一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法
2023-10-04 19:59:19 4
專利名稱：一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術應用以及新材料、化工產品生產技術領域，尤其涉及一種用生物法從蠶蛹、蠅蛆以及其它昆蟲的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，具體地說，是應用以多種微生物酶共酶解和固定化全細胞生物反應器生物轉化從昆蟲皮殼原料中製取甲殼素和/或殼聚糖。
背景技術：
甲殼素又名甲殼質，學名幾丁質(chitin)，是一種直鏈天然氨基多糖，也是目前發現的唯一帶有正電荷的可食性動物纖維。甲殼素在自然界的儲量僅次於纖維素，每年生物圈的生物合成量約有100億噸，是地球上第二大生物資源。作為結構物質，甲殼素主要分布於真菌、原生生物和無脊椎動物，在高等動物則主要分布於關節、蹄、足等以及肌肉與骨的接合處。長期以來，由於甲殼素不溶於水、稀酸、稀鹼和大多數有機溶劑的惰性特點，一直沒有受到應有重視。但近幾十年來，隨著生命科學和生物技術的巨大進步，甲殼素的理化特性、生物活性和功能特點逐漸被人們所認識，特別是甲殼素及其衍生物作為一種新型原料和材料在製藥、組織工程、精細化工、材料與紡織工業、食品工業、農業以及環境保護諸多方面的應用價值，正在被快速地展現出來，受到人們的廣泛關注，其產業化的深度和廣度正在蓬勃推進，而其對人體和環境有益無害的「綠色原料」特性，更是符合時代潮流，得到了人們的青睞，展示了非常美好的市場前景。
雖然甲殼素是一種優良的生物原料，但其作為和蛋白質以及某些無機物緊密結合的生物結構成分，提取並不容易。目前全球範圍內用於製取甲殼素、殼聚糖(甲殼素脫乙醯基後的產物，可大大增加溶解度)及其衍生物的主流工藝是化學法，其製備過程中使用大量的酸鹼和有害的化學試劑，產生大量的廢水廢料，嚴重汙染環境特別是水體環境；高頻度、長時間的高溫處理過程帶來了巨大的能源消耗；頻繁的洗滌淨化程序和稀酸、稀鹼的回收處理難度又導致寶貴的清潔淡水被大量消耗浪費；凡此種種，為這一「綠色原料」的可持續開發生產和深一步的產業化應用蒙上了重重的陰影。正因如此，近年來，人們開始將目光轉向了生物方法，目前主要是生物發酵的方法，即通過對主要原料絲狀真菌的發酵，獲得足量的菌絲體，再以菌絲體為原料，採用微生物酶和化學法相結合的方法提取甲殼素和殼聚糖。該方法條件溫和，可減少人力、物力和能耗，質量易控，也能大幅度地減輕環境汙染，但由於微生物體內甲殼素含量遠不及節肢動物(尤其是目前大量使用的甲殼綱和昆蟲綱動物)以及真菌發酵時間漫長等原因，生物發酵法生產甲殼素/殼聚糖在產量和效率上還不夠理想，其生產成本過高，真正實現工業化生產還要假以時日。
目前製取甲殼素最常用的原料是工業廢棄的蝦、蟹殼，其化學組成為40％無機物，主要是CaCO3；30％有機物，主要是蛋白質；甲殼素含量約佔20-25％。因此，根據蝦、蟹殼化學組成特點採用的提取工藝路線是淨化處理-濃酸脫鈣-稀鹼脫蛋白-氧化劑脫色(非必需)-濃鹼脫乙醯基-殼聚糖。該工藝的缺點已如前述，而且，其原料來源還存在產地和運輸成本的限制。另一類主要原料是絲狀真菌菌絲體，如發酵工業產生的菌絲體廢渣，甲殼素含量可達20-22％。其提取工藝的優點和局限性亦如前述。並且，生物發酵法目前只是獲得原料，後續製取甲殼素和殼聚糖，仍主要採用化學法，故仍然存在環境汙染問題。
近年來，多種昆蟲綱動物皮殼中含有豐富甲殼素的事實，引起人們的極大關注。研究證實，家蠶蛹皮中所含甲殼素高達33％-44％，而幹蛆皮所含甲殼素更高達35％-54.8％，而且此類昆蟲皮殼中幾乎不含鈣質等無機物，有利於甲殼素的分離提取，是頗為理想的甲殼素生產原料。然而，儘管蠶蛹和蠅蛆皮殼具有上述優點，但近期的實踐表明，用化學法從蠶蛹和蠅蛆製取甲殼素存在困難，主要表現為皮殼中脂肪太多，色素太多，脫乙醯基困難，因而生產出的甲殼素產品質量不高。此外，由於提取工藝中增加了化學脫脂步驟，強化了脫色和脫乙醯基的物理/化學處理力度，產生了更大的廢液、廢料汙染和更多的能耗。
