellresponses to antigen.」Annu Rev Immunol11191-212.
Loh，E.Y.，J.F.Elliott，et al.(1989).「Polymerase chain reaction with single-sidedspecificityanalysis of T cell receptor delta chain.」Science243(4888)217-20.
Maeurer，M.J.，S.M.Gollin，et al.(1996).「Tumor escape from immune recognitionlethal recurrent melanoma in a patient associated with downregulation of the peptide transporterprotein TAP-1 and loss of expression of the immunodominant MART-1/Melan-A antigen.」JClin Invest98(7)1633-41.
Martin，P.J.，J.A.Ledbetter，et al.(1986).「A 44 kilodalton cell surface homodimerregulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes.」J Immunol136(9)3282-7.
Matter，B.，C.F.Zukoski，et al.(1970).「Transplanted carcinoma in animmunosuppressed patient.」Transplantation9(1)71-4.
Melero，I.，N.Bach，et al.(1998).「Amplification of tumorimmunity by gene transfer ofthe co-stimulatory 4-1BB ligandsynergy with the CD28 co-stimulatory pathway.」Eur JImmunol28(3)1116-21.
Melero，I.，J.V.Johnston，et al.(1998).「NK1.1 cells express 4-1BB(CDw137)costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonalantibodies」Cell Immunol190(2)167-72.
Melero，I.，W.W.Shuford，et al.(1997).「Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors.」Nat Med3(6)682-5.
Melief，C.J.and W.M.Kast (1995).「T-cell immunotherapy of tumors by adoptivetransfer of cytotoxic T lymphocytes and by vaccination with minimal essential epitopes.」Immunol Rev145167-77.
Miller，A.D.and G.J.Rosman (1989).「Improved retroviral vectors for gene transfer andexpression.」Blotechniques7(9)980-2，984-6，989-90.
Mizoguchi，H.，J.J.O′Shea，et al.(1992).「Alterations in signal transduction molecules inT lymphocytes from tumor-bearing mice[see comments].」Science258(5089)1795-8.
Mule′，J.，F.R.Jones，et al.(1979).「Selective localization of radiolabelled immunelymphocytes into syngeneic tumors.」J.Immunol.123600-606.
Nakagomi，H.，M.Petersson，et al.(1993).「Decreased expression of the signal-transducing z chains in tumor-infiltrating T cells and NK cells of patients with colorectalcarcinoma.」Cancer Res535610-5612.
Natoli，G.，A.Costanzo，et al.(1998).「Apoptotic，non-apoptotic，and anti-apoptoticpathways of tumor necrosis factor signalling.」Biochem Pharmacol56(8)915-20.
Nestle，F.O.，S.Alijagic，et al.(1998).「Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritic cells [see comments].」Nat Med4(3)328-32.
Old，L.J.and Y.-T.Chen (1998).「New paths in human cancer serology.」J.Exp.Med.1871163-1167.
Pardoll，D.M.(1996).「Cancer vaccinesa road map for the next decade.」Curr OpinImmunol8(5)619-21Ranga，U.，C.Woffendin，et al.(1998).「Enhanced T cell engraftment after retroviraldelivery of an antiviral gene in HIV-infected individuals.」Proc.Natl.Acad.Sci.951201-1206.
Rodolfo，M.，C.Zilocchi，et al.(1999).「IL-4-transduced tumor cell vaccine inducesimmunoregulatory type 2 CD8T lymphocytes that cure lung metastases upon adoptive transfer.」JImmunol163(4)1923-8.
Rosenberg，S.A.(1995).Cell transfer therapyclinical applications.Biologic Therapy ofCancer(Chapter 19).V.T.DeVita，S.Hellman and S.A.Rosenberg.Philadelphia，PA，J.P.Lippincott487.
Rosenberg，S.A.，J.C.Yang，et al.(1998).「Immunologic and therapeutic evaluation of asynthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma[seecomments].」Nat Med4(3)321-7.
