Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體基因的標籤單核苷酸多態性位點及其組成的單體型的製作方法
2023-10-05 09:28:14
專利名稱：Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體基因的標籤單核苷酸多態性位點及其組成的單體型的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種I型血管緊張素II受體(angiotensin II type I receptor，AGTR1)基因標籤單核苷酸多態性位點及其檢測方法和應用。本發明還涉及由AGTR1基因標籤單核苷酸多態性位點組成的單體型及其檢測方法和應用。
背景技術：
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是由於動脈粥樣硬化造成的冠狀動脈管腔狹窄，從而使冠狀動脈供血不足並導致心肌缺血，從而引起各種臨床症狀，簡稱冠心病。該病如果是心肌暫時性缺血，會引起心絞痛；如果是冠狀動脈被凝血塊堵塞，或發生神經性痙攣，血液不能流通，這就是心肌梗塞。心肌梗塞(myocardial infarction)通常表現為冠狀動脈閉塞，血流中斷，部分心肌因嚴重的持久性缺血而發生局部壞死。臨床上有劇烈而較持久的胸骨後疼痛、發熱、白細胞增多、紅細胞沉降率加快、血清心肌酶活力增高及進行性心電圖變化，可發生心律失常、休克或心力衰竭。目前，在西方國家急性心肌梗塞是發病率最高和最致命的疾病，1999年世界7個主要製藥市場國家(美國、法國、德國、義大利、西班牙、英國和日本)有1700多萬人患急性心肌梗塞，其中1/4死亡。僅在美國每年發生約80萬例心肌梗塞。到2009年估計在上述7個國家中心肌梗塞人數將上升至200萬人。我國每年急性心肌梗塞病人數約為110萬人。年齡在40-74歲的人群心肌梗塞粗年發病率124.7/10萬；死亡率58.4/10萬。儘管我國急性心肌梗塞的發病率和死亡率低於多數發達國家，但上升速度很快，患者和死亡的絕對人數巨大。疾病監測和死因統計顯示，今後20年在我國及世界範圍內急性心肌梗塞的死亡率和發病率仍將呈上升趨勢。
心肌梗塞的發生具有明顯的遺傳傾向，同時又受到環境因素的密切影響，因此它是典型的多因子疾病。從基礎到臨床，人們對此進行了大量的研究，並在心肌梗塞的危險因素和心肌梗塞發生的病理生理學方面積累了大量的知識，但是對於心肌梗塞發生的遺傳基礎的分析仍未取得重大突破。而從遺傳學的角度來解釋、預防、和/或診斷心肌梗塞是目前需要解決的首要問題。
血管緊張素II(Ang II)是腎素-血管緊張素系統(RAS)的一個重要產物，在血壓調節和心血管系統中有著重要作用。位於細胞表面的I型Ang II受體(AGTR1)介導了Ang II幾乎所有的心血管效應，包括血管和心肌收縮、垂體激素和醛固酮分泌、水鈉重吸收及細胞增殖肥大等。血管平滑肌細胞、心肌及腎臟等器官都有廣泛的AGTR1存在。AGTR1基因位於常染色體3q21-3q25，全長約45kb，由5個外顯子組成，其中第5個外顯子編碼全部359個胺基酸，其表達蛋白屬於G蛋白耦連受體家族，具有7個跨膜親水區結構。AGTR1基因的GenBank序列號(Gene TACTTCTTTAAATTTATTTTTATTGATACACAATAGATGTACACTTTTTAGGTACATGCAATAATTTAATGCCCCTCACTATAAATTCGGAGCTGCCTCCTCGCCGATGATTCCAGCGCCTGACAGCCAGGACCCCAGGCAGCAGCGAGTGACAGGACTTTTTAGGTACATGCAATAATTTAATGCATTCATAT
-3』(SEQ ID NO25)2.10208A/G上遊引物 5』CAGCAGTTTTCTTTAATGTGTCAcC 3』(25bp)(SEQ ID NO26)下遊引物 5』AGAACACTGCTCAAAGGAATCA 3』(22bp)(SEQ ID NO27)錯配鹼基 5』------G-＞c------3』限制性內切酶 HpaIIPCR擴增序列 282bp5』- TGGGGAGAGCGCAAAAACCCACACACACCATTATCTTGTGAAAGAAGTAGAGGAAGCAGAAAATAATGAAATCCCAGTGTTACCACATCCCCTCCAATATACAGATTAAGAGCGTTTGTATTTATATGGTTTTAAACATAAATAACATCAGAATTACTAAGCTATTTCCATTCATGTACTGATAATGAATCATGTGAGAAAGTCCTTTGGCAAGGACTCCACATGGCCACAGG -3』(SEQ ID NO28)3.32091A/G上遊引物 5』CCCAATgTCTCTTACCCAAATTTGaT 3(26bp)(SEQ ID NO29)下遊引物 5』TCTGGAAAATGATGATAATAATA 3』(23bp)(SEQ ID NO30)錯配鹼基 5』------T-＞g---C-＞a------3』限制性內切酶 BclIPCR擴增序列 239bp5』- CAGGGAAAAAAATAAATTAAATTAGCCATTTACACCACAGTGTGAACTTAATAACACCAACAAAAGTTCCAAAGCTCTAGGGTCTCATAGCACCTCCAGATCCATGATCTCATTCGGTGTTTCCAACAATGTTTTGCACCAAACTGGACACATGCTTGCTACTTCATCATCCTCATCGTGAACATTAT -3』(SEQ ID NO31)4.Leu191Leu上遊引物 5』CAAAGTCACCTGCATCATCA 3』(20bp)(SEQ ID NO32)下遊引物 5』AGGAAACAGGAAACCCAGTAT 3』(21bp)(SEQ ID NO33)錯配鹼基 5』--------3』限制性內切酶 Hpy188IPCR擴增序列 