檢測調鈣素水平的elisa試劑盒及方法
2023-10-05 10:03:19 1
專利名稱：檢測調鈣素水平的elisa試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢測試劑，特別是一種檢測肝損傷患者血清中調鈣素水平的ELISA試劑盒及方法。
背景技術：
肝炎是嚴重威脅我國廣大人民群眾健康的最主要傳染病之一。肝炎是各種原因損傷肝臟的共同後果，尤以各種病毒性感染、藥物性損傷、酒精性損傷等因素多見。在我國，肝臟炎症又以HBV感染所致炎症為主。HBV和HCV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌，是重要的疾病死亡原因之一。目前，臨床上廣泛應用的肝臟炎症血清學指標主要是谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉 氨酶(AST)。然而，在長期的臨床實踐中，醫生發現血清轉氨酶水平與肝臟炎症程度常常不一致，具有很大的局限性。臨床醫生常需要對患者進行肝活檢病理組織學檢查，來確定肝臟炎症的真實情況。肝活檢是確診肝臟炎性損傷性質和程度的金標準，但其為創傷性檢查，價格昂貴，患者不願接受，並且由於難以重複進行，不適合作為診斷和療效判斷的常規手段。因此，臨床上迫切需要其他更靈敏準確的血清學指標來進行輔助診斷，彌補轉氨酶的不足。1978年，Yamaguchi等人發現在肝臟組織中存在一種鈣離子結合蛋白，通過調節細胞內的Ca2+信號傳導物來調節肝細胞的功能，命名為調鈣素(regucalcin)。1992年，Fujita等人用二維電泳的方法檢測大鼠肝可溶性蛋白與年齡的關係時發現了一種新的蛋白，其表達可以獨立減少衰老細胞中雄激素的合成，其分子量在30KD左右，故命名為衰老標誌蛋白 30(Senescence Marker Protein-30, SMP30)。1993 年，Shimokawa N和 Yamaguchi報導了一種編碼蛋白質的cDNA，證實調鈣素與SMP30為同一種蛋白。在生理情況下，調鈣素mRNA主要在肝臟細胞和腎皮質細胞中大量表達，在心臟、腦、骨骼和一些其他組織細胞中也有少量表達。在肝臟，調鈣素大量存在於肝細胞胞漿，佔肝臟可溶性蛋白總量的2%。調鈣素可以在多種組織細胞的胞漿和胞核發揮重要生理作用。除了調節細胞內鈣穩態，還具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白絲氨酸和(或)蘇氨酸磷酸酶的作用，從而影響蛋白質磷酸化、去磷酸化這一重要的修飾過程。此外，調鈣素還具有抑制細胞增殖的作用。2010年，Chakraborti首次測定了調鈣素的晶體結構，證實人類調鈣素蛋白的一級晶體結構上只有一個金屬離子結合位點，可以結合二價離子包括Zn2+、Ca2+、Mn2+或Mg2+，該晶體結構本身更傾向於結合Zn2+，增強酶活性；在外界作用條件下，調鈣素蛋白可能會結合更多Ca2+從而促進鈣聚集。調鈣素基因及其蛋白質表達異常參與了多種疾病的發病過程，如高血壓病、腎臟病等。由於調鈣素能夠釋放入血，其血清學水平可能在一定程度上反映肝組織的損傷。但具體如何反映尚不清楚，血清中調鈣素水平的變化與肝組織學表達的關係還需要進一步研究。臨床上廣泛應用的肝臟炎症血清學指標主要是谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉氨酶(AST)，它們也是判斷療效的主要指標。