Schoenberger，S.P.，L.E.Jonges，et al.(1998).「Efficient direct priming of tumor-specific cytotoxic T lymphocyte in vivo by an engineered APC.」Cancer Res58(14)3094-100.
Schwartz，R.H.(1989).「Acquisition of immunologic self-tolerance.」Cell57(7)1073-81.
Shiraki，K.，N.Tsuji，et al.(1997).「Expression of Fas ligand in liver metastases ofhuman colonic adenocarcinomas.」Proc Natl Acad Sci USA94(12)6420-5.
Shuford，W.W.，K.Klussman，et al.(1997).「4-1BB costimulatory signals preferentiallyinduce CD8+T cell proliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cellresponses.」J Exp Med186(1)47-55.
Sulitzeanu，D.(1993).「Immunosuppressive factors in human cancer.」Adv Cancer Res60247-267.
Takahashi，C.，R.S.Mittler，et al.(1999).「Cutting edge4-1BB is a bona fide CD8 T cellsurvival signal.」J Immunol162(9)5037-40.
Thompson，C.B.，T.Lindsten，et al.(1989).「CD28 activation pathway regulates theproduction of multiple T-cell-derived lymphokines/cytokines.」Proc Natl Acad Sci U S A86(4)1333-7.
Tsushima，H.，Y.Imaizumi，et al.(1999).「Fas antigen (CD95)in pure erythroid cell lineAS-E2 is induced by interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha and potentiates apoptoticdeath.」Exp Hematol27(3)433-40.
Walunas，T.L.，C.Y.Bakker，et al.(1996).「CTLA-4 ligation blocks CD28-dependent Tcell activation.」J Exp Med183(6)2541-50.
Walunas，T.L.，D.J.Lenschow，et al.(1994).「CTLA-4can function as a negativeregulator of T cell activation.」Immunity1(5)405-13.
Ward，P.I.，H.Koeppen，et al.(1989).「Tumor antigens defined by clonedimmunological probes are highly polymorphic and are not detected on autologous normal cells.」J.Exp.Med.170(217-232).
Wilbanks，G.A.，M.Mammolenti，et al.(1992).「Studies on the induction of anteriorchamber-associated immune deviation (ACAID).III.Induction of ACAID depends uponintraocular transforming growth factor-beta.」Eur J Immunol22(1)165-73.
Wilson，R.E.，E.B.Hager，et al.(1968).「Immunologic rejection of human cancertransplanted with a renal allograft.」N Engl J Med278(9)479-83.
Winberg，G.，L.S.Grosmaire，et al.(1996).「Surface expression of CD28 single chain Fvfor costimulation by tumor cells.」Immunol Rev153(209).
Yang，G.，K.E.Hellstrm，et al.(1995).「Antitumor immunity elicited by tumor cellstransfected with B7-2，a second ligand for CD28/CTLA-4 costimulatory molecules.」J Immunol154(6)2794-800.
Yang，G.，M.T.Mizuno，et al.(1997).「B7-negative versus B7-positive P815 tumordifferential requirements for priming of an antitumor immune response in lymph nodes.」JImmunol158(2)851-8.