因此，如何改進工藝，使之能夠利用昆蟲皮殼開發出高質量的甲殼素及相關產品，同時又能有效控制能耗和環境汙染，是甲殼素研發和生產人員面臨的巨大挑戰。
發明內容
本發明的目的在於應用發酵工程和酶工程的技術手段，結合部分物理和化學方法，設計並實施了一套以生物法為主的甲殼素/殼聚糖製取方法，用以從蠶蛹、蠅蛆及其它昆蟲皮殼中獲得甲殼素和殼聚糖，旨在克服傳統工藝的上述弊端，在明顯提高產品質量和生產效率的前提下，降低能耗，大幅減少酸、鹼、氧化劑和其它有害化學品的使用量以及廢液、廢渣的排放，消除其對環境的汙染和人體健康的威脅，並能夠同時生產出附加值高的副產品，綜合利用資源，提高生產效益，從而提供一種增效節耗、環境友好、資源節約的綠色製取工藝，達到有效、可持續地促進甲殼素產業發展的目的。
本發明還涉及將提取的甲殼素/殼聚糖，用生物學和/或化學方法進一步加工成特種殼聚糖或殼聚糖衍生物。
實現本發明目的的技術方案如下一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，包括以下步驟將蠶蛹、蠅蛆的皮殼通過幹法或溼法破碎細粉化處理；將得到的細粉體經來自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液進行共酶解反應，充分脫除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白質；用兩步法脫色，即先以H2O2初步脫色，再用富含過氧化氫合成-還原酶系的粗酶液進行酶法脫色並還原H2O2；收集脫色後物料，洗滌、乾燥後製成甲殼素產品；通過米根黴全細胞固定化生物反應器進行循環脫乙醯反應，得到不同DD值的殼聚糖。還可進一步應用化學方法或者生物方法，將所得的甲殼素或殼聚糖製備成特種殼聚糖或改性殼聚糖。
所述細粉化處理，是指將鮮蠶蛹或鮮蠅蛆，清洗除雜、充分瀝水後先行機械破皮處理，用諸如液壓式或螺旋式壓榨機的壓榨法擠出內容物(所述內容物另行處理)，收集皮殼，烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍6小時，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體；如為幹蛹或幹蛆，則淨化後直接預凍、粉碎處理成細粉體。
所述微生物粗酶液，是指用不同出發菌株誘導馴化而得的高產脂肪酶活的產朊假絲酵母(保藏號CCTCC NO.M207053)，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年4月24日，分類命名為產朊假絲酵母ODK-CC1(Candida utilis ODK-CC1)；高產蛋白酶活的枯草芽孢桿菌(保藏號CCTCC NO.M207028)，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名枯草芽孢桿菌ODK-BK1(BacillussubtilisODK-BK1)；高產H2O2及其氧化-還原酶系的採絨革蓋菌(又名雲芝)(保藏號CCTCC NO.M207024)，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名雲芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)，分別經好氧液體深層發酵後，去除菌體而得到的胞外酶粗酶液。
所述共酶解反應，是指將所獲細粉體以固∶液＝1∶5的配比量，先用65℃溫水浸泡30min，抑制雜菌及無關酶活，再加入與溫水容積等量的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液，在40℃恆溫下，於反應釜內將皮殼粉混懸液和粗酶液緩慢混合，充分攪拌，進行共酶解脫脂脫蛋白反應，反應時間18h，反應終止後以2500r/min離心進行固、液分離，溶於反應液中的蛋白和脂肪及其分解產物另法提取收集。
所述兩步法脫色，是指先將酶解反應後的固體物料，加入少量稀鹼(10％NaOH)浸泡、煎煮2h，更換鹼液後重複，共3次，以徹底脫除少量殘餘脂肪和蛋白質以及殘餘酶活，過濾收集濾渣，水洗3遍後，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的粗酶液進行酶解反應，脫除原料中難解離色素並陸續將H2O2轉化為無毒無害的CO2和H2O，反應溫度40℃，反應時間18h，反應畢離心(2500r/min)，將沉澱洗滌、乾燥，得白色粉末狀甲殼素。