187bp5』- TTTGGCTGCTGGCAGGCTTGGCCAGTTTGCCAGCTATAATCCATCGAAATGTATTTTTCATTGAGAACACCAATATTACAGTTTGTGCTTTCCATTATGAGTCCCAAAATTCAACCCTTCCGATAGGGCTGGGCCTGACCAAAAAT -3』(SEQ ID NO34)5.44323A/C上遊引物 5』CAGCACTTCACTACCAAATagGC 3』(23bp)(SEQ ID NO35)下遊引物 5』GGAGATTGCATTTCTGTCAGTA 3』(22bp)(SEQ ID NO36)錯配鹼基 5』------G-＞a---A-＞g------3』限制性內切酶 HaeIIIPCR擴增序列 236bp5』- TTAGCTACTTTTCAGAATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGACTGAACCGACTTTTCTAAAGCTCTGAACAAAAGCTTTTCTTTCCTTTTGCAACAAGACAAAGCAAAGCCACATTTTGCATTAGACAGATGACGGCTGCTCGAAGAACAATGTCAGAAACTCGATGAATGTGTTGATTTGAGAATTT -3』(SEQ ID NO37)6.45035A/G上遊引物5』AAAAGTATATATTCTACACAcATAT 3』(25bp)(SEQ ID NO38)下遊引物 5』TCATTCAAGGTAGTCTTATT 3』(20bp)(SEQ ID NO39)錯配鹼基 5』------T-＞c------3』；限制性內切酶 NdeIPCR擴增序列 180bp5』- TATATGTATATCTATATCTCTAAACTGCTGTTAATTGATTAAAATCTGGCAAAGTTATATTTACTTTAAAATAAAATAATTTTATTGCAATGTATTTATCTTCATTACTTAAAATAGATGCTAATTTATTTTAAAATAA -3』(SEQ ID NO40)上述擴增序列中，帶有底紋的核苷酸序列為引物序列；帶有下劃線的核苷酸序列為限制性酶切識別位點；小寫字母的核苷酸序列為錯配鹼基；斜體核苷酸為SNP突變。
AGTR1基因6個tSNPs的酶切電泳結果分別見
圖18-23。在酶切電泳結果中，DNA標記使用DL2000，從小到大片斷分別為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。
(1)-1106A/T多態基因分型PCR反應體系見上。在96孔PCR自動循環儀9700(美國PE公司)上進行PCR反應，PCR循環參數95℃預變性5分鐘，經94℃45秒，56℃30秒，72℃40秒，循環35周後於72℃延伸7分鐘。PCR產物選用DraI限制性內切酶(Takara公司，日本)，酶切識別序列TTT*AAA(*代表酶切位置，下劃線表示突變位點)，酶切條件參見廠家操作手冊。酶切體系(15μl)DraI酶10U、Buffer1.5μl、ddH2O2.8μl、PCR產物10μl，37℃過夜。
結果當SNP為A等位基因，234鹼基長的PCR產物被切割為31和203兩個片斷；若為T等位基因，則PCR產物不被切割。如圖18所示，1、2和8泳道產生234和203兩種片斷，所以為A/T雜合子；3、4、5和6泳道只產生203片斷，所以為AA純合子；7泳道只產生234片斷，所以為TT純合子。(注切割下的31bp片斷因為較小，未能顯示在圖上)(2)10208A/G多態基因分型PCR反應體系見上。在96孔PCR自動循環儀9700(美國PE公司)上進行PCR反應，PCR循環參數95℃預變性5分鐘，經94℃45秒，61℃30秒，72℃40秒，循環30周後於72℃延伸7分鐘。PCR產物選用HpaII限制性內切酶(MBI公司，加拿大)，酶切識別序列C*CGG(*代表酶切位置，下劃線表示突變位點)，酶切條件參見廠家操作手冊。酶切體系(15μl)HpaII酶10U、Buffer1.5μl、ddH2O2.5μl、PCR產物10μl，37℃過夜。
結果當SNP為G等位基因，282鹼基長的PCR產物被切割為24和258兩個片斷；若為A等位基因，則PCR產物不被切割。如圖19所示，1、2、3和6泳道產生282和258兩種片斷，所以為A/G雜合子；4泳道只產生258片斷，所以為GG純合子；5、7和8泳道只產生282片斷，所以為AA純合子。(注切割下的24bp片斷因為較小，未能顯示在圖上)(3)32091A/G多態基因分型PCR反應體系見上。在96孔PCR自動循環儀9700(美國PE公司)上進行PCR反應，PCR循環參數95℃預變性5分鐘，經94℃45秒，56℃30秒，72℃40秒，循環30周後於72℃延伸7分鐘。PCR產物選用BclI限制性內切酶(MBI公司，加拿大)，酶切識別序列T*GATCA(*代表酶切位置，下劃線表示突變位點)，酶切條件參見廠家操作手冊。酶切體系(15μl)BclI酶8U、Buffer1.5μl、ddH2O2.7μl、PCR產物10μl，55℃過夜。
結果當SNP為A等位基因，239鹼基長的PCR產物被切割為23和216兩個片斷；若為G等位基因，則PCR產物不被切割。如圖20所示，1和7泳道產生239和216兩種片斷，所以為A/G雜合子；2-6和8泳道只產生216片斷，所以為AA純合子。本圖沒有GG純合子帶型。(注切割下的23bp片斷因為較小，未能顯示在圖上)(4)Leu191Leu(43730T/C)多態基因分型PCR反應體系見上。在96孔PCR自動循環儀9700(美國PE公司)上進行PCR反應，PCR循環參數95℃預變性5分鐘，經94℃45秒，60℃30秒，72℃40秒，循環35周後於72℃延伸7分鐘。PCR產物選用Hpy188I限制性內切酶(NEB公司，美國)，酶切識別序列TCN*GA(*代表酶切位置，下劃線表示突變位點，N表示任意鹼基)，酶切條件參見廠家操作手冊。酶切體系(15μl)Hpy188I酶8U、Buffer1.5μl、ddH2O2.7μl、PCR產物10μl，37℃過夜。