***
此處引用和提及的所有專利，出版物，科技文章，網站和其他參考文獻和資料，都是本發明所屬領域技術人員水平的體現，均各自完整引用作為參考。申請者保留將任意或所有來自任何這項專利，出版物，科技文章，網頁，可用的電子信息，和其他參考材料或文獻的全部添加到這份專利說明書的權利。
此處所描述的特異方法和組合物代表優選的實施方案，是示例性的，其目的不在於對本發明的範圍進行限制。在本發明的基礎上聯想到的其他方面和實施方案也包含在本發明的權利要求書所限定的範圍內。對於本領域技術人員，在不背離本發明的範圍和主旨的前提下，對其做各種替代和修正，是非常顯而易見的。在此作為例證說明的這項發明，如果缺乏任何組成部分或者多個組成部分，限度或多個限度，在此未作特意說明時，仍然可以實施。因此，在本說明的任何情況中，例如本發明的實施例或實施方案中，任何術語「包含」，「基本由…組成」，「包括」和「由…組成」都可以被說明書中任何另外兩個術語替代。同時，「包含」，「包括」，「含有」等等術語可以延展含義並不受限制。在此描述說明的方法和步驟以不同的步驟順序呈現時仍然成立，並不限於此處或權利要求中指定的步驟順序。在任何情況下，都不可將本專利限定在實施例和實施方案公開的範圍內。本專利絕不可以解釋為受任何檢查者或任何其他的官方以及專利和商標辦公室職員制訂的報告書的限制，除非這種報告書是特殊的，並未加限制或申請者書面反應明確採用保留。
採用的術語和表達是用來解釋說明的術語，並不是對本發明的限制，並沒有通過使用這樣的術語和表達法來排除任何同義表達此處顯示特徵和描述或某一部分的意圖，但是應該意識到各種變化可能在本發明要求保護的範圍之內。因此，可以理解，儘管現在的發明通過優選的實施方案和可選擇的特徵公開，但是本領域技術人員可以對此作出變化和調整，這種修飾和變化在本發明從屬權利要求定義的範圍中。
本發明在此進行了廣泛地、一般性的描述。落入一般公開範圍的更窄的種類和亞屬也構成本發明的一部分。一般性公布中的每個限定種類和亞一般性分組也構成了本發明的部分。這包括對發明的一般性描述，附帶限制性條款或否定限制是去除任何物質，而不考慮去除的材料是否在此進行了特別描述。
其他的實施方案都包括在下列權利要求當中。另外，本發明的特點或方面以馬庫什(Markush)基團的方式描述，本領域技術人員應該意識到本發明也可通過馬庫什基團的成員或成員亞組的方式進行描述。
序列表110LEDBETTER，JEFFREYHAYDEN-LEDBETTER，MARTHAHELLSTROM，INGEGERDHELLSTROM，KARL ERIK120識別CD3或4-1BB的抗體或基因介導的腫瘤反應性淋巴細胞活化130034474.000414010/107,9911412002-04-2615060/286,5851512001-04-261605170專利版本2.121012111687212DNA213人工序列220
223人工序列描述小鼠-人雜交基因220
221CDS222(7)(1671)220
221信號肽222(7)(75)223編碼兩側連接有Hind III和SalI酶切位點的L6 Vκ前導肽220
221V_區222(76)(406)223編碼Gl9-4小鼠抗人CD3 VL結構域220
221misc_特徵222(406).(451)223編碼(Gly4Ser)3接頭220
221V_區222(451).(816)223G19-4小鼠抗人CD3 VH結構域220
221misc_特徵222(816)(1521)223編碼人IgG1 Fc結構域(鉸鏈區，CH2，CH3)
220
221misc_特徵222(1521)..(1687)223編碼人CD80跨膜和細胞質結構域和連接的限制性酶切位點4001aagctt atg gat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt 48Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser1 5 10gct tca gtc ata atg tcc aga gga gtc gac atc cag atg aca cag act96Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr15 20 25 30aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc144Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys35 40 45agg gca agt cag gac att cgc aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa192Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac240Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His65 70 75tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat288Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr80 85 90tct ctc acc att gcc aac ctg caa cca gaa gat att gcc act tac ttt336Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe95 100 105 110tgc caa cag ggt aat acg ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa384Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125ctg gta acc aaa cgg gag ctc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg432Leu Val Thr Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly130 135 140tcg ggt ggc ggc gga tct atc gat gag gtc cag ctg caa cag tct gga480Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly145 150 155cct gaa ctg gtg aag cct gga gct tca atg tcc tgc aag gcc tct ggt528Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly160 165 170tac tca ttc act ggc tac atc gtg aac tgg ctg aag cag agc cat gga576Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly175 180 185 190
aag aac ctt gag tgg att gga ctt att aat cca tac aaa ggt ctt act624Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr195 200 205acc tac aac cag aaa ttc aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag672Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys210 215 220tca tcc agc aca gcc tac atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gaa gac720Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr ser Glu Asp225 230 235tct gca gtc tat tac tgt gca aga tct ggg tac tat ggt gac tcg gac768Ser Ala Val Tyr TyL Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp240 245 250tgg tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tct816Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser255 260 265 270gat ctg gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca agc cca ccg agc864Asp Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser275 280 285cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca912Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro290 295 300aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc960Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys305 310 315gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg1008Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp320 325 330tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag1056Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu335 340 345 350gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg1104Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu355 360 365cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac1152His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn370 375 380aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg1200Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly385 390 395cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag1248Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu400 405 410
ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat1296Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr415 420 425 430ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac1344Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn435 440 445aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc1392Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe450 455 460ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac1440Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn465 470 475gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg1488Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr480 485 490cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa gcg gat cct tcg aac ctg1536Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu495 500 505 510ctc cca tcc tgg gcc att acc tta atc tca gta aat gga att ttt gtg1584Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val515 520 525ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt gcc cca aga tgc aga gag aga agg1632Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg530 535 540agg aat gag aga ttg aga agg gaa agt gta cgc cct gta taaatcgata 1681Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555ctcgag 168721022111696212DNA213人工序列220
223人工序列描述小鼠-人雜交基因220
221CDS222(13)..(1680)220
221信號肽222(13)..(71)223編碼5B9小鼠抗人4-1BB VL前導肽序列
220
221V_區222(72)..(412)223編碼5B9小鼠抗人4-1BB VL結構域220
221misc_特徵222(413)..(459)223編碼(Gly4Ser)3接頭多肽220
221V_區222(460)..(826)223編碼5B9小鼠抗人4-1BB VII結構域220
221misc_特徵222(827)..(1527)223編碼人IgG1 Fc結構域(鉸鏈區，CH2，CH3)220
221misc_特徵222(1528)..(1696)223編碼帶有限制性位點的人CD80跨膜和細胞質結構域4002aagcttgccg cc atg agg ttc tct gct cag ctt ctg ggg ctg ctt gtg ctc 51Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu1 5 10tgg atc cct gga tcc act gca gat att gtg atg acg cag gct gca ttc99Trp Ile Pro Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe15 20 25tcc aat cca gtc act ctt gga aca tca gct tcc atc tcc tgc agg tct147Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser30 35 40 45agt aag agt ctc cta cat agt aat ggc atc act tat ttg tat tgg tat195Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr50 55 60ctg cag aag cca ggc cag tct cct cag ctc ctg att tat cag atg tcc243Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser65 70 75aac ctt gcc tca gga gtc cca gac agg ttc agt agc agt ggg tca gga291Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly80 85 90act gat ttc aca ctg aga atc agc aga gtg gag gct gag gat gtg ggt339Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly95 100 105gtt tat tac tgt gct caa aat cta gaa ctt ccg ctc acg ttc ggt gct387Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala110 115 120 125
ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt435Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggg tcg ggt ggc ggc gga tcg tca cag gtg cag ctg aag cag tca gga483Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly145 150 155cct ggc cta gtg cag tcc tca cag agc ctg tcc atc acc tgc aca gtc531Pro Gly Leu Val Gln Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val160 165 170tct ggt ttc tca tta act acc tat gct gta cac tgg gtt cgc cag tct579Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser175 180 185cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg gga gtg ata tgg agt ggt gga atc627Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ile190 195 200 205aca gac tat aat gca gct ttc ata tcc aga ctg agc atc acc aag gac675Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp210 215 220gat tcc aag agc caa gtt ttc ttt aaa atg aac agt ctg caa cct aat723Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn225 230 235gac aca gcc att tat tac tgt gcc aga aat ggg ggt gat aac tac cct771Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Gly Asp Asn Tyr Pro240 245 250tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc819Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val255 260 265tcc tct gat ctg gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca agc cca867Ser Ser Asp Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro270 275 280 285ccg agc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtc ttc ctc ttc915Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe290 295 300ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc963Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val305 310 315aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc1011Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe320 325 330aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg1059Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro335 340 345