所述脫乙醯反應，是指將所得甲殼素用40℃溫水懸浮、充分混勻後，循環流加於米根黴(保藏號CCTCC NO.M207054)，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年4月24日，分類命名米根黴ODK-RM1(Rhizopus oryzae ODK-RM1)，全細胞固定化反應器中，進行脫乙醯基反應，根據產品和用途對脫乙醯度的要求，用電位滴定法動態檢測反應產物的DD值(脫乙醯度)，直至達到所要求的DD值標準，終止反應，收集反應產物，按1/3容積濃縮後，真空或冷凍乾燥，得殼聚糖。
所述製備特種殼聚糖，本發明採用生物法，即用產酸細菌進行液體深層發酵殼聚糖，獲得具有高度水溶性的甲殼寡糖。
所述製備改性殼聚糖，本發明採用化學法，即將甲殼素加工為鹼性甲殼素膠體溶液後，分別用環氧乙烷、氯乙酸或丙烯腈處理，可分別生成羥乙基甲殼素、羧甲基甲殼素或氰乙基甲殼素。
本發明的方法也適用於其它昆蟲皮殼甲殼素的製取，如蟬蛻、蜚蠊、撣子蟲等。
本發明的有益效果本發明利用蛹皮、蛆皮生產甲殼素，有助於治理環境，資源化利用，變廢為寶，並帶動蠶蛹和蠅蛆的深加工產業；本發明選用蠶蛹和蠅蛆皮殼製取甲殼素，除其含量高以外，還在於蛹皮甲殼素主要為α-型甲殼素，具有優良的穩定性，對於甲殼素的工業化應用非常重要；而蠅蛆殼聚糖在低重金屬離子含量、低灰分含量方面明顯優於蝦、蟹殼殼聚糖，兩者均為優良的甲殼素製取原料；本發明採用了以酶法為主的脫除脂肪、蛋白和色素工藝，由於酶反應的高選擇性，可以有效地克服昆蟲皮殼中的高脂肪、高色素對甲殼素提取造成的困難，明顯提高甲殼素的得率和質量；本發明大大減少了酸、鹼和有機溶劑在製取工藝中的應用，而代之以溫和的微生物酶法作為核心工藝，不僅基本消除了強酸、強鹼、有害溶劑廢水和廢渣排放造成的環境汙染，減少了相關設備和試劑成本，而且基本杜絕了強烈化學反應導致的質量問題以及產品中化學溶劑的殘留帶來的潛在健康威脅；本發明採用全細胞固定化生物反應器循環酶解反應脫乙醯基新工藝，不僅過程簡單、沒有汙染，而且可以準確掌握脫乙醯度，按產品和用途需要生產不同DD值的殼聚糖，有益於產品的質量控制以及種類、用途的多元化；本發明的又一突出優點是大部分的工作單元在常溫、中溫下進行，大幅減少了熱能需要，降低了能耗；此外，化學品用量的減少也相應減少了水的用量和廢水排放，節約了用水；本發明的另一個有益效果是能夠充分進行資源綜合開發，得到一系列附加值高的副產物，提高綜合經濟效益，包括1)通過脂肪酶的解離，可以獲得純度高的蠶蛹油脂，因其雜質少，可進行充分開發利用，如精製蠶蛹油、提取脂肪酸、製備表面活性劑和聚醯胺纖維(尼龍)、製造潤滑油和肥皂等。
2)通過蛋白酶的解離，可以獲得純度高的蠶蛹或蠅蛆蛋白，可製備食用或飼用蛋白質、製取蛹酪素、製備蛋白水解物和胺基酸製品等。
3)在用發酵法製備粗酶液時，可獲得高生物量的有益微生物菌體，其中雲芝(採絨革蓋菌)、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母均為極度安全的可食用微生物，可直接用作食用或飼用微生物菌劑或微生態製劑，也可製成相關產品。
圖1表示蛹殼細粉體共酶解前後脂肪含量和蛋白質含量比較；圖2表示蠅殼細粉體共酶解前後脂肪含量和蛋白質含量比較；圖3表示固定化細胞流程；圖4表示上流式米根黴全細胞固定化生物反應器脫乙醯流程示意圖。
具體實施例方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
為了有效實現本發明的方法，發明人進行了如下工作1.確定發酵產朊假絲酵母製取脂肪酶粗酶液工藝產朊假絲酵母出發菌株分離自釀酒酒糟，由本發明人反覆誘導馴化為高產脂肪酶活菌株後，送武漢中國典型培養物保藏中心保藏(保藏號CCTCC NO.M207053)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年4月24日，分類命名為產朊假絲酵母ODK-CC1(Candida utilisODK-CC1)。