結果當SNP為T等位基因，187鹼基長的PCR產物被切割為141和46兩個片斷；若為C等位基因，則PCR產物不被切割。如圖21所示，1、2、4、5、6和8泳道產生187和141兩種片斷，所以為T/C雜合子；3泳道只產生141片斷，所以為TT純合子。7泳道只產生187片斷，所以為CC純合子。(注切割下的46bp片斷因為較小，未能顯示在圖上)(5)44323A/C多態基因分型PCR反應體系見上。在96孔PCR自動循環儀9700(美國PE公司)上進行PCR反應，PCR循環參數95℃預變性5分鐘，經94℃45秒，56℃30秒，72℃40秒，循環30周後於72℃延伸7分鐘。PCR產物選用HaeIII限制性內切酶(MBI公司，加拿大)，酶切識別序列GG*CC(*代表酶切位置，下劃線表示突變位點)，酶切條件參見廠家操作手冊。酶切體系(15μl)Haem酶10U、Buffer1.5μl、ddH2O2.5μl、PCR產物10μl，37℃過夜。
結果當SNP為C等位基因，236鹼基長的PCR產物被切割為22和213兩個片斷；若為A等位基因，則PCR產物不被切割。如圖22所示，3泳道產生236和213兩種片斷，所以為A/C雜合子；1、2和4-8泳道只產生236片斷，所以為AA純合子。本圖沒有CC純合子帶型。(注切割下的22bp片斷因為較小，未能顯示在圖上)(6)45035A/G多態基因分型PCR反應體系見上。在96孔PCR自動循環儀9700(美國PE公司)上進行PCR反應，PCR循環參數95℃預變性5分鐘，經94℃45秒，48℃30秒，72℃40秒，循環30周後於72℃延伸7分鐘。PCR產物選用Nde限制性內切酶(Takara公司，日本)，酶切識別序列CA*TATG(*代表酶切位置，下劃線表示突變位點，N表示任意鹼基)，酶切條件參見廠家操作手冊。酶切體系(15μl)Hpy188I酶8U、Buffer1.5μl、ddH2O2.5μl、PCR產物10μl，37℃過夜。
結果當SNP為G等位基因，180鹼基長的PCR產物被切割為22和158兩個片斷；若為A等位基因，則PCR產物不被切割。如圖23所示，3泳道產生180和158兩種片斷，所以為A/G雜合子；2和4-8泳道只產生180片斷，所以為AA純合子。1泳道只產生158片斷，所以為GG純合子。(注切割下的22bp片斷因為較小，未能顯示在圖上)。
實施例2中國漢族男性人群中AGTR1基因tSNPs和心肌梗塞的相關性1、病例對照樣本特徵描述具體見實施例1。
2、AGTR1基因tSNPs在病例對照樣本中的頻率分布-1106A/T多態T等位基因頻率病例組顯著高於對照組，10208A/G多態A等位基因頻率病例組顯著高於對照組，45035A/G基因型分布在病例組和對照組有顯著差異，其餘多態基因型分布和等位基因頻率在病例組和對照組均沒有顯著差異。見表8。
表8 AGTR1基因tSNPs在病例對照樣本中的頻率分布
NS無統計學意義3、AGTR1基因tSNPs組成的單體型-1106A/T、10208A/G、32091A/G、Leu191Leu、44323A/C和45035A/G等6個tSNPs組成的常見單體型(頻率＞3％)見表9。其中Leu191Leu是在第43730位的T/C多態。單體型中各個位點的順序與這些位點在染色體上的順序一致。
4、AGTR1基因tSNPs單體型與心肌梗塞的關係應用haplo.score程序(Schaid等人，2001，http//www.mayo.edu/hsr/people/schaid.html)，校正年齡、BMI、高血壓、吸菸、飲酒、甘油三酯、高密度脂蛋白和血糖後，單體型A-G-A-T-A-A與心肌梗塞顯著相關，並具有明顯的保護作用(P＝0.0064)。見表9。
表9校正環境因素後，AGTR1基因tSNPs單體型和心肌梗塞相關性的score檢驗
*含義分別為對應於-1106A/T、10208A/G、32091A/G、Leu191Leu、44323A/C和45035A/G多態性位點的單個核苷酸。例如，對於單體型Hap1，A-G-A-T-A-A的含義為在-1106A/T、10208A/G、32091A/G、Leu191Leu、44323A/C和45035A/G位點的單核苷酸分別為A、G、A、T、A、A，其餘類推。
5、提高心肌梗塞患病危險的AGTR1基因tSNPs單體型應用haplo.glm程序(Lake等人，2003，http//www.mayo.edu/hsr/people/schaid.html)，校正年齡、BMI、高血壓、吸菸、飲酒、甘油三酯、高密度脂蛋白和血糖後，與單體型A-G-A-T-A-A(Hap1)相比，攜帶單體型A-A-A-T-A-A(Hap6)、T-A-G-C-A-A(Hap7)和A-A-A-C-A-G(Hap8)個體忠心肌梗塞的危險顯著升高(OR值分別為1.33、1.75和2.64)。見表10。可以發現，Hap6-8在第10208位鹼基均為A等位基因，隨著-1106T、43730C和45035G等位基因的依次出現，個體患心肌梗塞的危險逐漸升高，提示這些位點之間具有協同作用。見表10。
表10 AGTR1基因tSNPs單體型對於心肌梗塞的相對危險性
*單體型含義分別為對應於-1106A/T、10208A/G、32091A/G、Leu191Leu、44323A/C和45035A/G多態性位點的單個核苷酸。
6、結論根據上述研究，本發明發現了與心肌梗塞相關的6個重要AGTR1基因變異位點-1106A/T、10208A/G、32091A/G、Leu191Leu(43730T/C)、44323A/C和45035A/G。這6個位點的特定組合，大大增加了個體罹患心肌梗塞的風險。這一發現在臨床上具有潛在的應用價值對AGTR1基因的這6個位點進行基因型鑑定，若是發現某個體攜帶A-A-A-T-A-A、T-A-G-C-A-A或A-A-A-C-A-G單體型，則該個體與攜帶A-G-A-T-A-A單體型的個體相比，患心肌梗塞的風險顯著升高。尤其是攜帶-1106A 10208A 32019A 43730C 44323A 45035G構象的單體型的個體患心肌梗塞的概率大大增加，風險增至2.64倍。據此，醫生可以指導該個體改變不良生活習慣，降低環境因素對疾病的誘發。可見，AGTR1基因標籤SNP組成的單體型在心肌梗塞的預測和預防中有重要的應用前景。