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc1107Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr350 355 360 365gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1155Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val370 375 380tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc1203Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala385 390 395aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg1251Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg400 405 410gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc1299Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly415 420 425ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg1347Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro430 435 440 445gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc1395Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser450 455 460ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag1443Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln465 470 475ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac1491Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His480 485 490tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa gcg gat cct tcg1539Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser495 500 505aac ctg ctc cca tcc tgg gcc att acc tta atc tca gta aat gga att1587Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile510 515 520 525ttt gtg ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt gcc cca aga tgc aga gag1635Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu530 535 540aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa agt gta cgc cct gta1680Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555taaatcgata ctcgag 16962103211555
212PRT213人工序列220
223人工序列描述小鼠-人融合蛋白220
221信號222(1)..(23)223L6 Vκ信號肽220
221結構域222(24)..(133)223G19-4小鼠抗人CD3輕鏈可變區220
221多肽222(134)..(148)223(Gly4Scr)3接頭多肽220
221結構域222(149)..(270)223G19-4小鼠抗人VH結構域220
221MISC_FEATURE222(271)..(504)223人IgG1 Fc結構域(鉸鏈區，CH2，CH3)220
221跨膜222(505)..(555)223人CD80跨膜結構域和細胞質尾4003Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser20 25 30Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala35 40 45Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp50 55 60Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly65 70 75 80Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu85 90 95Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln100 105 110
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val115 120 125Thr Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Ile Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu145 150 155 160Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser165 170 175Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn180 185 190Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr195 200 205Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser210 215 220Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala225 230 235 240Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr245 250 255Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Asp Leu260 265 270Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala275 280 285Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro290 295 300Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val305 310 315 320Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val325 330 335Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln340 345 350Tyr Asn Ser Tnr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln355 360 365Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala370 375 380Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro385 390 395 400Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser420 425 430Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr435 440 445Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr450 455 460Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe465 470 475 480Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys485 490 495Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu Leu Pro500 505 510Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys515 520 525Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn530 535 540Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 5552104211556212PRT213人工序列220