粗酶液製備過程產朊假絲酵母接種於PDA斜面培養基恢復培養(復壯)5天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，25℃，100r/min恆溫振蕩培養3天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6LPDA液體培養基的10L不鏽鋼氣升式發酵罐中，25℃，100r/min好氧深層液體培養約5天，測得脂肪酶活達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏，待用於本工藝的共酶解步驟。
2.確定發酵枯草桿菌製取蛋白酶粗酶液工藝枯草桿菌出發菌株分離自日本產有機小粒納豆，由本發明人反覆誘導馴化為高產蛋白酶活菌株後，保藏編號CCTCC NO.M207028，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名枯草芽孢桿菌ODK-BK1(BacillussubtilisODK-BK1)。
粗酶液製備過程枯草桿菌菌株接種於普通固體培養基恢復培養(復壯)2天，轉種於裝有300ml的去瓊脂液體培養基的500ml三角燒瓶中，25℃，100r/min恆溫振蕩培養3天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體培養基的10L不鏽鋼氣升式發酵罐中，25℃，100r/min好氧深層液體培養約3天，測得脂肪酶活達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏，待用於本工藝的共酶解步驟。
3.確定發酵採絨革蓋菌製取過氧化氫合成酶-還原酶粗酶液工藝採絨革蓋菌(雲芝)出發菌株購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心(菌株編號GIM5.178)，由本發明人反覆馴化誘導為H2O2氧化-還原酶系高產菌株後，保藏編號CCTCC NO.M207024，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名雲芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)。
粗酶液製備過程雲芝菌株接種於PDA斜面培養基恢復培養(復壯)7天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，28℃，150r/min恆溫振蕩培養5天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體PDA培養基的不鏽鋼氣升式發酵罐中，30℃，100r/min好氧深層液體培養約7天，測多酚過氧化物酶活達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏，待用於本工藝的脫色步驟。
4.考察粗酶液共酶解反應的效果1)粗酶液共酶解去除蛹殼及蠅殼脂肪和蛋白質成分的效果①單因素分析比較共酶解前後蛹殼和蠅殼細粉體的脂肪含量(索氏抽提法測定)，見表1。
表1 共酶解前後脂肪含量變化比較
②單因素分析比較共酶解前後蛹殼和蠅殼細粉體的蛋白質含量(凱氏定氮法測定)，見表2。
表2 共酶解前後蛋白質含量變化比較
2)化學法和生物法對蠶蛹皮殼難解離色素脫色效果比較將H2O2氧化-還原酶系(生物法)蛹殼脫色素效果與高錳酸鉀-亞硫酸氫鈉(化學法)的蛹殼脫色素效果進行比較，結果見表3。
表3 高錳酸鉀-亞硫酸氫鈉和H2O2氧化-還原酶系脫色素效果比較
5.米根黴發酵、固定化反應器製備及甲殼素脫乙醯反應1)確定米根黴發酵產酶工藝條件白色米根黴出發菌株購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心(菌株編號3038)，由本發明人反覆馴化誘導為甲殼素脫乙醯酶高產菌株後，保藏編號CCTCC NO.M207054，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年4月24日，分類命名米根黴ODK-RM1(Rhizopus oryzae ODK-RM1)。