序列表110中國醫學科學院阜外心血管病醫院北京諾賽基因組研究中心有限公司120AGTR1基因標籤單核苷酸多態性位點及其組成的單體型130D0404011F16040170PatentIn version 3.121012111914212DNA213智人4001cgttgtcttc cgttattatg tgtgatatta gttaagtttt tcataaataa acttcacagt 60ttgaggaagt tcctattcct agtttgttga gtgttagcat gaaaaagtgt tgaattttgt 120ccaatagttt ttaaaaattt ttttagacaa tcatgtaggc tttgtccatt ttttacttct 180ttaaatttat ttttattgat acacaataga tgtacacttt ttaggtacat gcaataattt 240aatgcccctc actataaatt cggagctgcc tcctcgccga tgattccagc gcctgacagc 300caggacccca ggcagcagcg agtgacagga ctttttaggt acatgcaata atttaatgca 360ttcatataaa gatcaaatca gtgcaattgg catatccatc accttaaata tttgtctttt 420cttcatgcta gaaacattca agttattttc tcctagctac tctgaaatat acaatagatt 480actgtaaact acagtcaccc tactcaccta tctaacatta attgattttt ggtaaactaa 540tctaatcttg ctttctggca tcaacctcac ttgaccatgg tgtatagtcc ctttcatatg 600ttattggatt caatttgcct acattttgtt gagaattttt atctatactc ttaagaaata 660ttgatctgta gtctcgtgat gtctttatct ggttttgtta tcagggtgat actggcctca 720tagcatgagt tgggagatca tccttactct tctatttttt ggaagagttt gtgaagaatt 780gatattattt cttctttaaa tatttattgg gtttttaaaa tacattttta aaatgcaact 840tgggtagcat gtccaatagg aacaaatgag tgtccaccct tgaatttcat aaccctggaa 900ttaatccatg taatctatga tccacaactg tattaccaaa gttcgagtta ctcataggaa 960agagaaagaa gttctctaat tcgtccttaa aagttttcca agttcagaaa aaaaaaatgt 1020tgaagaacac gaatctccgc aggaaatgat actcctgtac ccccagctcg ctctccctca 1080cgacccctcg ctaggcgggg ttcgggacca ggtgaacgct gatctgatag ttgacacggg 1140acgactgtgg catcatcctt gctgccgtca atatcccgag agggaggagg ttgggccggg 1200agggtctccc ggggcggggc ggaggaggag ggaatgcaaa acagagcctc gtccccggaa 1260cccaagaagc agcaacgccc ctcactataa attcggagct gcctcctcgc caatgattcc 1320agcgcctgac agccaggacc ccaggcagca gcgagtgaca ggacgtctgg accggcgcgc 1380cgctagcagc tctgccgggc cgcggcggtg atcgatgggg agcggctgga gcggacccag 1440cgagtgaggg cgcacagccg ggacgccgag gcggcgggcg ggagacccgc accagcgcag 1500ccggccctcg gcgggacgtg acgcagcgcc cggggcgcgg gtgagtccgc gcggaccgcc 1560aggcatgctt gggggacttc aagggcgggg tgctaagttt catgtcacgg tgtcctaact 1620gctggctcta tactgggaag ctctcgggga ccaaggaaag agcgaccgta gttctggtca 1680gcgcctgccc ctggagctgg ccacactttc ccaaatcagg tgaggggctt ctggaatggg 1740agggaacaag gtaggtttgt ttgccacgtg cctcgaaatt ctcaatccat tttaaccaaa 1800ctcttccgag tgcaaggaag aaatctacag aaataagatg caattcaata aactttcttc 1860ctgaggcttt tagttaactc ttgtatttta gccatcatct gagcgggaag ccgg 1914
