一種抗菌肽Dermaseptin‑M及其應用的製作方法

2023-10-04 20:01:59

本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種抗菌肽Dermaseptin-M及其應用。

背景技術：

抗生素在養殖業中的濫用導致藥物在動物產品中殘留，已經嚴重影響食品安全，使細菌對抗生素產生耐藥性，並通過餐桌潛入人體，成為潛伏在人體內的隱形殺手。其危機是如果發生新的病種將面臨無藥可用的局面。越來越多的國家開始尋找抗生素的替代品，而抗菌肽以其獨特的生物活性和殺菌機製成為最具潛力的抗生素替代品之一。抗菌肽在食品、化妝品領域的應用也不斷加深，具有良好的發展前景。

抗菌肽（antibacterial peptides)是一類具有巨大發展潛力的新型抗菌藥物。抗菌肽是宿主產生的一類抵抗外界病原體感染的小分子陽離子肽，廣泛存在於昆蟲、植物、動物及人體內，具有非特異性抗細菌、真菌、病毒等病原體作用，還有抗腫瘤細胞作用，因此又稱為肽抗生素（peptide antibitics)。抗菌肽抗菌譜廣，對多重耐藥菌、腫瘤細胞、愛滋病毒有殺傷作用，甚至還可能有抗重症急性呼吸症候群（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒的作用。因此有著廣闊的開發應用前景，是目前國際學術研究的活躍領域之一。

技術實現要素：

本發明的目的旨在提供一種抗菌肽Dermaseptin-M及其應用。

為實現上述目的，本發明採取的技術方案如下：

一種抗菌肽Dermaseptin-M，其胺基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述抗菌肽Dermaseptin-M在製備抗菌肽製劑中的應用。

所述抗菌肽Dermaseptin-M在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和/或病毒感染疾病的藥物中的應用。

所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌或綠膿桿菌，所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌，所述病毒為豬繁殖與呼吸障礙症候群病毒。

有益效果：通過實驗證明本發明抗菌肽Dermaseptin-M不但對大腸桿菌，綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用，而且對病毒也有一定的滅活作用，穩定性好，抗菌活性強，具有高效廣譜抑菌作用，可以作為抗生素替代品使用。

附圖說明

圖1：發酵液中Dermaseptin-M蛋白純度鑑定結果；其中，M為蛋白maker，1，2，3，4均為樣品重複；

圖2：Dermaseptin-M蛋白質譜圖。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細說明，但本發明的保護範圍並不局限於此。

實施例1

本發明抗菌肽的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，具體為：

Ala-Ser-Trp-Met-Thr-Ser-Phe-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Thr-Pro-Thr-Lys-Thr-Thr-Leu-Asn-Thr-Val-Leu-Val-Gly-Thr-Asn-Ala。

序列特徵：序列為胺基酸序列，含有28個胺基酸殘基，鏈型為α螺旋直鏈多肽，分子量大小為 3405 .04Da ，等電點是10.25，疏水殘基46.42%。

本實施例抗菌肽是發明人在Dermaseptin基因基礎上通過胺基酸替代增強其多肽抗微生物能力，將改造後Dermaseptin-M基因轉入枯草芽孢桿菌，並通過枯草芽孢桿菌發酵而得；其具體步驟如下：

1. Dermaseptin-M序列合成

Dermaseptin-M是在Dermaseptin序列（如SEQ ID No.2所示）：

GCGTTGTGGATGACCTTGTTAAAAAAGGTTCTTAAAGCTGCCGCAAAGGCTGCGCTGAATGCAGTGTTGGTAGGTGCAAATGCT的基礎上，將第37、43、49、52、61、76位鹼基G變為A，其編碼胺基酸由丙氨酸變為蘇氨酸，第5、17位T變成C，其胺基酸由亮氨酸變成絲氨酸，即Dermaseptin-M序列為：