米根黴細胞增殖過程白色米根黴接種於PDA斜面培養基恢復培養(復壯)7天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，25℃，120r/min恆溫振蕩培養5天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體PDA培養基的不鏽鋼氣升式發酵罐中，28℃，100r/min好氧深層液體培養約5d，測甲殼素脫乙醯酶酶活達定值時，終止發酵，用管式菌體離心機收集菌體，加保護劑後凍幹製成菌粉。
2)製備全細胞固定化生物反應器①全細胞固定化將2％海藻酸鈉溶液與上述幹菌粉按液∶固＝5∶1的比例充分混合，得混懸液約3L，室溫下以10ml/min的速度，通過針泵滴入0.2mol/Lde CaCL中，形成直徑約5.0-5.5mm的小珠，全部混懸液滴注完畢後，將形成的小珠裝入反應器裝置。
②上流式生物反應器製作製作圓柱狀不鏽鋼上流式反應器主體，內徑50.8cm×高度584cm，工作容積10L；輔以底物流入、產物流出、菌培養基流加及惰性氣體加壓等功能通道。
3)脫乙醯反應及效果評定本發明工藝路線所得甲殼素，用40℃溫水懸浮、充分混勻後，從底物入口緩慢流加於米根黴全細胞固定化反應器中，進行脫乙醯基反應，產物出口收集反應液後，由閉路通道循環回流到反應器，每一循環周期約60min。轉化反應期間如反應液黏度偏大，用惰性氣體加壓洗脫產物。反應終止的時間點依對產物脫乙醯度的要求以及反應器酶活強度而定。反應循環次數對脫乙醯度的影響見表4。
表4 固定化細胞脫乙醯反應循環次數對產物脫乙醯度的影響
實施例1蠶蛹甲殼素的製備a.預處理收集鮮家蠶蛹10kg，清洗除雜、充分瀝水後用絞肉機機械破皮處理，用壓榨法(液壓式或螺旋式壓榨機)擠出內容物(另行處理)，收集皮殼，烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍6h，結塊後，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體。
b.所獲細粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔淨溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，在40℃恆溫下，於反應釜內將皮殼細粉體和粗酶液緩慢混合，進行共酶解脫脂脫蛋白反應，反應時間18h，將大部分脂肪、蛋白質溶解於反應液中，反應終止後離心(2500r/min)進行固、液分離，溶於反應液中的蛋白和脂肪產物另法提取。
c.收集酶解反應後的固體物料，加入少量稀鹼(10％NaOH)浸泡、煎煮2h，更換鹼液後按相同時間重複煎煮過程，共3次，徹底脫除少量殘餘脂肪和蛋白質，過濾，濾液另行處理。
d.濾渣水洗3遍後，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的採絨革蓋菌去菌體粗酶液進行酶反應，脫除原料中難解離的色素並陸續將H2O2轉化為無毒無害的CO2和H2O，反應溫度40℃，反應時間18h，反應畢離心(2500r/min)，將沉澱洗滌、乾燥，得白色粉末狀甲殼素。
實施例2蠅蛆殼聚糖的製備a.預處理收集鮮蠅蛆10kg，清洗除雜、充分瀝水後用絞肉機機械破皮處理，用壓榨法(液壓式或螺旋式壓榨機)擠出內容物(另行處理)，收集皮殼，烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍6h，板結後，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體。
b.所獲細粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔淨溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，在40℃恆溫下，於反應釜內將皮殼細粉體和粗酶液緩慢混合，進行共酶解脫脂脫蛋白反應，反應時間18h，將大部分脂肪、蛋白質溶解於反應液中，反應終止後離心(2500r/min)進行固、液分離，溶於反應液中的蛋白和脂肪產物另法提取。