2102211531212DNA213智人4002aagaaatggc taggaatgag actgcactat tttaccctaa aacgttcttt ttctctttgc 60ctaatgtata tctacaaggg cattggggaa gatgttgacc acaggcagga agatgatgag 120atcctgtgcc caccacttaa tgcagtctag ctctatataa ggaaaaatat gttcttgatg 180tgaaccagat ggtttcactc ccttcaaaaa cactcttaag atgcagtgtg gaagcttact 240ctgtaaatta aaaaataaaa acctgactat attcagtgga atgcgttaat catttttttc 300tttttaggtt tgatatttga caaattgatc taaaatggct gggtttttat ctgaataact 360cactgatgcc atcccagaaa gtcggcacca ggtaaatgcc ttacatctac agcagtgggt 420ctgtcagcag ttttctttaa tgtgtcagca gtggggagag cgcaaaaacc cacacacacc 480attatcttgt gaaagaagta gaggaagcag aaaataatga aatcccagtg t 5312103211548212DNA213智人4003ccccttgctg gtactttagt ttcttccact tctagcacca cgtgtagttt cccaatttct 60cttacccaaa tttgctcgca gggaaaaaaa taaattaaat tagccattta caccacagtg 120tgaacttaat aacaccaaca aaagttccaa agctctaggg tctcatagca cctccagatc 180catgatctca ttcggtgttt ccaacaatgt tttgcaccaa actggacaca tgcttgctac 240ttcatcatcc tcatcgtgaa cattattatt attatcatca ttttccagat gaagaaaatg 300aatcacaagt caactgacag tccaaaggct ccacagctca gaggaggtaa atcatgtgct 360taattcagaa cttttggctc ccatcactat gctcttccca ctgtcttaac tctggttgtc 420acctgagcca ttgtgtttct tctcaggtag atcttagttc ttcctgagaa ggtatgaagg 480tgggtattcc accctacctg aattatagga atttcagata tctgtgagca gctgcaaagg 540ggatttta 5482104211599212DNA213智人4004aaggcaaaga gaccacttaa gaactccttc acatgtgtta tgtcttaaaa gctgactact 60ggagttgtat cccttgcaca gcatcccttt gcaccaaagt gaacactact ctaagaacat 120gtgttcagct ctcctgaatg ccaagcacaa ccatgcttgg catggcagtg gtgtcttatt 180tctgctcctc tttttcccca gggcatgcca ttgcaagaga atgctcagcc atgttcatct 240ggggacctgc tcctggtaga gcaataggat ctgtgtgccc agcaccactg cccacctagc 300tgtcctggcc tgtgcccaat gctgaccttc acctcagagt gtggctgtac cacattcggt 360gatgtcactc tcactgaacc ttcagcctcc ttcctgggac ttcctgatgg actgttatcc 420agggcagaat gtgttgattt tctaaatcac ataaatgaat agcttgactg ttgattatgt 480agaaaatcag agcaaatatt tgcatggctt tgtgcagccc attcttgagc atctgattct 540ccccagaatt ctaaaaaacc tgctgctttc tcaagccctc agtaaagaca tgctttctt 5992105
2112551212DNA213智人4005gctttcttag gctttatcag ttcacagtgt ttccttaaga aatatgatcc agtatttttt60cctaagacta aagttgagtt actacgttta tgactgagaa atgaatgttt gttagtttgt120ttgtttacaa taagaatttt ttctttacca ttttattttt attttcccca ggtgtatttg180atatagtgtt tgcaacaaat tcgacccagg tgatcaaaat gattctcaac tcttctactg240aagatggtat taaaagaatc caagatgatt gtcccaaagc tggaaggcat aattacatat300ttgtcatgat tcctacttta tacagtatca tctttgtggt gggaatattt ggaaacagct360tggtggtgat agtcatttac ttttatatga agctgaagac tgtggccagt gtttttcttt420tgaatttagc actggctgac ttatgctttt tactgacttt gccactatgg gctgtctaca480cagctatgga ataccgctgg ccctttggca attacctatg taagattgct tcagccagcg540tcagtttcaa cctgtacgct agtgtgtttc tactcacgtg tctcagcatt gatcgatacc600tggctattgt tcacccaatg