223人工序列描述小鼠-人融合蛋白220
221信號222(1)..(20)2235B9小鼠抗人4-1BB Vκ信號肽220
221結構域222(21)..(133)2235B9小鼠抗人4-1BB VL結構域220
221多肽222(134)..(149)223(Gly4Ser)3接頭多肽220
221結構域222(150)..(271)2235B9小鼠抗人4-1BB VH結構域220
221MISC FEATURE
222(272)..(505)223人IgG1 Fc結構域(鉸鏈區.CH2，CH3)220
221跨膜222(506)..(555)223人CD80跨膜和細胞質結構域4004Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro20 25 30Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser35 40 45Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Sei Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu145 150 155 160Val Gln Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe165 170 175Ser Leu Thr Thr Tyr Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys180 185 190Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ile Thr Asp Tyr195 200 205Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asp Ser Lys210 215 220Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala225 230 235 240Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Gly Asp Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr245 250 255
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp260 265 270Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro275 280 285Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys290 295 300Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val305 310 315 320Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr325 330 335Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu340 345 350Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His355 360 365Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys370 375 380Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln385 390 395 400Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu405 410 415Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro420 425 430Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn435 440 445Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu450 455 460Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val465 470 475 480Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln485 490 495Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu Leu500 505 510Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile515 520 525Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg530 535 540Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555
210521155212DNA213人工序列220
223人工序列的描述；引物4005cgtcgatgag ctctagaatt cgcatgtgca agtccgatga gtcccccccc ccccc5權利要求
1.產生腫瘤反應性T淋巴細胞的培養體系，其包括來自癌症患者的T細胞、抗原遞呈細胞、自體或同種異體的腫瘤細胞和誘導多克隆活化的T細胞受體的固相化抗體。
2.權利要求1的培養體系，其中所述抗原遞呈細胞是自體的單核細胞，其對所述T細胞產生應答而分化。
3.權利要求1的培養體系，其中所述自體的或同種異體的腫瘤細胞被轉染來表達至少一種基因，所述基因編碼刺激直接或間接T細胞應答的分子。
4.權利要求1的培養體系，其中所述固相化抗體與CD3和CD28受體相結合。
5.一種組合物，其包括編碼能在細胞表面表達的抗-CD3scFv的多核苷酸。
6.權利要求5的組合物，其中所述多核苷酸編碼G19-4scFv。
7.一種組合物，其包括編碼能在細胞表面表達的抗人4-1BB scFv的多核苷酸。
8.權利要求7的組合物，其中所述多核苷酸編碼5B9 scFv。
9.一種組合物，其包括由編碼能在細胞表面表達的抗CD3 scFv的基因所轉染的自體或同種異體腫瘤細胞。
10.權利要求9的組合物，其中所述的自體或同種異體腫瘤細胞被G19-4 scFv轉染，所述G19-4 scFv能在細胞表面表達。
11.一種組合物，其包括由編碼能在細胞表面表達的抗4-1BBscFv的基因所轉染的自體或同種異體腫瘤細胞。
12.權利要求11的組合物，其中所述自體或同種異體腫瘤細胞被5B9 scFv轉染，所述5B9 scFv能在細胞表面表達。
13.治療癌症患者的方法，其包括給患者施用腫瘤細胞，所述腫瘤細胞被轉染能在細胞表面表達抗-CD3 scFv。
14.權利要求13的方法，其中所述腫瘤細胞表達G19-4。
15.治療癌症患者的方法，其包括給患者施用腫瘤細胞，所述腫瘤細胞被轉染能在細胞表面表達抗-4-1BB scFv。
16.權利要求15的方法，其中所述腫瘤細胞表達5B9。
17.治療癌症患者的方法，其包括給患者施用質粒，所述質粒包含能在細胞表面表達抗-CD3 scFv的序列。
18.權利要求17的方法，其中所述質粒編碼G19-4 scFv。
19.治療癌症患者的方法，其包括給患者施用質粒，所述質粒包含能在細胞表面表達抗4-1BB的序列。
20.權利要求19的方法，其中所述質粒編碼5B7 scFv。
21.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細胞表面表達抗-CD3 scFv的序列。
22.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細胞表面表達G19-4scFv的序列。
23.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細胞表面表達抗-4-1BB的序列。
24.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細胞表面表達5B9scFv的序列。
全文摘要
本發明提供了一種體外產生腫瘤反應性T淋巴細胞的改良方法，其包括，例如，將來自癌症患者的PBMC與自體腫瘤細胞和磁珠共同培養，所述磁珠能通過CD3與CD28、CD40或CD28加CD40的組合來活化T細胞。本發明還提供了編碼抗－CD3或抗－41BB scFv的基因以及轉染正常或過度增殖細胞以在其表面表達所述基因的方法。基因和轉染的腫瘤細胞是有用的誘導腫瘤破壞性免疫應答的組合物。
文檔編號C12N15/86GK1894413SQ03812095
公開日2007年1月10日 申請日期2003年3月26日 優先權日2003年3月26日
發明者J·A·萊德貝特, I·赫爾斯特倫, M·海登-萊德貝特, K·E·赫爾斯特倫 申請人:特魯比昂藥品公司