c.收集固體物料，40℃溫水洗3遍，瀝乾，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的採絨革蓋菌去菌體粗酶液進行酶法脫色，反應溫度40℃，反應時間18h，反應畢進行離心(2500r/min)，將沉澱洗滌、乾燥，得白色粉末狀甲殼素。
d.將洗滌後的沉澱物按固∶液＝1∶4的配比量、或已乾燥的甲殼素按固∶液＝1∶8的配比量，與40℃溫水混合為懸浮液，充分混勻後，定量循環流加於上流式米根黴全細胞固定化反應器中，進行脫乙醯基反應，用電位滴定法動態檢測反應產物的DD值(脫乙醯度)，直至反應液樣本的DD值＞85％、黏度低於100×10-3Pa·s時，終止反應。
f.收集反應產物，按1/3容積減壓濃縮後，真空或冷凍乾燥，得高脫乙醯度、低黏度殼聚糖。
實施例3乳桿菌發酵製備甲殼低聚糖
a.預處理家蠶蛹10kg清洗除雜、破皮處理後，壓榨法擠出內容物，收集皮殼，烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍後，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體。
b.細粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔淨溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恆溫下，於反應釜內緩慢混合，間歇攪拌，進行共酶解脫脂脫蛋白反應，反應時間18h，反應終止後離心(2500r/min)進行固、液分離。
c.收集固體物料，40℃溫水洗3遍，瀝乾，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的採絨革蓋菌去菌體粗酶液進行酶法脫色，反應溫度40℃，反應時間18h，反應畢離心(2500r/min)，沉澱物洗滌、乾燥，得白色粉末狀甲殼素。
d.將甲殼素按固∶液＝1∶8的配比量，用40℃溫水重新懸浮，混勻後定量循環流加於上流式米根黴全細胞固定化反應器中，進行脫乙醯基反應，電位滴定法動態檢測反應產物的DD值(脫乙醯度)，直至反應液樣本的DD值＞70％，終止反應。
f.收集反應液，定容定濃度後作為碳源及反應底物，添加1％多價蛋白腖為氮源(可直接來自副產品蠶蛹蛋白及其水解產物)和少量無機鹽，按2％接種量接種本發明人誘導馴化、能夠以殼聚糖為營養物質的乳桿菌，厭氧深層液體發酵，直至菌體生物量至少達到＞1.0×109cfu/ml後，終止發酵，用特製菌體分離機去除菌體，發酵液直接濃縮，真空或冷凍乾燥，得固體半透明粉末狀、其中80％相對分子量＜3000的甲殼寡糖。
實施例4羧甲基甲殼素的製備a.預處理鮮蠅蛆10kg清洗除雜、破皮處理後，壓榨法擠出內容物，收集皮殼，烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍後，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體。
b.細粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔淨溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恆溫下於反應釜內進行共酶解脫脂脫蛋白反應，時間18h，反應終止後離心(2500r/min)進行固、液分離。
c.收集固體物料，40℃溫水洗3遍後瀝乾，先用5％H2O2煮沸1h，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的粗酶液進行酶法脫色，反應溫度40℃，反應時間18h，反應畢離心(3500r/min)，沉澱物洗滌、乾燥，得白色粉末狀甲殼素。
d.所獲甲殼素先加入10倍量的異丙醇中攪拌溶脹，瀝乾後再加入甲殼素質量約5倍的45％氫氧化鈉溶液，15℃以下持續浸泡3h，間歇攪拌，反應結束後濾去剩餘反應液，得約相當於甲殼素質量3倍的鹼性甲殼素膠體溶液；以1.2倍於甲殼素的質量比例稱取固體氯乙酸，分次加入該膠體溶液中，每次間隔數分鐘，加畢，提升溫度至70℃，反應3h，得可溶於水的羧甲基殼聚糖，加5倍蒸餾水溶解，冰醋酸調pH至7.0、抽濾後用70％乙醇洗滌、乾燥，得白色粉末狀羧甲基殼聚糖。