此外，對於HBV感染者，ALT和AST同時也是最常用的抗病毒治療的指徵。然而，在長期的臨床實踐中，醫生發現血清轉氨酶水平與肝臟炎症程度常常不一致。在轉氨酶正常的慢性無症狀HBV感染者中，肝組織完全正常的僅佔極少數，大約90%左右的感染者有不同程度的肝組織炎症及纖維化。在重型肝炎患者中，常常出現「酶膽分離」現象，即總膽紅素越來越高，而ALT和AST則趨於下降，因此轉氨酶更不能準確反映重型肝炎肝損傷的程度。綜上所述，ALT和AST作為目前主要的肝臟炎症指標，其意義具有很大的局限性。基於這一點共識，臨床醫生常常需要對患者進行肝活檢病理組織學檢查，來確定肝臟炎症的真實情況。肝活檢是確診肝臟炎性損傷性質和程度的金標準，但其為創傷性檢查，價格昂貴，患者不願接受，並且由於難以重複進行，不適合作為診斷和療效判斷的常規手段。因此，臨床上迫切需要其他更靈敏準確的血清學指標來進行輔助診斷，彌補轉氨酶的不足。調鈣素在反應肝細胞損傷方面具有一定的臨床意義，但是由於國內外尚沒有檢測血清調鈣素的試劑盒，極大地限制了對其臨床意義的研究。目前有關該標誌物與肝細胞損傷之間的關係仍然缺乏系統的對照研究，其表達水平與肝臟組織學的炎症程度相關性研究也極少，對重型肝炎的一項研究僅進行了 4例血清學WB檢測。顯然，評價調鈣素的臨床意 義急需標準規範的試劑盒。為此，我們初步設計此實驗試圖尋找到一種ELISA檢測方法，並通過此法檢測血清中調鈣素水平，探索調鈣素對於肝損傷的臨床意義，以及調鈣素與肝損傷其他各血清學指標之間的相關性，以期能夠更好地幫助我們明確肝臟炎症損傷的程度，從而對肝病患者的炎症損傷作出明確診斷。
發明內容
本發明基於上述領域的需求，提供一種用於檢測血清中調鈣素水平的方法及試劑盒，該方法及試劑盒檢測調鈣素靈敏且特異，為本領域研究人員對調鈣素與肝損傷之間關係的研究提供了便利的工具和方法。分泌抗調鈣素蛋白18號單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞DC091，保藏號為CGMCCNo. 6509。抗調鈣素蛋白的18號單克隆抗體，其特徵在於由小鼠雜交瘤細胞DC091分泌。一種檢測調鈣素水平的ELISA試劑盒，包括酶標板，其特徵在於所述酶標板微孔內包被有含上述18號單克隆抗體的包被液。包被液中所述18號單克隆抗體的濃度為5ug/ml。所述ELISA試劑盒還包括封閉液、酶標二抗、底物顯色液、終止液。一種檢測調鈣素水平的ELISA方法，其特徵在於，酶聯免疫反應中的第一抗體為上述18號單克隆抗體。所述ELISA方法中，酶標二抗的工作稀釋倍數為I :20000。所述第一抗體製備成為包被液包被於酶標板的微孔中，所述包被液中18號單克隆抗體的濃度為5ug/ml。本發明中，發明人獲得了分泌抗抗調鈣素蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。基於該單克隆抗體以及雙夾心酶聯免疫反應原理，發明人進一步提供了一種檢測肝損傷患者血清的調鈣素水平的方法和試劑盒。試驗數據表明，該單克隆抗體用於檢測調鈣素，靈敏度可達到Pg / ml的水平，與其它蛋白無交叉反應，可用於特異性檢測調鈣素。
本發明基於同樣的原理和獲得的單克隆抗體，還提供了檢測調鈣素水平的試劑盒，試劑盒的主要組成組件為酶標板，酶標板上包被有本發明獲得的18號單克隆抗體。生物保藏信息保藏號CGMCCNo. 6509 生物材料名稱小鼠雜交瘤細胞DC091保藏日期2012年9月6日保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號