aagtcccgcc ttcgacgcac aatgcttgta gccaaagtca660cctgcatcat catttggctg ctggcaggct tggccagttt gccagctata atccatcgaa720atgtattttt cattgagaac accaatatta cagtttgtgc tttccattat gagtcccaaa780attcaaccct cccgataggg ctgggcctga ccaaaaatat actgggtttc ctgtttcctt840ttctgatcat tcttacaagt tatactctta tttggaaggc cctaaagaag gcttatgaaa900ttcagaagaa caaaccaaga aatgatgata tttttaagat aattatggca attgtgcttt960tctttttctt ttcctggatt ccccaccaaa tattcacttt tctggatgta ttgattcaac1020taggcatcat acgtgactgt agaattgcag atattgtgga cacggccatg cctatcacca1080tttgtatagc ttattttaac aattgcctga atcctctttt ttatggcttt ctggggaaaa1140aatttaaaag atattttctc cagcttctaa aatatattcc cccaaaagcc aaatcccact1200caaacctttc aacaaaaatg agcacgcttt cctaccgccc ctcagataat gtaagctcat1260ccaccaagaa gcctgcacca tgttttgagg ttgagtgaca tgttcgaaac ctgtccataa1320agtaattttg tgaaagaagg agcaagagaa cattcctctg cagcacttca ctaccaaatg1380agcattagct acttttcaga attgaaggag aaaatgcatt atgtggactg aaccgacttt1440tctaaagctc tgaacaaaag cttttctttc cttttgcaac aagacaaagc aaagccacat1500tttgcattag acagatgacg gctgctcgaa gaacaatgtc agaaactcga tgaatgtgtt1560gatttgagaa attttactga cagaaatgca atctccctag cctgcttttg tcctgttatt1620ttttatttcc acataaaggt atttagaata tattaaatcg ttagaggagc aacaggagat1680gagagttcca gattgttctg tccagtttcc aaagggcagt aaagttttcg tgccggtttt1740cagctattag caactgtgct acacttgcac ctggtactgc acattttgta caaagatatg1800ctaagcagta gtcgtcaagt tgcagatctt tttgtgaaat tcaacctgtg tcttataggt1860ttccactgcc aaaacaatgc ccgtaagatg gcttatttgt ataatggtgt tactaaagtc1920acatataaaa gttaaactac ttgtaaaggt gctgcactgg tcccaagtag tagtgtcttc1980ctagtatatt agtttgattt aatatctgag aagtgtatat agtttgtggt aaaaagatta2040tatatcataa agtatgcctt cctgtttaaa aaaagtatat attctacaca tatatgtata2100tgtatatcta tatctctaaa ctgctgttaa ttgattaaaa tctggcaaag ttatatttac2160tttaaaataa aataatttta ttgcaatgta tttatcttca ttacttaaaa tagatgctaa2220tttattttaa aataagacta ccttgaatga gtatgaatat atttttattt aaattttgat2280acaactgata gtttaatact attggttata gattttttat cctgacattg aaaagttaaa2340gaaaaaacat tttgttctac tgcatgtcat ggaataaaca catcgttttg aatttttcag2400tttttcacat aacaaagaaa aaaattaact cttgctataa tgctagaata atacattatt2460ttacaagtaa tttaataaca gaatttttct aattgtatac attatcattg taggaaagtt2520agaagatata gaataacata aaaataaaag t 2551210621122212DNA
213人工序列220
223測序引物4006cgttgtcttc cgttattatg tg 22210721123212DNA213人工序列220
223測序引物4007tttcctatga gtaactcgaa ctt 23210821123212DNA213人工序列220
223測序引物4008tgtccaccct tgaatttcat aac 23210921121212DNA213人工序列220
223測序引物4009gaacgccttg cagagtcata c 212101021121212DNA213人工序列220
223測序引物40010aagaaatggc taggaatgag a 21