實施例5蠶蛹油脂的提取a.預處理家蠶蛹30kg清洗除雜、破皮處理後，壓榨法擠出內容物待用，皮殼烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍後，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體。
b.細粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔淨溫水以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恆溫下於反應釜內進行共酶解脫脂脫蛋白反應，時間18h，反應終止後離心(2500r/min)進行固、液分離。
c.固體用於甲殼素提取。收集富含脂質蛋白質的分離液體，減壓濃縮至1/4容積，與先前擠壓出的內容物混合，繼續濃縮至膏狀。
d.用浸出法進行油脂提取將上述濃縮物移入浸出罐，裝罐量85％，採用逆流浸泡式浸出工藝，以6號抽提溶劑油為浸出溶劑、罐組式(共3個罐)浸出方式進行油脂抽提，混合油放罐後，用98kPa蒸汽下壓、145kPa蒸汽上蒸，蒸脫蛹粕中殘留溶劑，檢測殘溶合格後，由出粕口排出脫脂蛹粕，繼續用於蛋白質提取。
e.對浸出所得的混合油進行蒸發、汽提，脫除混合油中的浸出溶劑以及易發揮組分，得蠶蛹毛油，控制毛油中溶劑殘留量＜0.05％，或閃點220℃。毛油可繼續精煉為精製蛹油。
實施例6蠅蛆蛋白的提取a.預處理蠅蛆20kg清洗除雜、破皮處理後，壓榨法擠出內容物待用，皮殼烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍後，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm(60-100目)的細粉體。
b.細粉體先用65℃熱水浸泡30min，傾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的潔淨溫水，以及等量容積的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恆溫下於反應釜內進行共酶解脫脂脫蛋白反應，時間18h，反應終止後離心(2500r/min)進行固、液分離。
c.固體用於甲殼素提取。收集富含脂質蛋白質的分離液體，減壓濃縮至1/4容積，與先前擠壓出的內容物混合，繼續濃縮至膏狀。
d.將蛆膏用3倍量的石油醚浸沒，60℃浸取4次，每次1h，浸畢離心(3500r/min，20min)進行固液分離。
e.分離的液態混合油用於蛆油提取。將固體沉澱的灰色脫脂蛆粕，加蒸餾水攪拌成勻漿，用0.25％NaOH溶解蛋白質，過濾去除固形物，濾液用HCL調pH至4.5，靜置3h，加入飽和硫酸銨溶液，靜置、離心，沉澱即為蛋白質，將此漿狀蛋白沉澱裝入透析袋，透析除鹽後用活性炭脫色，95％乙醇抽提，真空乾燥，得精製蛆蛋白粉。
權利要求
1.一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於包括以下步驟將蠶蛹、蠅蛆的皮殼通過幹法或溼法破碎細粉化處理；將得到的細粉體經來自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液進行共酶解反應，充分脫除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白質；用兩步法脫色，即先以H2O2初步脫色，再用富含過氧化氫合成-還原酶系的粗酶液進行酶法脫色並還原H2O2；收集脫色後物料，洗滌、乾燥後製成甲殼素產品；通過米根黴全細胞固定化生物反應器進行循環脫乙醯反應，得到不同DD值的殼聚糖。
2.根據權利要求1所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於進一步用產酸細菌進行液體深層發酵殼聚糖，獲得具有高度水溶性的甲殼寡糖。