圖I.不同調鈣素濃度與OD值相關性。縱坐標為OD值，橫坐標為調鈣素濃度，單位pg/ml。
具體實施例方式下面通過具體試驗數據說明本發明的技術方案。實施例I調鈣素抗體的製備和驗證I. I單克隆抗體的製備小鼠雜交瘤細胞DC091是經過選擇性培養、篩選以及鑑定後的能夠分泌特異性抗體對抗天然調鈣素蛋白的雜交瘤細胞株。選用小鼠腹腔接種法，即將雜交瘤細胞接種至小鼠腹腔，在雜交瘤細胞生長的同時滲出大量腹水，腹水中便含有抗體。具體操作過程如下選取BALb-C小鼠進行腹腔注射石蠟油誘導，O. 5ml/只；10_14天後，將雜交瘤細胞培養至5X IO5 IO6個細胞/毫升，在小鼠腹腔進行雜交瘤接種，O. 5ml/只；10-14天後小鼠腹腔有腹水滲出，根據鼠的健康狀況可一次殺鼠取腹水，或間隔數日抽取腹水幾次。採水量的多少及採水時間應根據鼠的大小及健康狀況決定。將抽取的腹水離心去除沉澱，留取上清，所得上清液中含有大量單克隆抗體。I. 2多克隆抗體的製備調鈣素蛋白本所按照《分子克隆實驗指南(第三版)》中公開的原核蛋白表達方法製備而得。將調鈣素蛋白(北京市肝病研究所)經過弗氏抗原佐劑乳化後注入紐西蘭大耳白兔進行免疫，從而獲得多抗。具體操作如下將調鈣素蛋白(北京市肝病研究所)經過弗氏抗原佐劑乳化後注入紐西蘭大耳白兔，Img/只，4周後再次注射，並在注射後的7-10天收集血液，將血液轉移至塑料離心管中，4° C離心，收集上清液即為抗血清，獲得兔抗人多克隆抗體。通過ELISA方法檢測抗體效價。I. 3調I丐素單克隆抗體和多克隆抗體的Western Blot驗證本發明通過對肝組織或者肝癌細胞系提取蛋白後，再用本發明的抗體與市售抗體(Rabbit-anti-Rat Regucalcin antibody,產自 Cosmo Bio 公司)分別作為一抗進行Western Blot 實驗。
觀察結果是否能夠分別檢測出同一蛋白來進行驗證；同時製備肝組織石蠟切片進行免疫組織化學染色，以及利用肝癌細胞HepG2細胞製作細胞爬片進行免疫細胞化學染色來進一步對單抗及多抗進行驗證。結果顯示通過選取2份肝組織標本 (I份組織標本為重型肝炎患者肝組織，另I份為肝硬化患者肝組織)及人肝癌細胞系HepG2細胞系提取的蛋白進行Westernblot實驗,證實自製單抗及多抗與市售多抗均在34KD附近檢測到陽性條帶。採用免疫細胞化學染色檢測調鈣素蛋白在人肝癌細胞系HepG2細胞中的表達，結果表明，調鈣素在肝細胞胞漿和胞核內均有表達，特別是處於分裂期的細胞核，表達量最聞。實施例2血清調鈣素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立2. I自製調鈣素單克隆抗體、多克隆抗體和酶標二抗的ELISA鑑定2. I. I測定調鈣素蛋白濃度將存置-20°C冰箱的調鈣素蛋白取出並待其融解，混勻，用PBS稀釋液進行稀釋，取比色杯分別編號標記0，I (O為對照，I為所測蛋白)，編號O杯加入PBS稀釋液3ml，編號I杯加入所測蛋白O. 5ml及2. 5ml PBS稀釋液，分光光度儀調至波長280nm處進行檢測，測得0D,計算濃度公式濃度=0. 625 X ODX稀釋倍數,單位mg/ml。按照前述實驗方法,用分光光度儀，在波長280nm條件下檢測，分別將調鈣素蛋白、單克隆抗體及多克隆抗體稀釋50倍、6倍及6倍，通過公式計算得出調鈣素蛋白濃度為2. 0625mg/ml ;18號單克隆抗體(為雜交瘤細胞DC091所分泌)濃度為26mg/ml ;多克隆抗體的濃度為15. 446mg/ml。