GCGTCGTGGATGACCTCGTTAAAAAAGGTTCTTAAAACTGCCACAAAGACTACGCTGAATACAGTGTTGGTAGGTACAAATGCT（如SEQ ID No.3所示）。替代後，其親水性增強，更易於表達。序列委託上海生工公司合成。

2. Dermaseptin-M序列整合入枯草芽孢桿菌

2.1 整合載體的構建

將Dermaseptin-M序列按照pUB110載體(購自BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心）克隆標準操作步驟連接到芽孢桿菌載體pUB110上，得到整合載體pUB110-DM。

2.2 枯草芽孢桿菌基因組的整合

將構建好的整合載體pUB110-DM用電轉化法轉化至Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）168 (購自BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心）感受態，操作步驟如下：

1. 以1：100的比例將10mL Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）168菌液（市購菌粉用無菌水稀釋而得）倒入1000mL LB液體培養基中，37℃、220rpm振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養；

2. 將菌液在冰上預冷30分鐘，隨後將菌液分裝到500mL 冰上預冷的離心杯中，4℃、2500rpm離心10分鐘；

3. 棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉澱懸浮後，再將水注滿離心杯，4℃、4000rpm離心10分鐘；

4. 棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌，冰上預冷；甘油與水的體積百分比，下同)，重懸菌體，再加滿10%甘油，4℃、4000rpm離心10min；

5. 棄上清，每個離心杯中加入5mL10%的甘油，使沉澱懸浮後，製得感受態；取100 μL感受態加0.01ng pUB110-DM直接電穿孔轉化，用0.05%（g/mL，下同）氯黴素抗性的LB固體培養基篩選陽性轉化子。

其中，LB液體培養基的配方：胰蛋白腖 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L；

LB固體培養基的配方：胰蛋白腖 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L、瓊脂15 g/L。

3 枯草芽孢桿菌優化表達

首先應用 Plackett-Burman 試驗設計方法，確定出轉速、接種量和總發酵時間為重要影響因素。通過最陡爬坡法接近最大響應面區域，利用 Box-Behnken 試驗設計，建立了以Dermaseptin-M蛋白含量為響應值的全變量二次回歸方程模型，最終得到枯草芽孢桿菌產蛋白酶的最優發酵條件為：

最佳培養基配方：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉10g，酵母粉8g，矽油1g，碳酸氫鈣0.5g，氯化鈣0.015g，硫酸銨1g，硫酸鎂0.15g，加水1000 mL，用碳酸氫鈉調節pH至7.0，於121℃條件下滅菌20 min。

最佳發酵條件如下：裝液量為500mL的三角瓶中裝100mL培養基，初始pH值為7.0，接種菌液量為2%（即每100ml液體培養基中加入2mL 濃度為1×108個/mL的枯草芽孢桿菌懸液，枯草芽孢桿菌懸液是指篩選所得陽性轉化子經肉湯培養基培養並調整菌落濃度而得)，培養溫度為35℃，搖床轉速200rpm，總發酵時間120h。

在搖床條件下，優化後此發酵液的Dermaseptin-M蛋白含量達974.96mg/mL。

鑑定：

（1）、將發酵液取樣進行SDS-PAGE鑑別其純度，結果顯示如圖1所示，發酵液中幾乎沒有雜蛋白片段，只有Dermaseptin-M蛋白，灰度掃描計算其純度為98.9%；

（2）將發酵液取樣送於上海中科新生命生物科技有限公司進行質譜鑑定，質譜結果見圖2，質譜分析見表1；PMF和MS/MS數據提交到MASCOT資料庫進行搜索，分類學檢索為Phyllomedusa sauvagii，結果顯示，該蛋白與Dermaseptin蛋白相似率為78.57%，即產生了6個突變。結合圖譜分析，該蛋白序列為 ：