3.根據權利要求1所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於進一步將甲殼素加工為鹼性甲殼素膠體溶液後，分別用環氧乙烷、氯乙酸或丙烯腈處理，分別生成羥乙基甲殼素、羧甲基甲殼素或氰乙基甲殼素。
4.根據權利要求1-3任一項所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於所述細粉化處理，是指如果是鮮蠶蛹或鮮蠅蛆，則清洗除雜、充分瀝水後先行機械破皮處理，用諸如液壓式或螺旋式壓榨機的壓榨法擠出內容物，收集皮殼，烘乾至水分＜10％，0℃以下預凍6小時，用離心式碰撞粉碎機將其粉碎至平均粒度為150-250μm的細粉體；若是幹蛹或幹蛆，則淨化後直接預凍、粉碎處理成細粉體。
5.根據權利要求1-3任一項所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於所述微生物粗酶液，是指用不同出發菌株誘導馴化而得的高產脂肪酶活的產朊假絲酵母(保藏號CCTCC NO.M207053)、高產蛋白酶活的枯草芽孢桿菌(保藏號CCTCC NO.M207028)、高產H2O2及其氧化-還原酶系的採絨革蓋菌(保藏號CCTCC NO.M207024)，分別經好氧液體深層發酵後，去除菌體而得到的胞外酶粗酶液。
6.根據權利要求1-3任一項所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於所述共酶解反應，是指將所獲細粉體以固∶液＝1∶5的配比量，先用65℃溫水浸泡30min，抑制雜菌及無關酶活，再加入與溫水容積等量的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液，在40℃恆溫下於反應釜內將皮殼粉混懸液和粗酶液緩慢混合，充分攪拌，進行共酶解脫脂、脫蛋白反應，反應時間18小時，反應終止後以2500r/min離心進行固、液分離。
7.根據權利要求1-3任一項所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於所述兩步法脫色，是指先將酶解反應後的固體物料，加入少量稀鹼中浸泡、煎煮2h，更換鹼液後重複3次，過濾收集濾渣，水洗3遍後，先用5％H2O2煮沸1小時，快速脫色，再用富含H2O2以及H2O2氧化-還原酶系的粗酶液進行酶解反應，脫除原料中難解離色素並陸續將H2O2轉化為無毒無害的CO2和H2O，反應溫度40℃，反應時間18h，反應畢離心分離，將沉澱洗滌、乾燥得白色粉末狀甲殼素。
8.根據權利要求1-3任一項所述的從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，其特徵在於所述脫乙醯反應，是指將所得甲殼素用40℃溫水懸浮、充分混勻後，循環流加於米根黴(保藏號CCTCC NO.M207054)全細胞固定化反應器中，進行脫乙醯基反應，根據產品和用途對脫乙醯度的要求，用電位滴定法動態檢測反應產物的DD值，直至達到所要求的DD值標準，終止反應，收集反應產物，按1/3容積濃縮後，真空或冷凍乾燥，得殼聚糖。
全文摘要
本發明公開了一種從蠶蛹、蠅蛆的皮殼中製取甲殼素/殼聚糖的方法，包括以下步驟將蠶蛹、蠅蛆的皮殼通過幹法或溼法破碎細粉化處理；將得到的細粉體經來自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液進行共酶解反應，充分脫除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白質；用兩步法脫色；收集脫色後物料，洗滌、乾燥後製成甲殼素產品；通過米根黴全細胞固定化生物反應器進行循環脫乙醯反應，得到殼聚糖；用產酸細菌進行液體深層發酵殼聚糖獲得高度水溶性的甲殼寡糖。本發明有益效果提高產品質量和生產效率、降低能耗，大幅減少酸、鹼、氧化劑和其它有害化學品的使用量以及廢液、廢渣的排放，並能同時生產出附加值高的副產品，綜合利用資源，提高生產效益。
文檔編號C12R1/125GK101078023SQ200710107079
公開日2007年11月28日 申請日期2007年5月18日 優先權日2007年5月18日
發明者吳力克 申請人:重慶百奧帝克微生態科技有限公司 被以下專利引用 (2),