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223測序引物40011atattggagg ggatgtggta a 212101221118212DNA213人工序列220
223測序引物40012ccccttgctg gtacttta 182101321120212DNA213人工序列220
223測序引物40013ccagcaggat gtcatctagt 202101421120212DNA213人工序列220
223測序引物40014gaaggcaaag agaccactta 202101521123212DNA213人工序列220
223測序引物
40015aataggtttg gctaggatta tca 232101621122212DNA213人工序列220
223測序引物40016gctttcttag gctttatcag tt 222101721121212DNA213人工序列220
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223測序引物40019attgcttcag ccagcgtcag t 212102021121212DNA213人工序列
220
223測序引物40020ttccccacca aatattcact t 212102121121212DNA213人工序列220
223測序引物40021cagatgacgg ctgctcgaag a 212102221121212DNA213人工序列220
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223擴增引物40023tgtaggcttt gtccattttt 202102421120212DNA213人工序列220
223擴增引物40024attgcactga tttgatcttt 2021025211234
212DNA213
40025tgtaggcttt gtccattttt tacttcttta aatttatttt tattgataca caatagatgt60acacttttta ggtacatgca ataatttaat gcccctcact ataaattcgg agctgcctcc120tcgccgatga ttccagcgcc tgacagccag gaccccaggc agcagcgagt gacaggactt180tttaggtaca tgcaataatt taatgcattc atataaagat caaatcagtg caat 2342102621125212DNA213人工序列220
223擴增引物40026cagcagtttt ctttaatgtg tcacc 252102721122212DNA213人工序列220
223擴增引物40027agaacactgc tcaaaggaat ca 2221028211282212DNA213
40028cagcagtttt ctttaatgtg tcaccggtgg ggagagcgca aaaacccaca cacaccatta60tcttgtgaaa gaagtagagg aagcagaaaa taatgaaatc ccagtgttac cacatcccct120ccaatataca gattaagagc gtttgtattt atatggtttt aaacataaat aacatcagaa180ttactaagct atttccattc atgtactgat aatgaatcat gtgagaaagt cctttggcaa240ggactccaca tggccacagg tgattccttt gagcagtgtt ct 2822102921126212DNA213人工序列220
223擴增引物40029
cccaatgtct cttacccaaa tttgat 262103021123212DNA213人工序列220
223擴增引物40030tctggaaaat gatgataata ata 2321031211239212DNA213
40031cccaatgtct cttacccaaa tttgatcaca gggaaaaaaa taaattaaat tagccattta60caccacagtg tgaacttaat aacaccaaca aaagttccaa agctctaggg tctcatagca120cctccagatc catgatctca ttcggtgttt ccaacaatgt tttgcaccaa actggacaca180tgcttgctac ttcatcatcc tcatcgtgaa cattattatt attatcatca ttttccaga 2392103221120212DNA213人工序列220
223擴增引物40032caaagtcacc tgcatcatca202103321121212DNA213人工序列220
223擴增引物40033aggaaacagg aaacccagta t 2121034211187212DNA213
40034
caaagtcacc tgcatcatca tttggctgct ggcaggcttg gccagtttgc cagctataat60ccatcgaaat gtatttttca ttgagaacac caatattaca gtttgtgctt tccattatga120gtcccaaaat tcaacccttc cgatagggct gggcctgacc aaaaatatac tgggtttcct180gtttcct 1872103521123212DNA213人工序列220
223擴增引物40035cagcact tca ctaccaaata ggc 232103621122212DNA213人工序列220
223擴增引物40036ggagattgca tttctgtcag ta 2221037211236212DNA213