2. I. 296孔板包被調鈣素(I)包被用調鈣素蛋白包被酶標板，包被濃度為I μ g/ml, 100 μ I/孔，4°C過夜或37 °C 2小時後，洗滌液洗板3次。(2)封閉加150 μ I/孔或加滿/孔封閉液，4°C過夜或37°C 2小時後，洗滌液洗板3次，拍幹。置4°C冰箱保存備用。2. I. 3單抗的ELISA鑑定及效價測定(I)加待測樣品倍比稀釋後的單抗，100μ I/孔，加樣到抗原包被好的酶標板中，同時，37°C孵育lh，洗板6次，拍幹。(2)加二抗加入稀釋的羊抗兔HRP酶標二抗(購自鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，其原液濃度為I. Omg/ml, 100 μ I/孔，37°C孵育30min，洗滌液洗板6次，拍幹。(3)顯色加入底物顯色液A、B液(購自鼎國昌盛生物技術有限責任公司)各80μ I/孔，37°C顯色15分鐘。(4)終止加入終止液(購自鼎國昌盛生物技術有限責任公司)80 μ I/孔，用酶標儀450nm波長測定OD值。(5)讀數以450nm單波長測定各孔OD值。以與陰性對照孔OD值的比值(P/N)大於2. I為限作為陽性或確定效價的臨界點。調鈣素的18號單克隆抗體的ELISA效價可達為I :409. 6萬，結果如表I所示表IELISA方法測定18號單抗效價
權利要求
1.分泌抗調鈣素蛋白18號單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞DC091，保藏號為CGMCCNo. 6509。
2.抗調鈣素蛋白的18號單克隆抗體，其特徵在於由權利要求I所述雜交瘤細胞分泌。
3.含有權利要求2所述的18號單克隆抗體的溶液。
4.一種檢測調鈣素水平的ELISA試劑盒，包括酶標板，其特徵在於所述酶標板微孔內包被有權利要求2所述的18號單克隆抗體。
5.根據權利要求4所述的ELISA試劑盒，其特徵在於包被的所述18號單克隆抗體溶於包被液中，濃度為5ug/ml。
6.根據權利要求4 5任一所述的ELISA試劑盒，其特徵在於還包括封閉液、酶標二抗、底物顯色液、終止液。
7.一種檢測調鈣素水平的ELISA方法，其特徵在於酶聯免疫反應中的第一抗體為權利要求2所述的18號單克隆抗體。
8.根據權利要求7所述的ELISA方法，其特徵在於羊抗兔HRP酶標二抗的工作稀釋倍數為I : 20000。
9.根據權利要求7所述的ELISA方法，其特徵在於所述第一抗體製備成為包被液包被於酶標板的微孔中，所述包被液中所述18號單克隆抗體的濃度為5ug/ml。
全文摘要
本發明「檢測調鈣素水平的ELISA試劑盒及方法」，涉及醫學檢測試劑。特別涉及抗調鈣素蛋白的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細胞CGMCC No.6509。基於該單克隆抗體與酶聯免疫反應原理建立起來的檢測調鈣素水平的ELISA試劑盒及方法。利用本發明的試劑盒可以檢測血清中調鈣素水平，探索調鈣素對於肝損傷的臨床意義，以及調鈣素與肝損傷其他各血清學指標之間的相關性，以期能夠更好地幫助我們明確肝臟炎症損傷的程度，從而對肝病患者的炎症損傷作出明確診斷。
文檔編號G01N33/68GK102901829SQ201210339650
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者張晶, 李莉, 謝立, 趙鵬, 韋新煥 申請人:首都醫科大學附屬北京佑安醫院