Ala-Ser-Trp-Met-Thr-Ser-Phe-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Thr-Pro-Thr-Lys-Thr-Thr-Leu-Asn-Thr-Val-Leu-Val-Gly-Thr-Asn-Ala，與發明人預期結果完全一致，說明該蛋白在枯草芽孢桿菌內得到正確表達。

收集發酵液離心，5000rpm，取上清凍幹，得到淡黃色粉末狀成品即抗菌肽Dermaseptin-M，密封包裝，-20°保存可以保存兩年，4°可以保存6個月。

4. 發明產品抗菌肽Dermaseptin-M最小抑菌濃度（MIC)的測定

MIC實驗選擇大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌等臨床常見有害菌進行。分別將大腸桿菌（ATCC25922)、綠膿桿菌（ATCC18642)、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）用肉湯培養基37℃培養至對數期，然後用肉湯培養基稀釋至2.0×106 cfu/mL。在青黴素瓶中依次加入稀釋過的抗菌肽水溶液100μL（濃度為0.5、1、2、4、5、10、15、20mg/mL），向各瓶中加入已經稀釋好的菌液100 μL。混勻後置於37℃恆溫培養箱靜置培養18h，震蕩後測定各瓶菌液在600nm處的吸光度值，以100μg/mL氨苄青黴素水溶液作為陽性對照。其中，肉湯培養基的配方為：蛋白腖 10g/L，牛肉浸出粉 3g/L，氯化鈉5g/L。

結果判定：以檢測不到細菌生長的抗菌肽最小濃度孔作為其最小抑菌濃度，結果如表2所示。

表2可以看出，Dermaseptin-M對大腸桿菌，綠膿桿菌以及金黃色葡萄球菌等臨床常見細菌都有很強的抑制效果，其中對金黃色葡萄球菌效果最好，綠膿桿菌次之，具有較好的開發價值。

5. 本發明產品抗菌肽Dermaseptin-M體外抑制豬繁殖與呼吸障礙症候群病毒的活性

豬繁殖與呼吸障礙症候群病毒（PRRSV）是目前困擾養殖業的一大難題，豬群感染後引起豬的免疫抑制，導致免疫失敗，還會造成豬瘟、大腸桿菌病等多種疫病混合感染或者繼發感染。本發明抗菌肽對PRRSV在體外有一定的抑制作用。

本實驗中PRRSV採用HuN4 F112 株弱毒疫苗，購自哈爾濱維科生物技術有限公司，用生理鹽水將其病毒滴度稀釋至10-7 TCID50/mL，備用。

Marc-145購自中國獸醫藥品監察所，按如下步驟復甦培養：

1.細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min以上；

2.培養液（DMEM）、0.25％（g/g，下同)胰蛋白酶溶液恆溫水浴箱37℃預熱20min，備用；

3.從液氮保存罐中取出細胞凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化；

4.將融化後所得細胞懸液移入15mL離心管，緩慢加入4mL DMEM培養液，離心（1000r/min，5min）；

5.用DMEM培養液混懸沉澱細胞，置於37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每管細胞可以復甦2-3瓶。

48h後，將長滿細胞的培養瓶中原來的培養液棄去，加入0.5-1mL 0.25%的胰蛋白酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。放在倒置顯微鏡下觀察細胞，在原貼壁細胞逐漸趨於圓形，還未漂起時將胰酶棄去，加入10mL 含1v%小牛血清的DMEM培養液終止消化，用無菌吸管將貼壁細胞吹打成懸液。

5.1 Dermaseptin-M對Marc145細胞最大無毒濃度的測定

將Marc-145細胞懸液接種於96孔板中，每孔0.1mL，每孔接種細胞個數2.5×104。每孔加10v%小牛血清DMEM培養液100μL，置於37℃、5% CO2培養箱中培養，12h後觀察細胞貼壁生產情況。將Dermaseptin-M用DMEM培養液稀釋，濃度分別為0.5、1、2、4、8、16mg/L，待細胞貼壁後，每孔加DMEM稀釋的Dermaseptin-M 100μL。每4個小時觀察一次，判定各孔存活細胞的增殖代謝情況及細胞毒性反應，不產生細胞病變的藥物最大濃度視為最大無毒劑量。培養96h，測得抗菌肽 Dermaseptin-M對Marc-145細胞的最大安全濃度為8mg/L。即當抗菌肽 Dermaseptin-M濃度大於8mg/L時，Marc-145細胞會產生病變。