40037cagcacttca ctaccaaata ggccttagct acttttcaga attgaaggag aaaatgcatt60atgtggactg aaccgacttt tctaaagctc tgaacaaaag cttttctttc cttttgcaac120aagacaaagc aaagccacat tttgcattag acagatgacg gctgctcgaa gaacaatgtc180agaaactcga tgaatgtgtt gatttgagaa attttactga cagaaatgca atctcc2362103821125212DNA213人工序列220
223擴增引物40038aaaagtatat attctacaca catat 252103921120212DNA
213人工序列220
223擴增引物40039tcattcaagg tagtcttatt2021040211180212DNA213
40040aaaagtatat attctacaca catatgtata tgtatatcta tatctctaaa ctgctgttaa60ttgattaaaa tctggcaaag ttatatttac tttaaaataa aataatttta ttgcaatgta120tttatcttca ttacttaaaa tagatgctaa tttattttaa aataagacta ccttgaatga180
權利要求
1.一種AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點，該位點分別為AGTR1基因的-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G單核苷酸位點。
2.一種由權利要求1所述的AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點組成的AGTR1基因保護性單體型，該單體型在-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G位點的單核苷酸分別為A、G、A、T、A、A。
3.一種由權利要求1所述的AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點組成的AGTR1基因危險性單體型，該單體型在-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G位點的單核苷酸分別為A、A、A、T、A、A；T、A、G、C、A、A或A、A、A、C、A、G。
4.一種檢測如權利要求1所述AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點的方法，該方法為聚合酶鏈式反應與限制性片斷長度多態性分析相結合或聚合酶鏈式反應與直接測序法相結合。
5.一種檢測AGTR1基因保護性單體型或危險性單體型的方法，該方法包括檢測AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點。
6.如權利要求5所述的檢測AGTR1基因保護性單體型或危險性單體型方法，該方法還包括對所述標籤單核苷酸多態性位點的檢測結果進行統計分析。
7.一種體外檢測心肌梗塞相關基因的方法，該方法包括檢測AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G。
8.一種體外檢測待測樣品中是否含有AGTR1基因的保護性單體型或危險性單體型的方法，該方法包括1)提取待測樣品的DNA，針對AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G設計引物進行PCR擴增；2)對所述全部PCR產物進行分析；3)鑑定由-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G位點的單核苷酸多態構成的單體型是否為A-G-A-T-A-A、A-A-A-T-A-A、T-A-G-C-A-A或A-A-A-C-A-G。
9.一種體外預測待測個體患心肌梗塞的危險性的方法，該方法包括體外檢測來自待測個體的樣品中AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點-1106A/T、10208A/G、32091A/G、43730T/C、44323A/C和45035A/G，其中攜帶由上述位點的單核苷酸組成的單體型A-A-A-T-A-A、T-A-G-C-A-A或A-A-A-C-A-G的個體患心肌梗塞的危險性比攜帶單體型A-G-A-T-A-A的個體患心肌梗塞的危險性顯著升高。
10.一種檢測AGTR1基因的標籤單核苷酸多態性位點的多態性的試劑盒，試劑盒分別含有1)擴增-1106A/T位點、10208A/G位點、32091A/G位點、43730T/C位點、44323A/C位點和/或45035A/G位點的引物；2)PCR擴增酶及相應緩衝液；3)檢測-1106A/T、10208A/G位點、32091A/G位點、43730T/C位點、44323A/C位點和/或45035A/G位點的位點多態的試劑。
全文摘要
本發明涉及一種I型血管緊張素II受體(angiotensin II type I receptor，AGTR1)基因標籤單核苷酸多態性位點及其檢測方法和應用。本發明還涉及由AGTR1基因標籤單核苷酸多態性位點組成的單體型及其檢測方法和應用。本發明的AGTR1基因標籤單核苷酸多態性位點組成的單體型在心肌梗塞的預防和/或診斷中有重要的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1712545SQ20041004968
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月23日 優先權日2004年6月23日
發明者顧東風, 宿少勇, 陳劍虹, 李宏帆 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院, 北京諾賽基因組研究中心有限公司