5.2 體外抗病毒試驗

將Marc-145細胞懸液接種於96孔板中，每孔0.1mL，每孔接種細胞個數2.5×104，置於37℃、5% CO2培養箱中培養，48h後細胞形成單層開始進行體外抗病毒試驗。

試驗分正常細胞對照組（不接種病毒）、PRRSV對照組（只接種PRRSV 0.1mL，不加藥物）、藥物（替米考星）對照組（20mg/L，用DMEM稀釋）和抗菌肽Dermaseptin-M（DM）組（2、4、6mg/L，DMEM液稀釋）。試驗採用同時感染的方式進行：將PRRSV病毒液用不含血清的DMEM細胞培養基稀釋100倍後取100μL，與100μL藥物對照組/DM組處理液在37℃、5% CO2培養箱中作用2h後感染Marc-145細胞，檢測本發明抗菌肽對PRRSV的直接滅活作用。

試驗採用96孔細胞培養板進行，每個處理重複10次，當PRRSV對照組感染陽性率達75%、正常細胞對照組正常時進行MTT染色，用酶標儀測490nm處吸光度值OD490nm。分別計算細胞存活率和DM對PRRSV的抑制率。

細胞存活率=（實驗組OD490nm/正常細胞對照組OD490nm）×100%；

抑制率=（實驗組OD490nm－PRRSV對照組OD490nm）/PRRSV對照組OD490nm×100%；

抗菌肽Dermaseptin-M對PRRSV抗性結果如表3所示。

表3可以看出，3個不同濃度的DM與PRRSV直接作用後再作用於Marc-145細胞，結果與PRRSV對照組相比，各組的OD490nm顯著升高（P＜0.05），各組細胞存活率和對PRRSV的抑制率分別為61.93%、75.29%、85.80%和31.71%、60.12%、82.48%，即三個不同濃度的Dermaseptin-M都有抑制PRRSV的作用，各個濃度間的抑制效應差異顯著。Dermaseptin-M在高濃度時的吸光度值、細胞存活率和對PRRSV的抑制率均稍低於替米考星對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。說明Dermaseptin-M體外可以直接滅活PRRSV，且滅活效果與藥物替米考星相當。

綜上，本發明抗菌肽Dermaseptin-M不僅對畜禽常見致病菌有顯著的抑制作用，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有較好的效果，抗菌譜廣，而且對PRRSV也有一定的滅活作用，所以本發明抗菌肽具有極大的應用潛力，在製備抗菌抗病毒藥物中能夠得到廣泛的應用。

SEQUENCE LISTING

河南牧翔動物藥業有限公司

河南牧翔科技有限公司

一種抗菌肽Dermaseptin-M及其應用

3

PatentIn version 3.4

1

28

PRT

人工序列

1

Ala Ser Trp Met Thr Ser Phe Lys Lys Val Leu Lys Thr Pro Thr Lys

1 5 10 15

Thr Thr Leu Asn Thr Val Leu Val Gly Thr Asn Ala

20 25

2

84

DNA

未知

2

gcgttgtgga tgaccttgtt aaaaaaggtt cttaaagctg ccgcaaaggc tgcgctgaat 60

gcagtgttgg taggtgcaaa tgct 84

3

84

DNA

人工序列

3

gcgtcgtgga tgacctcgtt aaaaaaggtt cttaaaactg ccacaaagac tacgctgaat 60

acagtgttgg taggtacaaa tgct 84